龍眼己糖激酶基因的克隆及原核表達

帥　良，李　靜，韓冬梅，吳振先(華南農業(yè)大學園藝學院，廣東廣州5064;廣東省農業(yè)科學院果樹研究所，廣東廣州50640)

龍眼己糖激酶基因的克隆及原核表達

帥良1，李靜1，韓冬梅2，吳振先1
(1華南農業(yè)大學園藝學院，廣東廣州510642;2廣東省農業(yè)科學院果樹研究所，廣東廣州510640)

摘要:【目的】克隆龍眼Dimocarpus longan己糖激酶(Hexokinase，HXK)基因，并對其進行生物信息學分析及原核表達分析.【方法】以龍眼總RNA為模板，采用RT-PCR結合RACE法獲得基因全長cDNA序列，構建pET-32a-DlHXK原核表達載體，轉化到大腸埃希菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中誘導表達.【結果和結論】成功克隆龍眼己糖激酶基因的cDNA全長序列，命名為DlHXK，登錄號為KF776906.1.龍眼DlHXK序列全長2 101 bp，包括1個1 488 bp的開放閱讀框，預測編碼495個氨基酸;進化樹和相似性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與溫州蜜柑Citrus unshiu的相似性最高，達到了82%;熒光定量表達分析表明，DlHXK基因隨著果實的發(fā)育成熟表達量逐漸上升;經IPTG誘導和SDSPAGE檢測，所構建的原核表達載體表達的融合蛋白與預期蛋白大小相吻合.由此可見，利用RT-PCR結合RACE方法成功克隆了龍眼的己糖激酶基因，構建原核表達載體，并在大腸埃希菌Rosetta (DE3)中獲得高效表達.

關鍵詞:龍眼;己糖激酶;基因克隆;熒光定量PCR;原核表達

帥良，李靜，韓冬梅，等.龍眼己糖激酶基因的克隆及原核表達［J］.華南農業(yè)大學學報，2015，36(3) : 91-97.

優(yōu)先出版時間:2015-04-14

優(yōu)先出版網址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20150414.0945.019.html

龍眼Dimocarpus longan屬于無患子科Sapindaceae龍眼屬，是我國南方主要的亞熱帶果樹之一，產區(qū)主要分布在廣東、廣西、福建、海南等省.龍眼果實屬于糖直接積累型，果實發(fā)育前期只有極少數(shù)的淀粉積累，果實發(fā)育后期均以可溶性糖的形式貯藏于液泡中［1］.龍眼果實成熟時期假種皮中可溶性固形物質量分數(shù)可達22%～24%，在龍眼果實的可溶性固形物中，糖是主要組成成分，因此糖組分及其含量在一定程度上已經成為衡量龍眼品種好壞的一個重要指標［2］.大多數(shù)高等植物通過光合作用在葉片中產生以蔗糖為主的碳水化合物，并通過韌皮部運輸分配到不同的庫組織中［3］.蔗糖進入庫器官后，在蔗糖合成酶或轉化酶作用下分解為果糖和葡萄糖，果糖和葡萄糖均為己糖［4-6］.己糖經過磷酸化后才能進入糖酵解途徑，從而為植物的生理活動提供能量和中間代謝產物，因而己糖磷酸化對維持植物的呼吸作用是必不可少的［3］.己糖磷酸化的催化酶統(tǒng)稱為己糖激酶(Hexokinase，HXK).HXK是一種雙功能酶，不僅催化己糖磷酸化，而且在糖信號感受和傳達方面有很重要的作用，同時它也是植物體呼吸代謝過程中的關鍵酶之一［7］.因此，探明龍眼果實中HXK的生化性質對其糖信號調控機制和人工調控龍眼果實中糖含量，提高龍眼果實品質有非常重要的意義.

自從Minet等［8］通過功能互補表達文庫從擬南芥Arabidopsis thaliana中鑒定出第一個植物HXK基因.目前GenBank已登錄多種高等植物HXK基因全長或片段序列.但是關于無患子科的HXK基因至今鮮見報道.本論文以龍眼為研究材料，分離克隆出龍眼果實HXK基因的cDNA全長序列，通過熒光定量技術分析了該基因在果實不同發(fā)育期間表達變化情況，并且構建了該基因的原核表達載體，在大腸埃希菌Escherichia coli中進行表達，為深入探索HXK基因在龍眼果實糖代謝過程中所起作用奠定基礎.

1　材料與方法

1.1材料

試驗材料為石硤龍眼D.longan cv.Shixia，采自廣東省農業(yè)科學院果樹研究所.

