補(bǔ)陽(yáng)還五湯黃酮類(lèi)有效成分在Caco-2細(xì)胞單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)特征及對(duì)CYP450酶活性的影響

鄭　璐，萬(wàn)浩芳，周惠芬，張宇燕，楊潔紅，萬(wàn)海同

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所，浙江 杭州　310053；

2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州　310053)

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補(bǔ)陽(yáng)還五湯黃酮類(lèi)有效成分在Caco-2細(xì)胞單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)特征及對(duì)CYP450酶活性的影響

鄭璐1，萬(wàn)浩芳2，周惠芬1，張宇燕1，楊潔紅1，萬(wàn)海同1

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所，浙江 杭州310053；

2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310053)

[摘要]目的研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯3個(gè)黃酮類(lèi)有效成分(羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素)在Caco-2細(xì)胞單層模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)特征及其在大鼠肝微粒體中對(duì)CYP450酶亞型活性的影響。方法MTT法研究藥物在Caco-2細(xì)胞單層模型的安全濃度范圍，以Caco-2細(xì)胞單層模型研究黃酮類(lèi)有效成分的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，以表觀滲透系數(shù)(Papp)為檢測(cè)指標(biāo)，考察時(shí)間、濃度以及P-gp抑制劑維拉帕米對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，利用Cocktail探針?lè)ㄑ芯克幬飳?duì)CYP450亞型的體外抑制作用。結(jié)果從頂側(cè)(apical, AP)到底外側(cè)(basolateral, BL)(AP→BL)，芒柄花素、毛蕊異黃酮的Papp>10-6cm/s，表明其吸收性良好，羥基紅花黃色素A的Papp為10-6cm/s，表明其吸收性一般；且三者的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨濃度升高和時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高，BL→AP的轉(zhuǎn)運(yùn)量與AP→BL的轉(zhuǎn)運(yùn)量的比值小于1.5，其中芒柄花素、毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運(yùn)都受到P-gp外排蛋白的外排作用；補(bǔ)陽(yáng)還五湯黃酮類(lèi)有效成分明顯降低了CYP2E1、CYP1A2酶探針底物的代謝量(P<0.05)。結(jié)論3種黃酮類(lèi)有效成分在Caco-2細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運(yùn)方式均為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，毛蕊異黃酮與芒柄花素明顯受到P-gp的外排作用，補(bǔ)陽(yáng)還五湯黃酮類(lèi)有效成分可以增加主要通過(guò)CYP2E1、CYP1A2酶代謝的藥物濃度。

[關(guān)鍵詞]補(bǔ)陽(yáng)還五湯；黃酮類(lèi)有效成分；藥物代謝動(dòng)力學(xué)；Caco-2細(xì)胞；CYP450酶

補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黃芪、川芎、當(dāng)歸、赤芍、桃仁、紅花和地龍這7味中藥組成，具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)之效，其中紅花中羥基紅花黃色素A，黃芪中芒柄花素、毛蕊異黃酮為其中主要的3個(gè)黃酮類(lèi)有效成分。補(bǔ)陽(yáng)還五湯可舒張血管平滑肌，具有抗凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集活性和激素樣作用[1-3]。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(the human colon adenocarcinoma cell lines，Caco-2)細(xì)胞模型是研究藥物吸收的重要手段，可在細(xì)胞水平上研究藥物分子透過(guò)小腸黏膜的吸收、分布、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)以及毒性的綜合信息[4-6]。藥物代謝主要場(chǎng)所在肝臟，細(xì)胞色素P450酶是其中最重要的酶系。本研究通過(guò)吸收和代謝相結(jié)合進(jìn)行補(bǔ)陽(yáng)還五湯的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，闡明補(bǔ)陽(yáng)還五湯黃酮類(lèi)有效成分的吸收代謝機(jī)制，為臨床用藥、方劑學(xué)配伍規(guī)律研究和中藥現(xiàn)代化研究提供參考。

