消腫方對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細胞OPG及RANKL mRNA表達的影響

李　亮，劉安平，周正新，周章武，徐盛文，李文華

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，安徽 合肥　230031)

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消腫方對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細胞OPG及RANKL mRNA表達的影響

李亮，劉安平，周正新，周章武，徐盛文，李文華

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，安徽 合肥230031)

[摘要]目的觀察消腫方對骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細胞骨保護素(osteoprotegerin，OPG)及核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)mRNA表達的影響。方法將30只新西蘭大耳白兔隨機分為空白對照組，模型組，消腫方低、中、高劑量組，每組6只。采用改良Hulth法復(fù)制膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，消腫方低、中、高劑量組分別給予40、80、160 g/kg消腫方煎劑灌胃，空白對照組和模型組分別以等容積生理鹽水灌胃，共28 d。光鏡下觀察兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨下骨成骨細胞形態(tài)，采用RT-PCR法檢測OPG、RANKL mRNA的表達。結(jié)果空白對照組與模型組OPG mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；消腫方高、中、低劑量組OPG mRNA表達水平均較模型組顯著升高(P<0.05)，具有明顯的劑量依賴性。模型組RANKL mRNA表達水平低于空白對照組，消腫方低、中、高劑量組RANKL mRNA表達水平較模型組逐漸降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；消腫方高劑量組RANKL mRNA表達水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。結(jié)論消腫方可上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎動物模型軟骨下骨成骨細胞OPG mRNA表達，下調(diào)RANKL mRNA表達。

[關(guān)鍵詞]消腫方；骨關(guān)節(jié)炎；補腎活血利水法；成骨細胞；骨保護素；RANKL

消腫方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科國家級名老中醫(yī)丁鍔教授的經(jīng)驗方，以補腎活血利水為主，對骨關(guān)節(jié)炎具有較好的療效[1]。前期研究顯示，補腎活血利水法可促進軟骨細胞增殖，抑制骨細胞凋亡，調(diào)控滑膜組織基因表達譜，其作用機制與多種細胞信號通路有關(guān)[2]。其中骨保護素/核因子-κB受體活化因子配體(osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-kappa-B ligand，OPG/RANKL)通路對骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨重建的調(diào)控作用已成為研究熱點之一[3]。本研究通過復(fù)制兔骨關(guān)節(jié)炎動物模型，觀察不同濃度消腫方對骨關(guān)節(jié)炎動物的軟骨下骨成骨細胞OPG及RANKL mRNA表達的影響，以探究消腫方治療骨關(guān)節(jié)炎的機制。

1材料

1.1實驗動物7月齡新西蘭大耳白兔30只，體質(zhì)量2.6～3.2 kg，雌雄各半，購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，普通級。

1.2實驗藥物與試劑OPG、RANKL多克隆抗體：武漢博士德試劑公司；實時定量PCR擴增儀：美國Roche公司；TRIzol試劑：美國Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國Qiagen公司；DNA marker：北京天為時代公司；引物：上海滬晶生物芯片公司。

消腫方(茯苓皮20 g，懷牛膝、黃芪各15 g，當(dāng)歸、萆薢各10 g，莪術(shù)8 g，等)生藥飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，制備成不同濃度的水煎劑。

1.3儀器石蠟切片機：Leica2135；BM-Ⅱ型病理組織包埋機：安徽省電子科學(xué)研究所；ZT-RP生物組織脫水機、QP切片漂烘溫控儀：湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；Nikon80熒光顯微鏡：新飛達光學(xué)儀器公司。

2方法

2.1動物模型復(fù)制及分組將30只新西蘭大耳白兔隨機分為5組：空白對照組，模型組，消腫方低劑量(40 g/kg，相當(dāng)于臨床劑量3倍)、中劑量(80 g/kg)、高劑量(160 g/kg)組，每組6只。除空白對照組外，其余各組動物采用改良Hulth法[4]復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型。3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg靜脈注射麻醉，麻醉生效后，常規(guī)無菌操作、鋪巾，取兔膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)髕旁入路，切開皮膚及皮下組織、內(nèi)側(cè)支持帶及關(guān)節(jié)囊后，將髕骨向外側(cè)脫位，顯露膝關(guān)節(jié)腔，顯露內(nèi)側(cè)半月板及前交叉韌帶，依次切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，切斷前交叉韌帶，再逐層關(guān)閉關(guān)節(jié)囊、皮下組織、皮膚，敷料包扎切口，不予外固定，復(fù)制模型后連續(xù)4 d用青霉素3萬U肌肉注射，10 d后開始每天強迫兔活動40 min，連續(xù)6周。對消腫方低、中、高劑量組兔分別灌胃給予40、80、160 g/kg消腫方煎劑，對空白對照組和模型組兔灌胃給予生理鹽水，連續(xù)28 d。