參照韓冬梅等［9］對龍眼果實發(fā)育進程的研究，分別于花后59、73、87、94、101和110 d摘取不同發(fā)育階段龍眼果實，其中花后110 d為果實成熟采收時期.摘取的果實立即運回實驗室，去梗，選取發(fā)育正常、外觀良好的果實作為試驗材料.

采集的假種皮樣品于液氮中速凍，置于－80℃超低溫冰箱中保存.

1.2龍眼果實總RNA的提取及反轉錄cDNA的合成

從龍眼各發(fā)育階段假種皮中分別提取總RNA，參照熱硼酸方法［10］，并稍作改動.使用純度合格且已經去除基因組DNA的混合果皮和果肉的RNA為模板，采用TaKaRa cDNA合成試劑盒進行反轉錄，反轉錄酶為Reverse Transcriptase M-MLV，使用Random Primer引物，嚴格按照說明書的方法進行cDNA的合成，產物于－40℃條件下保存?zhèn)溆?

1.3龍眼果糖激酶基因(DlHXK)的克隆

根據(jù)GenBank上登錄的其他物種HXK基因序列，重點關注亞熱帶果樹，經過比對保守區(qū)域序列設計特異引物P1和P2.以龍眼cDNA為模板進行片段擴增: 94℃5 min; 94℃45 s，55℃45 s，72℃60 s，共30個循環(huán); 72℃延伸10 min.反應產物于10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收，連接至pMD18-T載體，轉化大腸埃希菌DH5α，菌液鑒定后送上海生工生物工程公司測序.

根據(jù)克隆得到的HXK基因片段序列設計3' RACE的P3、P4引物以及5'RACE的P5引物; 3'端的獲得使用TaKaRa 3'-Full RACE Core Set試劑盒，方法按照說明書步驟進行，5'端的獲得通過TaKaRa 的Clontech Smart試劑盒，方法按照說明書步驟進行.擴增產物進行回收轉化后測序.根據(jù)所得的拼接序列，在起始密碼子處和終止密碼子處設計引物P6 和P7，進行PCR擴增，得到全長序列;引物設計、序列分析使用DNAMAN和Primer 5.本試驗中使用的引物序列見表1，引物均委托上海捷瑞生物工程有限公司合成.

1.4生物信息學分析

使用GenBank的BLAST工具進行序列檢索;引物設計、序列拼接及分析采用DNAMAN 6.0軟件;使用NCBI中的ORF Finder工具尋找基因的開放閱讀框(ORF) ;使用ExPASy ProtParam進行蛋白質的理化性質分析;使用TMHMM 2.0進行跨膜結構預測與分析;亞細胞定位使用PSORT;使用ClustalX 1.83軟件對氨基酸序列進行多重比對;使用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining法(鄰位相連法，NJ)建樹，并進行編輯和測試。

表1　引物序列及用途Tab.1 Sequence of primers and their usage

1.5龍眼果糖激酶基因(DlHXK)的表達

選用DlHXK基因作為內參基因進行龍眼果實RT-PCR分析.20 μL擴增體系: cDNA模板1 μL，上游引物P13和下游引物P14各1 μL，反應SYBR Green MIX 10 μL(Toyobo)，ddH2O 7 μL.RT-qPCR反應程序: 50℃2 min; 95℃10 min; 95℃15 s，60℃25 s，72℃35 s，40個循環(huán).PCR擴增程序之后添加溶解程序，得到溶解曲線.內參基因擴增體系使用引物為P11和P12.

1.6原核表達載體的構建

使用Clontech發(fā)明的In-Fusion技術，于Clontech網上設計帶BamH I (GGATCC)和Sal I (GTCGAC)酶切位點的上下游引物P9和P10，PCR反應體系為20 μL: 10×LA Taq PCR buffer 2 μL，引物P9和P10 各1 μL(10 μmol·L－1)，LA-Taq酶0.2 μL，dNTP Mixture 2 μL(2.5 mmol·L－1)，cDNA 2 μL，ddH2O補至20 μL.PCR程序: 94℃預變性5 min; 94℃30 s，55℃45 s，72℃1.5 min，30個循環(huán); 72℃延伸10 min.PCR產物使用12 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測.目前條帶經切膠、純化、回收，所獲得的片段在In-Fusion HD Enzyme Premix酶的作用下連接到經過BamH I和Sal I雙酶切回收后的pET-32a載體上，50℃條件下連接15 min.連接產物轉入DH5α感受態(tài)細胞，涂板于含氨芐抗性的LB平板上，37℃條件下培養(yǎng)16 h以上，選取重組質粒，通過PCR、雙酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行正確性驗證.將構建成功的表達質粒命名為pET-32a-DlHXK，將測序完全正確的重組質粒轉化到大腸埃希菌Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞中，以驗證單克隆的正確性.