1材料

1.1藥品與試劑羥基紅花黃色素A標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào) 111637-200502，純度>98%；毛蕊異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品：天津馬克，批號(hào) 201409，純度>98%；芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品：天津馬克，批號(hào) 201408，純度>98%；D-hanks(不含酚紅，無(wú)Ca2+、Mg2+)：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)：BIOSHARP，Amreso 0793；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)：美國(guó)sigma；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)：杭州四季青；堿性磷酸酶試劑盒：南京建成生物工程研究所；高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)：美國(guó)Gibco公司；非必需氨基酸：美國(guó)Gibco公司；0.25%胰蛋白酶-0.25%乙二胺四乙酸鈉(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)混合消化液：杭州昊天生物；24孔0.4 μm Millicell小室：Millipore corporation；非那西丁(phenacetin，PH)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)、甲苯磺丁脲(tolbutamide，TOL)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%)、奧美拉唑(omeprazole，OME)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)、氯唑沙宗(chlorzoxazone，CHL)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%)：美國(guó)sigma公司；氯雷他定(loratadine，LOR)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%，批號(hào) 100615-201103)：中國(guó)食品藥品檢定研究院；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)四鈉鹽(純度>97%，批號(hào) 28D10341)：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；水為超純水；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，其余均為分析純。

1.2儀器SHB-ⅢA循環(huán)水式真空泵：河南省太康科教器材廠；DZG-6020B恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Agilent1200高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；Agilent Extend-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)：美國(guó)Agilent公司；AR153CN電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；XS205分析天平：梅特勒-托利多公司；Cascada超純水儀：美國(guó)Pall公司；Millicell-ERS電阻儀：美國(guó)Millipore公司；倒置相差熒光顯微鏡：Nikon；電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；電熱手提壓力蒸氣消毒器(YXQSG41.280)：上海醫(yī)用核子儀器廠；6、24、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶：美國(guó)Corning。

1.3細(xì)胞Caco-2細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，傳代數(shù)為27~35。

1.4肝微粒大鼠肝微粒體購(gòu)于美國(guó)CHI SCIENTIFIC公司。

2方法

2.1黃酮類(lèi)有效成分測(cè)定

2.1.1色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.04%磷酸水，梯度洗脫(0~5 min，10%~15%乙腈；10~15 min，30%~40%乙腈；15~20 min，40%乙腈)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2方法學(xué)考察

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制毛蕊異黃酮濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、7.5 mol/L，芒柄花素濃度分別為10、20、40、80、150、300 mol/L，羥基紅花黃色素A濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶于D-Hanks中)，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，分別以羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素的濃度(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為y=44.004x+2.081 4，y=8.501 1x+3.201 5，y=5.336 9x+1.846 9；濃度分別在0.2～10、0.5~25、10~500 μmol/L時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2>0.999)。

2)精密度試驗(yàn)分別移取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，根據(jù)探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V分析條件進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積積分值的RSD分別為1.11%、1.86%、0.60%。

3)準(zhǔn)確性試驗(yàn)分別移取樣品溶液的適量，根據(jù)探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V分析條件進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積積分值RSD分別為0.90%、2.10%、0.73%。

4)穩(wěn)定性試驗(yàn)取適量羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，經(jīng)樣品預(yù)處理后于0、2、6、10 h，根據(jù)探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V分析條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)得羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積積分值的RSD分別為2.28%、1.14%、1.03%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

5)加樣回收率試驗(yàn)分別取已知含量的3個(gè)樣品分成3份，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素儲(chǔ)備液適量，根據(jù)探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V分析條件測(cè)定結(jié)果，羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均加樣回收率在95%～105%，且加樣回收率的RSD均小于3%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

6)專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)分別吸取空白液、對(duì)照品溶液以及生物樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。3個(gè)成分的色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)不低于3 500，且空白對(duì)照在相應(yīng)位置上未見(jiàn)色譜峰，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1空白液(A)、黃酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品(B)和轉(zhuǎn)運(yùn)后黃酮類(lèi)有效成分(C)高效液相色譜圖(1. 羥基紅花黃色素A；2. 毛蕊異黃酮；3.芒柄花素)

2.2探針?biāo)幬锖繙y(cè)定

2.2.1液相色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫(0~5 min，20%~30%乙腈；5~15 min，30%~50%乙腈)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

2.2.2方法學(xué)考察

1)線性關(guān)系考察配制一系列探針?biāo)幬?PH、TOL、CHL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL，加入2 mL冰冷的乙酸乙酯，漩渦2 min，室溫靜置10 min，3 000 r/min離心10 min，取1.5 mL有機(jī)相，于真空干燥箱干燥后加200 μL乙腈溶解，漩渦2 min，移入Eppendorf管中，16 000 r/min離心4 min，取上層液體，在最佳色譜條件下進(jìn)樣分析。以摩爾濃度(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，PH、TOL、CHL的回歸方程分別為：y=6.064 2x+0.528 8，y=0.133x+0.644 1，y=5.681 1x+ 0.693 1，濃度分別在0.1～100、0.1~200、1~500 μmol/L時(shí)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.999)。