2.2膝關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)學(xué)觀察在相對無菌條件下于膝關(guān)節(jié)負重區(qū)用骨刀垂直于股骨髁關(guān)節(jié)面切取骨軟骨組織塊，并去除關(guān)節(jié)軟骨周圍的軟組織及骨組織，磷酸鹽緩沖液漂洗，用無水乙醇固定，脫鈣處理，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細胞。

2.3軟骨下骨成骨細胞總RNA提取及測定采用TRIzol一步法，按產(chǎn)品操作說明提取軟骨下骨成骨細胞總RNA。采用紫外分光光度計測定總RNA的光密度(optical density，OD)，計算OD260/OD280比值，測定其濃度和純度。RNA完整性的檢測采用普通瓊脂糖凝膠電泳法，提取的總RNA于-70 ℃保存。

2.4兔軟骨下骨成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達采用RT-PCR法，以β-actin基因為內(nèi)參。OPG反應(yīng)條件[5]：95 ℃高溫變性1 min，54 ℃降溫退火40 s，71 ℃升溫延伸1 min，共30個循環(huán)，最后71 ℃升溫延伸7 min。RANKL反應(yīng)條件：95 ℃高溫變性1 min，54 ℃降溫退火40 s，71 ℃升溫延伸1 min，共30個循環(huán)，最后71 ℃升溫延伸7 min。引物序列：OPG上游引物：5′-TGTGGCCATGCGTTCTAGTCACCT-3′，下游引物：5′-TAGGGACCCAAGCCTTGCATCGGA-3′，擴增長度為478 bp；RANKL上游引物：5′-TTCCTCGAACTCAGTGCGAGAG-3′，下游引物：5′-CCGACCTGAGGTAATTCGCGTC-3′，擴增長度為449 bp；β-actin上游引物：5′-GAAGGCAGACGTTCAACACGGC-3′，下游引物：5′-GTGGCCATCTCACTTGCTGCAACAG-3′，擴增長度為310 bp。以15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳并拍照，對條帶的OD值進行檢測，計算條帶OD值與β-actin OD值的比值。

3結(jié)果

3.1兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)學(xué)變化空白對照組兔關(guān)節(jié)軟骨厚度正常，關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)正常，排列均勻(見圖1A)；模型組兔關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄，關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)不規(guī)則，排列較散亂(見圖1B)；各治療組可見關(guān)節(jié)軟骨厚度明顯改善，關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)不規(guī)則，排列散亂，隨治療藥物劑量增加，軟骨細胞數(shù)量增加(見圖1C—1E)。

圖1各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)(HE染色，10×40倍)

3.2兔軟骨下骨成骨細胞總RNA質(zhì)量鑒定提取軟骨下骨成骨細胞的總RNA，經(jīng)分光光度計分別在260 nm和280 nm波長測定OD值，計算OD260/OD280比值，所有樣品總RNA的OD260/OD280比值均在1.80～2.10之間。經(jīng)普通瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果提示RNA未被降解。

3.3各組兔軟骨下骨成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達比較空白對照組與模型組OPG、RANKL mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；消腫方高、中、低劑量組OPG mRNA表達水平均較模型組顯著升高(P<0.05)，RANKL mRNA表達水平均較空白對照組顯著降低(P<0.05)；隨著消腫方劑量升高，OPG mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，RANKL mRNA表達水平逐漸降低，其中消腫方高劑量組RANKL mRNA表達水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖2、表1。

注：1. Marker；2. 空白對照組；3. 模型組；4. 消腫方低劑量組；5. 消腫方中劑量組；6. 消腫方高劑量組。

表1　各組兔軟骨下骨成骨細胞OPG、RANKL mRNA相對表達水平比較

注：同列含有相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P>0.05；同列不含相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P<0.05。

4討論

有研究[6]表明，OPG/RANKL系統(tǒng)是破骨細胞與成骨細胞之間發(fā)生互相作用的信號通道，OPG最初于1997年被兩個獨立的實驗室同時發(fā)現(xiàn)。RANKL分子由317個氨基酸組成，有一個細胞外結(jié)構(gòu)域(其中包含一個配基結(jié)合位點)、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個N端胞漿結(jié)構(gòu)域組成，可由T、B淋巴細胞、骨髓干細胞、成骨細胞前體細胞以及成熟的成骨細胞等分泌。