1.7重組質粒的誘導表達及SDS-PAGE分析

選取正確的單克隆細胞接種到5 mL含50 μg·mL－1氨芐的LB培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，然后將菌液按體積比1∶100的比例加入到5 mL含50 μg·mL－1氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃條件下200 r·min－1振蕩培養(yǎng)，期間不斷測定D600 nm的變化，至D600 nm為0.5～0.6時，加入IPTG誘導劑進行誘導表達，IPTG的終濃度為0.4 mmol·L－1，于誘導表達后的1、3、5和7 h時離心收集菌體，－20℃條件下保存菌體.使用未經IPTG誘導的菌液作為空白對照，同時以pET－32a質粒轉化菌加IPTG和不加IPTG分別誘導3 h后收集菌體作為正對照.

取10 μL菌體沉淀與等體積的上樣緩沖液混勻，進行SDS-PAGE膠的電泳檢測，凝膠使用R-250染色并脫色至背景清晰.

2　結果與分析

2.1龍眼果實總RNA的提取

從植物組織中提取RNA是進行分子生物學研究的前提，進行下一步試驗需要高質量的RNA，而純度和完整性是評價RNA質量品質的2個關鍵指標.經過測定，本試驗提取的RNA的D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之間，由圖1A可以確定所提取RNA純度較高，可以進行下一步試驗.

圖1　瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1　 Results of agarose gel electrophoresis

2.2龍眼果實HXK基因全長的cDNA克隆

根據(jù)GenBank已有序列設計特異性引物P1和P2，以提取的總RNA直接反轉錄獲得的cDNA為模板，經過PCR擴增出1條與預期目標片段相符、約1 100 bp的DNA片段，經測序分析為HXK基因片段(圖1B).采用3'RACE方法擴增HXK基因的3'端，經2輪擴增后得到長度600 bp的DNA片段(圖1C)，采用5'RACE方法擴增獲得HXK基因的5'端，產物長度約1 000 bp(圖1D).最后將所得片段和3'端及5'端進行拼接，得到HXK基因的全長cDNA序列，找到起始密碼子ATG，終止密碼子TGA，并設計ORF引物進行序列全長準確性驗證(圖1E).

2.3 DlHXK生物信息學分析

經分析對比發(fā)現(xiàn)，獲得了HXK基因的全長，命名為DlHXK，其全長cDNA序列約2 101 bp，包括1 個1 488 bp的ORF，1個長249 bp的5'非翻譯區(qū)序列和1個長361 bp的3'非翻譯區(qū)，后面帶著1個長12 bp的poly(A)尾，編碼495個氨基酸.經過Ex-PASy ProtParam推測，該蛋白相對分子質量為53 700，等電點為6.20，說明該蛋白呈酸性，該蛋白含Leu (L)最多，達10.1%，不含Sec (U)和Pyl (O).總的帶正電殘基(Arg + Lys)為56，負電殘基(Asp + Glu)為62，不穩(wěn)定系數(shù)35.02，為穩(wěn)定蛋白，其脂溶指數(shù)為96.15，GRAVY(Grand average of hydropathicity)值為－0.007，屬親水蛋白.經TMHMM2.0推測，該蛋白具有跨膜區(qū)域，是膜蛋白.由此可知，DlHXK是跨膜的親水穩(wěn)定性蛋白.經過PSORT推測，該蛋白亞細胞定位在葉綠體中的可能性最大.