2)精密度試驗(yàn)分別移取稀釋后的PH、TOL、CHL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，根據(jù)探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V分析條件進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。PH、TOL、CHL峰面積積分值的RSD分別為0.65%、0.46%、0.57%。

3)準(zhǔn)確性試驗(yàn)分別移取樣品溶液適量，根據(jù)探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V分析條件進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。PH、TOL、CHL峰面積積分值的RSD分別為1.39%、0.99%、1.46%。

4)穩(wěn)定性試驗(yàn)取適量PH、TOL、CHL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，經(jīng)樣品預(yù)處理后于0、2、6、10 h，根據(jù)探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V分析條件進(jìn)樣20 μL。測(cè)得PH、TOL、CHL峰面積積分值的RSD分別為0.68%、0.76%、0.86%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

5)加樣回收率試驗(yàn)分別取已知含量的3個(gè)樣品分成3份，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的PH、TOL、CHL儲(chǔ)備液適量，根據(jù)探針?biāo)幬锏母咝б合嗌V分析條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)得探針?biāo)幬颬H、TOL、CHL的平均加樣回收率為95%～105%，且加樣回收率的RSD均小于3%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

6)專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)分別吸取空白液、對(duì)照品溶液以及生物樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，并進(jìn)行對(duì)比，各色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)不低于3 000，且空白對(duì)照在相應(yīng)位置上未見(jiàn)色譜峰(見(jiàn)圖2)，表明方法專(zhuān)屬性良好。

圖2空白液(A)、CYP450探針?biāo)幬飿?biāo)準(zhǔn)品(B)、肝微粒代謝后樣品(C)高效液相色譜圖(1. PH；2. CHL；3. LOR；4. TOL)

2.3細(xì)胞培養(yǎng)將Caco-2 細(xì)胞置于含20% FBS、1%非必需氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗液的高糖DMEM中，接種于6孔板上，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱環(huán)境下培養(yǎng)，隔日換液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至孔面積的80%左右，用胰酶消化并且傳代。

2.4MTT法篩選藥物實(shí)驗(yàn)濃度將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞以2×104/mL密度接種于96孔板，每孔終容積200 μL，培養(yǎng)24 h。小心吸盡每孔培養(yǎng)液，加入濃度分別為100、200、400、800、1 200 μmol/L的藥溶液，空白對(duì)照孔僅含培養(yǎng)液，對(duì)照組加入細(xì)胞和培養(yǎng)液。按照“2.3”項(xiàng)條件培養(yǎng)4 h后，每孔加5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃下繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)后小心吸棄上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min 使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處的吸光度(absorbance, A)值，空白調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%)。選取細(xì)胞存活率≥90%的藥物濃度作為非細(xì)胞毒濃度，確定為適宜濃度。

2.5Caco-2細(xì)胞單層模型制備[7]將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于轉(zhuǎn)運(yùn)孔中，腸腔頂(apical, AP)側(cè)與腸內(nèi)底外(basolateral, BL)側(cè)分別加0.5、1.5 mL培養(yǎng)基，隔日換液，1周后每天換液，培養(yǎng)至21 d，測(cè)定兩側(cè)培養(yǎng)液的堿性磷酸酶活性以及各孔采用Millicell-ERS電阻儀測(cè)跨膜電阻，當(dāng)AP側(cè)與BL側(cè)的堿性磷酸酶活性比值接近3∶1以及各孔跨膜電阻大于500 Ω/cm2時(shí)，表明Caco-2細(xì)胞單層已形成，可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.6轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[8]取符合“2.5”項(xiàng)下條件的轉(zhuǎn)運(yùn)孔，在實(shí)驗(yàn)前用預(yù)熱的D-Hanks液蕩洗3次，最后1次在37 ℃培養(yǎng)箱中溫孵30 min，吸去廢液。用D-Hanks液配制濃度均為150、200、250 μmol/L的3種黃酮類(lèi)有效成分藥液。在AP側(cè)至BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，AP側(cè)加藥液0.5 mL，BL側(cè)加空白D-Hanks液1.5 mL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；在BL側(cè)至AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)中，AP側(cè)加空白D-Hanks液0.5 mL，BL側(cè)加藥液1.5 mL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