最近研究[7]發(fā)現(xiàn)，成骨細胞能產(chǎn)生巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)和RANKL，能夠與位于破骨細胞前體上的受體相結(jié)合，從而能刺激破骨細胞的增殖和分化，并能增加破骨細胞活力；而成骨細胞則能產(chǎn)生一種名為OPG的蛋白，與RANKL相結(jié)合，從而阻止RANKL與破骨細胞的相互作用。RANKL和OPG的平衡對于骨破壞速度起著關(guān)鍵性的作用。在雌激素缺乏的人群中，其體內(nèi)RANKL水平增加[8]，當(dāng)RANKL水平過高或者OPG水平不足，將會引起骨丟失，但血液中RANKL和OPG的含量測量結(jié)果卻不支持該理論。在骨折及低骨量患者中，OPG水平升高，RANKL水平降低[9-10]。有關(guān)大鼠骨關(guān)節(jié)炎動物實驗表明，關(guān)節(jié)軟骨退變程度增加時，RANKL及runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcripttion factor，RUNX)、MCSF、血管內(nèi)皮生長因子等多種物質(zhì)顯著增加，而OPG的表達卻降低[11]。

骨關(guān)節(jié)炎相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)“痹證”，其為本虛標(biāo)實之病。腎主骨、主水，腎虛則骨關(guān)節(jié)失養(yǎng)、水無所主，可致局部腫脹；外傷或勞損可致局部氣血運行不暢，形成瘀血，則出現(xiàn)疼痛。故本病以肝腎虧虛為本，氣滯血瘀、筋脈痹阻為標(biāo)，通過中藥內(nèi)服外用以補肝腎、強筋骨、疏經(jīng)絡(luò)，達到標(biāo)本兼治的目的[12]。消腫方重用牛膝以補肝腎、強筋骨、利水祛濕、活血化瘀、引血下行，用于痹痛日久、腰膝酸痛等癥，為君藥；茯苓健脾利水、滲濕消腫，黃芪健脾補中益氣，為治療氣虛水腫之要藥，兩者合為臣藥；莪術(shù)行氣破血、消積止痛，偏于行氣通絡(luò)止痛，用于痰濕阻滯所致的肢體關(guān)節(jié)疼痛；萆薢利水滲濕、祛風(fēng)除痹、通絡(luò)止痛，善治腰膝痹痛、筋脈屈伸不利，兩藥同為佐使藥。全方配伍，共奏補腎利水、活血化瘀之功，對痰、瘀、水互阻所致的骨關(guān)節(jié)炎能起較好的治療作用。本研究結(jié)果表明，消腫方中藥煎劑可顯著提高骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細胞OPG mRNA的表達水平，同時可降低成骨細胞RANKL mRNA的表達水平。由此可見，消腫方可能通過上調(diào)OPG mRNA的表達和下調(diào)RANKL mRNA的表達，抑制破骨細胞的活化，從而抑制破骨細胞的骨吸收功能。

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Effects of Detumescence Prescription on mRNA Expression of Osteoprotegerin and Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B Ligand in Subchondral Bone Osteoblasts in Rabbits with Osteoarthritis

LILiang,LIUAn-ping,ZHOUZheng-xin,ZHOUZhang-wu,XUSheng-wen,LIWen-hua

(DepartmentofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of detumescence prescription on the mRNA expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) in subchondral bone osteoblasts in the rabbit model of osteoarthritis. MethodsThirty New Zealand big-eared white rabbits were randomly and equally divided into blank control group, model group, and low-, middle-, and high-dose detumescence prescription groups. A model of knee osteoarthritis was established with the modified Hulth method. The low-, middle, and high-dose detumescence prescription groups received decoction of detumescence prescription (40, 80, and 160 g/kg, respectively) by gavage, while the blank control group and model group received an equal volume of normal saline by gavage. The course of treatment was 28 d for each group. The morphology of subchondral bone osteoblasts of the knee joint was observed under a light microscope. The mRNA expression of OPG and RANKL was measured by RT-PCR.ResultsThere was no significant difference in OPG mRNA expression between the blank control group and the model group (P>0.05); the high-, middle-, and low-dose detumescence prescription groups had significantly increased OPG mRNA expression compared with the model group (P<0.05), showing a significant dose dependence. The model group had lower RANKL mRNA expression than the blank control group, and the low-, middle-, and high-dose detumescence prescription groups had gradually reduced RANKL mRNA expression compared with the model group (P>0.05); the RANKL mRNA expression was significantly lower in the high-dose detumescence prescription group than in the low-dose detumescence prescription group (P<0.05). ConclusionDetumescence prescription can up-regulate the OPG mRNA expression and down-regulate the RANKL mRNA expression in subchondral bone osteoblasts in the rabbit model of osteoarthritis.

[Key words]detumescence prescription; osteoarthritis; kidney-tonifying, blood-activating, and diuresis-promoting therapy; osteoblast; osteoprotegerin; receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand

收稿日期：(2014-09-24；編輯：曹健)

[中圖分類號]R684.3[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.019

作者簡介：李亮(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師