直接對獲得的堿基序列在NCBI網站上BLAST，分析其與其他物種HXK基因的相似性發(fā)現(xiàn)，與甜橙Citrus sinensis(AF196966.1)的相似性達到了86%，與向日葵Helianthus annuus(DQ835563.2)的相似性達到了77%，與擬南芥(NM _ 119057.3、AK230265.1、U18754.2、U28214.1、)的相似性達到76%以上.通過對其預測編碼的氨基酸序列與其他植物中HXK基因的相似性分析發(fā)現(xiàn)，與溫州蜜柑Citrus unshiu(AAG28503.1)相似性達到了82%，與甜瓜Cucumis melo(ACJ04704.1)、番茄Lycopersicon esculentum(NP_001234710.1)、枇杷Eriobotrya japonica (ADZ96378.1)、甘藍Brassica oleracea(AAL60584.1)、煙草Nicotiana tabacum(AAS60195.1)等物種相似性分別達到了79%、71%、74%、73%、74%.與擬南芥(NP_179576.1)的相似性也達到了72%.使用ClustalX 1.83軟件將其與其他植物HXK基因編碼的氨基酸序列做相似性比對(圖2)，HXK蛋白含有核心糖結合域(Sugar: LGFTFSFP-Q-L/I)，并含有4個肽段(L 1-4)其中L2是不保守的肽段區(qū)域，2個磷酸化點(P1，P2)，2個結合位點(Con1，Con2)和1個腺苷酸(Adenosine)［11］.

進行相似性進化分析后，進一步用MEGA5構建系統(tǒng)進化樹(圖3).結果顯示DlHXK與溫州蜜柑AAG28503.1的相似性最高，這與相似性分析結果相一致.

2.4龍眼DlHXK基因的表達分析

運用實時熒光定量PCR技術，以龍眼GAPDH基因為內參，檢測龍眼果實發(fā)育期間的DlHXK基因的表達情況(圖4).結果發(fā)現(xiàn)，DlHXK基因的表達量隨著果實的發(fā)育逐漸增加，在果實成熟采收時期達到表達的最大值，這與果實在盛夏采收時期溫、濕度較高導致的生理活動旺盛和呼吸強度較高有一定關系.

圖2　DlHXK基因與其他植物中HXK基因編碼的氨基酸序列相似性比較Fig.2 The amino acid sequence alignment of DlHXK compared with HXK genes of other species

圖3　DlHXK與其他物種HXK基因編碼的氨基酸序列進化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree of amino acid sequences based on DlHXK and other species with HXK gene

2.5原核表達載體構建及鑒定

原核表達載體pET-32a的質粒使用BamH I和Sal I雙酶切(圖5A)后回收產物片段，使用In-Fusion HD Enzyme Premix與帶有In-Fusion連接片段的Dl-HXK基因的ORF片段連接(圖5B)，獲得原核表達載體pET-32a-DlHXK，轉化進入DH5α感受態(tài)細胞中.挑選陽性克隆菌株進行菌液PCR和測序鑒定.菌液PCR分析發(fā)現(xiàn)能獲得1條約1 500 bp的條帶(圖5C)，測序結果經比對與DlHXK基因一致，并且未出現(xiàn)堿基突變及移碼現(xiàn)象，表明pET-32a-DlHXK原核表達載體構建成功.提取質粒，將pET-32a-DlHXK質粒轉入到Rosetta (DE3)中，進行蛋白的誘導表達.

圖5　PCR擴增及pET-32a載體雙酶切電泳圖Fig.5　 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification and pET-32a digested by BamH I and Sal I

2.6原核表達產物的檢測

重組質粒pET-32a-DlHXK轉入到Rosetta (DE3)中后，使用0.4 mmol·L－1IPTG誘導重組蛋白表達，結果(圖6)表明，在相對分子質量71 700(含His標簽18 000)左右位置有目的蛋白的融合表達條帶，表達的融合蛋白分子與理論預測值相符，這表明融合蛋白在Rosetta(DE3)中成功表達.未誘導的pET-32a-DlHXK則沒有在71 700左右出現(xiàn)條帶.不同誘導時間(1、3、5和7 h)結果表明，隨著誘導時間的延長融合蛋白的表達量逐漸增大，但5和7 h表達量相差不大，由此推測，經過5 h的誘導，融合蛋白的表達量可以達到最大值.

圖6　龍眼DlHXK基因重組蛋白在大腸埃希菌中的表達Fig.6　 Expression of recombinant pET-32a-DlHXK protein in Rosetta (DE3)