考察P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抑制劑維拉帕米對(duì)黃酮類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響時(shí)，先用含維拉帕米(50 μmol/L)的D-Hanks液將細(xì)胞孵育30 min，吸去廢液，AP側(cè)加黃酮類(lèi)有效成分藥液，BL側(cè)作為接收池，給藥后將24孔板置于37 ℃、50 r/min的恒溫?fù)u床中，分別于30、60、90、120 min從接收池內(nèi)取樣200 μL，同時(shí)用空白D-Hanks液補(bǔ)足，高效液相色譜法檢測(cè)黃酮類(lèi)有效成分濃度，計(jì)算黃酮類(lèi)有效成分含量。計(jì)算藥物的表觀滲透系數(shù)(Papp)。Papp=(dQ/dt)/(A×c0)，式中dQ/dt為接收池單位時(shí)間藥物轉(zhuǎn)運(yùn)量，A為轉(zhuǎn)運(yùn)膜的面積(0.33 cm2)，c0為藥物的初始濃度。

2.7黃酮類(lèi)有效成分對(duì)CYP450亞型的體外抑制作用[9]CYP450底物探針組合為PH(CYP1A2，10 μmol/L)、TOL(CYP2C9，100 μmol/L)、CHL(CYP2E1，20 μmol/L)，最佳孵育時(shí)間選定為15 min，0.4 mg/mL為最佳孵育蛋白濃度，通過(guò)探針底物的代謝量變化來(lái)反映3種黃酮類(lèi)有效成分對(duì)大鼠3種主要CYP450酶亞型活性的影響。

肝微粒體外孵育方法及樣品處理：孵育總體積500 μL，包括0.1 mol/L的PBS(pH 7.4)、10 mmol/L MgCl2、0.25 mg/mL肝微粒體蛋白，PH 10 μmol/L、TOL 100 μmol/L、CHL 20 μmol/L的探針?biāo)幬锘旌弦?，以及羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素各150 μmol/L混合液，羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素濃度各200 μmol/L的混合液，羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素濃度各250 μmol/L的混合液。將上述3組藥品液分別在37 ℃水浴中孵育5 min，加入1 mmol/L NADPH啟動(dòng)反應(yīng)。37 ℃水浴中孵育20 min，加入2 mL冰冷的乙酸乙酯終止反應(yīng)，加入10 μL LOR(1 mmol/L)作為內(nèi)標(biāo)，漩渦2 min，室溫靜置10 min，3 000 r/min離心10 min，取1.5 mL有機(jī)相，于真空干燥箱干燥后加200 μL乙腈溶解，漩渦2 min，移入Eppendorf管中，16 000 r/min離心4 min，取上層液體，進(jìn)行高效液相色譜分析，進(jìn)樣量為20 μL。

3結(jié)果

3.1藥物濃度篩選通過(guò)MTT法檢測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃酮類(lèi)有效成分對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性，計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果表明：羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮、芒柄花素在0~0.3 mmol/L為非細(xì)胞毒性劑量，即藥物與細(xì)胞共同培養(yǎng)4 h后，細(xì)胞存活率>90%。

3.2黃酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)量與時(shí)間和濃度的關(guān)系兩因素混合設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，被試內(nèi)因素(時(shí)間)和被試間因素(濃度)對(duì)3種黃酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)量的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示濃度越大、時(shí)間越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)運(yùn)量越大。時(shí)間和濃度對(duì)3種黃酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)量的交互作用也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，從圖3中可知，在同一時(shí)間點(diǎn)，加藥濃度越大，3種黃酮類(lèi)有效成分的轉(zhuǎn)運(yùn)量也越大；在相同濃度下，隨時(shí)間延長(zhǎng)，三者從AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。不同濃度下，羥基紅花黃色素A的Papp(AP→BL)為(1.3~1.8)×10-6cm/s，表明羥基紅花黃色素A的吸收度不高，芒柄花素與毛蕊異黃酮的Papp(AP→BL)均遠(yuǎn)大于10-6cm/s，表明芒柄花素與毛蕊異黃酮的吸收良好，提示兩者生物利用度良好。見(jiàn)表1。

羥基紅花黃色素A的Papp(BL→AP)與Papp(AP→BL)的比值為1.0~1.3；從BL→AP轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯大于AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)量(P<0.05)，初步判定羥基紅花黃色素A在AP→BL的轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。芒柄花素和毛蕊異黃酮的Papp(BL→AP)與Papp(AP→BL)的比值為0.5～1.0。從AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯大于BL→AP轉(zhuǎn)運(yùn)量(P<0.05)，初步判定毛蕊異黃酮與芒柄花素在AP→BL的轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，且可能兼有載體介導(dǎo)的藥物外排，見(jiàn)表1。

注：對(duì)于同一時(shí)間，含有相同右上標(biāo)字母的濃度組相比較，P>0.05，含有不同右上標(biāo)字母的濃度組相比較，P<0.05；對(duì)于同一濃度，含有相同右上標(biāo)符號(hào)(*△#◇)的時(shí)間組相比較，P>0.05，不含有相同右上標(biāo)符號(hào)的時(shí)間組相比較，P<0.05。

圖3　時(shí)間與濃度對(duì)羥基紅花黃色素A(A)、毛蕊異黃酮(B)、芒柄花素(C)AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響(n=3)

注：與Papp(AP→BP)組比較，*P<0.05。

3.3P-gp抑制劑維拉帕米對(duì)黃酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)的影響與黃酮類(lèi)有效成分150 μmol/L給藥組相比，加入維拉帕米50 μmol/L可顯著提高毛蕊異黃酮與芒柄花素的Papp(AP→BL)(P<0.05)；維拉帕米預(yù)處理對(duì)羥基紅花黃色素A的Papp(AP→BL)無(wú)明顯影響(P>0.05)。見(jiàn)表2。兩因素混合設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，被試內(nèi)因素(時(shí)間)對(duì)3種黃酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)量的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，被試間因素(組別)對(duì)3種黃酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)量的主效應(yīng)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，3種黃酮類(lèi)有效成分的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加，維拉帕米對(duì)3種黃酮類(lèi)有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)量無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖4。

表2　維拉帕米對(duì)3種黃酮類(lèi)有效成分在Caco-2模型中Papp(AP→BL)的影響s，n=3)

注：與正常加藥組比較，*P<0.05。

注：對(duì)于同一時(shí)間，含有相同右上標(biāo)字母的濃度組相比較，P>0.05，含有不同右上標(biāo)字母的濃度組相比較，P<0.05；對(duì)于同一濃度，含有相同右上標(biāo)符號(hào)(*△#◇)的時(shí)間組相比較，P>0.05，不含有相同右上標(biāo)符號(hào)的時(shí)間組相比較，P<0.05。

3.4黃酮類(lèi)有效成分對(duì)CYP450亞型的影響150、200、250 μmol/L黃酮類(lèi)有效成分混合液對(duì)CYP2E1有明顯的抑制作用(P<0.05)，250 μmol/L黃酮類(lèi)有效成分混合液對(duì)CYP1A2有明顯的抑制作用(P<0.05)，3種濃度黃酮類(lèi)有效成分混合液對(duì)CYP2C9的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

注：對(duì)同一種CYP450亞型，含有相同右上標(biāo)字母的濃度組相比較，P>0.05，不含相同右上標(biāo)字母的濃度組相比較，P<0.05。

4討論

Caco-2細(xì)胞模型與人體吸收機(jī)制有良好的相似性，是預(yù)測(cè)體內(nèi)吸收，研究藥物吸收機(jī)制的良好模型[10-14]。采用MTT法測(cè)定藥物的安全濃度可避免藥物濃度過(guò)高造成細(xì)胞死亡導(dǎo)致的吸收假象。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)建立合格的Caco-2細(xì)胞單層模型作為小腸吸收的體外模型，在補(bǔ)陽(yáng)還五湯中3種黃酮類(lèi)有效成分中，芒柄花素、毛蕊異黃酮的Papp(AP→BL)>10-6cm/s，兩者隨時(shí)間延長(zhǎng)和濃度升高而顯著升高，Papp(BL→AP)與Papp(AP→BL)的比值為0.5～1。初步判定毛蕊異黃酮與芒柄花素在AP→BL的轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，且可能兼有載體介導(dǎo)的藥物外排，同時(shí)芒柄花素與毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運(yùn)都受到P-gp外排蛋白的外排作用。羥基紅花黃色素A生物利用度不高，Papp接近于10-6cm/s；Papp(BL→AP)與Papp(AP→BL)的比值小于1.5，初步判定羥基紅花黃色素A在AP→BL的轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)且P-gp抑制劑維拉帕米對(duì)羥基紅花黃色素A的AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)影響。