3　討論

自Minet等［8］利用酵母hxk1、hxk2雙突變體，通過功能互補表達文庫從擬南芥中鑒定出植物的第1 個HXK基因后，現(xiàn)今已證實HXK基因幾乎存在于所有生物體中［12］，現(xiàn)在GenBank上已經有多達28種高等植物的HXK基因全長或者片段［7］.然而在無患子科的龍眼上至今沒有相關報道.本文采用RT-PCR結合RACE技術擴增獲得了1個長度為2 101 bp的龍眼HXK全長cDNA序列，該序列包括1個1 488 bp的ORF，249 bp的5'非翻譯區(qū)序列和361 bp的3'非翻譯區(qū)，推測該基因編碼495個氨基酸.通過NCBI比對和同源進化分析，發(fā)現(xiàn)該基因與溫州蜜桔(AAG28503.1)的HXK基因具有很高的相似性，達到了82%，可見本文克隆出了龍眼HXK基因.通過對部分植物HXK基因的深入研究發(fā)現(xiàn)，植物HXK基因以多基因家族的形式存在［13］，且不同物種家族成員數(shù)不同，水稻中含有10個HXK家族成員［14］，擬南芥中含有6個該家族成員［15］，番茄中含有4個該家族成員［11］，本研究克隆得到1個HXK基因，推測可能是該基因的器官表達特異、時空表達差異、轉錄水平和翻譯水平差異等原因造成的.

HXK是一種雙功能酶，不僅催化己糖磷酸化，并且在糖信號感受和轉導方面有很重要的作用［16］，同時它也是植物體呼吸代謝過程中的關鍵酶之一［7］.定量分析表明，DlHXK基因的表達量隨著龍眼果實的發(fā)育逐漸增加，在果實成熟采收時期達到表達的最大值，這與果實在盛夏采收時期，由于溫度濕度較高導致的生理活動旺盛和呼吸強度較高有一定關系.馬鳳凰［17］研究發(fā)現(xiàn)，龍眼果實在發(fā)育過程中，己糖含量隨著果實的發(fā)育逐漸增加，與本文己糖激酶表達活性變化表現(xiàn)出較高的一致性.

原核表達系統(tǒng)具有易操作、穩(wěn)定性好、產量高、經濟實惠等優(yōu)點［18］，為研究蛋白功能和基因表達提供了一條高效可行的途徑.本研究將DlHXK基因與原核表達載體pET－32a重組構建為pET－32a－Dl-HXK，經IPTG誘導表達后發(fā)現(xiàn)DlHXK蛋白能夠與載體中的His標簽蛋白形成融合蛋白，并且在原核表達體系中成功表達.pET－32a－DlHXK在Rosetta (DE3)中表達，獲得了1個相對分子質量為71 700左右的表達蛋白，除去pET－32a上自帶的相對分子質量18 000的His標簽蛋白，可知DlHXK表達蛋白相對分子質量大約在53 700左右，與前文經過核苷酸推測編碼蛋白質大小結果相吻合.因此可知龍眼假種皮中DlHXK基因在大腸埃希菌中能夠成功表達，為深入研究己糖激酶的功能奠定了基礎，但其可溶性及酶學特性還有待進一步驗證.

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【責任編輯李曉卉】

Cloning and prokaryotic expression of hexokinase gene from Dimocarpus longan

SHUAI Liang1，LI Jing1，HAN Dongmei2，WU Zhenxian1
(1 College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;
2 Institute of Fruit Tree Research，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China)

Abstract:【Objective】Hexokinase gene (named DlHXK) was cloned from longan，Dimocarpus longan cv.Shixia，fruit.The bioinformatics and prokaryotic expression of DlHXK were analyzed.【Method】Total RNA extracted from longan fruit was used as a template.The full length cDNA of the gene was cloned using a combination of RT-PCR and RACE-PCR.Prokaryotic expression vector pET-32a-DlHXK was constructed and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) to induce expression.【Result and conclusion】The full length cDNA of DlHXK was cloned and its NCBI GeneBank accession number was KF776906.1，which has 2 101 bp nucleotides including a 1 488 bp ORF.It was predicted to encode 495 amino acids.It had the highest homology with the Citrus unshiu (82%) through the NCBI and evolutionary tree analysis.The results of quantitative RT-PCR showed that DlHXK gene expression increased gradually during the longan fruit maturation.Induced by IPTG and determinated by SDS-PAGE，the inducing expressed recombinant protein from prokaryotic expression vector was consistent with the putative protein of DlHXK.Therefore，the full length of DlHXK has been cloned and its prokaryotic expression vector has been constructed successfully.It was induced to express effectively in E.coli Rosetta (DE3).

Key words:Dimocarpus longan; hexokinase; gene cloning; quantitative RT-PCR; prokaryotic expression

基金項目:國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系(荔枝龍眼)資助(CARS-33-14)

作者簡介:帥良(1986—)，男，博士研究生，E-mail: 107206202@ qq.com;通信作者:吳振先(1971—)，男，教授，博士，E-mail: litchi2008@126.com

收稿日期:2014-03-10

文章編號:1001-411X(2015) 03-0091-07

文獻標志碼:A

中圖分類號:S667.2