CYP450為存在于肝臟微粒體混合功能氧化酶系的主要成分，是一組由許多同工酶組成的超基因大家族，其中與藥物代謝關(guān)系密切的有CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4[15-17]。黃酮類(lèi)化合物是植物界分布較廣的一大類(lèi)天然化合物，各類(lèi)中藥有效成分中黃酮類(lèi)化合物對(duì)CYP450影響的研究最為廣泛，其中羥基紅花黃色素A增加CYP2E1的表達(dá)量[18]。本實(shí)驗(yàn)室參考He F等[19]進(jìn)行的6種探針的酶動(dòng)力學(xué)研究，對(duì)其中3種探針?biāo)幬镞M(jìn)行了單獨(dú)孵育和混合孵育相同濃度探針的研究，比較兩者的代謝速率，最終本實(shí)驗(yàn)確定的探針為PH、TOL和CHL，濃度分別為10、100、20 μmol/L。Cocktail探針?biāo)幬锓ㄖ蟹跤龝r(shí)間、蛋白濃度等條件均需進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)也要考慮到其他情況，例如代謝轉(zhuǎn)化率很低的探針，也要保證其檢測(cè)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)室利用大鼠肝微粒體研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯黃酮類(lèi)有效成分在體外代謝的情況，本實(shí)驗(yàn)將孵育時(shí)間設(shè)定為15 min，0.4 mg/mL作為最終的蛋白濃度。本實(shí)驗(yàn)中3種黃酮類(lèi)有效成分對(duì)CYP2E1、CYP1A2均有明顯的抑制作用，通過(guò)降低CYP450酶亞型的活性，從而導(dǎo)致經(jīng)此酶代謝的其他藥物代謝減慢，血藥濃度升高，作用時(shí)間延長(zhǎng)。提示在臨床使用中補(bǔ)陽(yáng)還五湯黃酮類(lèi)有效成分可以增加主要通過(guò)CYP1A2和CYP2E1代謝的藥物濃度，因此在臨床用藥時(shí)應(yīng)注意合理用藥，避免其他藥物體內(nèi)蓄積而產(chǎn)生不良反應(yīng)。

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Transport Characteristics of Flavonoids in Buyang Huanwu Decoction across Caco-2 Cell Monolayer Model and Their Effect on Cytochrome P450 Activity

ZHENGLu1,WANHao-fang2,ZHOUHui-fen1,ZHANGYu-yan1,YANGJie-hong1,WANHai-tong1

(1.InstituteofCardio-CerebrovascularDisease,ZhejiangUniversityofChineseMedicine,ZhejiangHangzhou310053,China; 2.CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversityofChineseMedicine,ZhejiangHangzhou310053,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the transport characteristics of flavonoids (hydroxysafflor yellow A, formononetin, and calycosin) in Buyang Huanwu Decoction (BYHWD) across Caco-2 cell monolayer model and their effect on cytochrome P450 (CYP450) activity in rat liver microsomes. MethodsThe safe concentration range of flavonoids in Caco-2 cell monolayer model was determined by MTT assay. The mechanism of bidirectional transport of flavonoids was investigated using the Caco-2 cell monolayer model. The influence of time, concentration, and P-gp inhibitor verapamil on the transport of flavonoids was studied using apparent permeability coefficient (Papp) as the index. The in vitro inhibitory effect of flavonoids on CYP450 activity was studied by the Cocktail method. ResultsThe Pappof formononetin and calycosin in the transport from apical (AP) side to basolateral (BL) side were more than 10-6cm/s, which showed a good absorption, but the Pappof hydroxysafflor yellow A was 10-6cm/s, which showed an ordinary absorption. In the Caco-2 cell monolayer model, the transport of the three compounds was positively correlated with time and concentration, and the ratio of the transport from BL side to AP side to that from AP side to BL side was lower than 1.5. The transport of formononetin and calycosin was rejected by P-gp, and the flavonoids in BYHWD significantly reduced the metabolism of CYP1A2 and CYP2E1 probe substrates (P<0.05).ConclusionThe transport of the three flavonoids across Caco-2 cell monolayer model is passive, and formononetin and calycosin are rejected by P-gp. The three flavonoids in BYHWD can increase the concentration of the drug metabolized through CYP1A2 and CYP2E1.

[Key words]Buyang Huanwu Decoction; flavonoids; pharmacokinetics; Caco-2 cell; cytochrome P450

收稿日期：(2015-01-22；編輯：姚實(shí)林)

通信作者：萬(wàn)海同，whtong@126.com

作者簡(jiǎn)介：鄭璐(1986-)，女，碩士研究生

[中圖分類(lèi)號(hào)]R969[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.021

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274176，81202636)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LR12H27001)；浙江省教育廳科研資助項(xiàng)目(Y201329166)