多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜HIF-1α表達(dá)及與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系

金緯緯 蔡平生 方軼萍 姚銳

多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜HIF-1α表達(dá)及與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系

金緯緯 蔡平生 方軼萍 姚銳

目的觀察子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在多囊卵巢綜合征（PCOS）婦女子宮內(nèi)膜組織表達(dá)情況。方法PCOS引起的不孕不育患者40例為PCOS組，同期因男性因素或輸卵管因素就診的不孕癥患者40例為對(duì)照組，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)HIF-1α、VEGF基因和蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果與對(duì)照組比較，PCOS患者子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)水平降低（0.45±0.041比1、0.65±0.053比1，P＜0.01）；PCOS組VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)也較對(duì)照組降低（0.085±0.053比0.25±0.015、0.036±0.021比0.096±0.032，P＜0.01）。結(jié)論P(yáng)COS患者子宮內(nèi)膜HIF-1α、VEGF表達(dá)降低。

多囊卵巢綜合征；子宮內(nèi)膜容受性；HIF-1α；VEGF

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是由神經(jīng)及激素調(diào)節(jié)紊亂引起的，以高雄激素血癥及慢性不排卵為特征的疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)有4%～12%生育年齡女性患有PCOS，是目前無排卵型不孕癥的最主要原因[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，PCOS引起的不孕與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[2]，而子宮內(nèi)膜血管生成及相關(guān)血管生成因子的表達(dá)與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[3-4]。

低氧誘導(dǎo)因子家族（hypoxia-inducible factors，HIFs）是低氧誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的特異性蛋白家族，hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）即I類低氧誘導(dǎo)因子是HIFs成員，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境特異性表達(dá)的基因。低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α是調(diào)控子宮內(nèi)膜血管生成的重要調(diào)控因子。因此，檢測(cè)PCOS患者子宮內(nèi)膜HIF-1α表達(dá)情況可反應(yīng)子宮內(nèi)膜血管生成，可作為檢測(cè)子宮內(nèi)膜容受性重要指標(biāo)。本研究觀察PCOS患者子宮內(nèi)膜HIF-1α、VEGF表達(dá)情況，探討PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性改變引起的不孕之間的關(guān)系。

1 資料及方法

1.1 臨床資料選取2012年1月—2013年2月本院婦科門診就診多囊卵巢綜合征患者40例，符合2003年歐洲人類生殖和胚胎與美國生殖醫(yī)學(xué)會(huì)鹿特丹專家會(huì)議推薦標(biāo)準(zhǔn)：（1）稀發(fā)或無排卵；（2）高雄激素血癥或具有高雄激素的臨床表現(xiàn)；（3）B超顯示為多囊卵巢者（單側(cè)或雙側(cè)卵巢有＞12個(gè)直徑2～9mm的卵泡）；（4）凡具備以上3條中任意2條者，可診斷為多囊卵巢綜合征，并排除其他高雄激素血癥。40例患者均為已婚女性，年齡25～37歲，平均（31.5± 5.8）歲，不孕史3～7年，平均4.5年。同期因男性因素或輸卵管因素就診的不孕癥患者40例為對(duì)照組，年齡23～35歲，平均（32.5±5.4）歲。均為月經(jīng)周期正常；B超監(jiān)測(cè)有單卵泡成熟并排卵；基礎(chǔ)內(nèi)分泌檢查結(jié)果正常；婦科檢查及陰道B超未提示婦科器質(zhì)性病變存在；近3個(gè)月未用過激素類藥物。兩組患者年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑Trizol Reagent、QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購自Takara公司；anti-HIF-1α單克隆抗體購自美國CST公司；anti-VEGF單克隆抗體購自美國CST公司；羊抗兔二抗購于武漢博士德生物公司；RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織標(biāo)本的提取PCOS組：40例PCOS患者均應(yīng)用促排卵治療，月經(jīng)第12天開始陰道B超隔天監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育直至成熟卵泡排出，確定排卵日，促排卵治療方案包括：克羅米芬（CC）方案：CC 1天50～100mg，月經(jīng)第5天開始，連續(xù)使用5天，月經(jīng)第12天開始隔天B超監(jiān)測(cè)卵泡，至卵泡直徑18～20mm時(shí)，應(yīng)用HCG。對(duì)照組：采用自然周期陰道B超監(jiān)測(cè)排卵。經(jīng)患者知情同意，經(jīng)B超隔天監(jiān)測(cè)排卵，并確認(rèn)排卵后，排卵后5～7天經(jīng)嚴(yán)格消毒以小號(hào)刮匙于子宮前壁刮取內(nèi)膜組織約50mg，新鮮組織以凍存管分裝后立即置入液氮罐中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA采用液氮研磨法將組織磨成粉末，加入Trizol（Invitrogen）混合，按Trizol說明書抽提總RNA。利用在線Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，GC含量40%～60%，產(chǎn)物大小89～203bp，再用Oligo 6.0軟件評(píng)估。引物均跨內(nèi)含子以減少基因組DNA的干擾，由Invitrogen公司合成。引物序列：HIF-1α：forward primer，TCACCACAGGACAGTACAGGATGC；reverse primer，CCAGCAAAGTTAAAGCATCAGGTTCC。VEGF：forward primer，ACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG；reverseprimer，TTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG。 β-actin（β肌動(dòng)蛋白）：forward primer，TCATGAAGT GTGACGTTGACATCCGT；reverse primer，CCTAGAAG CATTTGCGGTGCACGATG。反應(yīng)在25μL的體系中進(jìn)行，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR 12.5μL、10μM的上下游引物各1μL、樣本cDNA 2μL（300ng）、RNA酶滅活水8.5μL。熱循環(huán)如下：94℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、60s，40個(gè)循環(huán)；72℃、10min。

1.3.3 Western blot組織細(xì)胞全蛋白提取用RIPA蛋白裂解液，置于冰上裂解30min，中間需反復(fù)振蕩蛋白裂解液，然后用BIO-RAD凝膠電泳系統(tǒng)，8% SDS-PAGE膠，電泳，恒壓100V，90min；轉(zhuǎn)膜，NC膜，恒壓100V，90min。用TBST配置的5%脫脂牛奶室溫封閉1h，然后用TBST配置的2%BSA按相應(yīng)濃度稀釋抗體，4℃輕搖孵育抗體過夜。第二天，回收一抗，TBST室溫洗膜10min，2次；用TBST配制的2% BSA按照1：5000稀釋二抗，NC膜室溫孵育二抗1h，然后TBST洗膜10min，2次。曝光過程由LANI2300曝光機(jī)完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCOS患者子宮內(nèi)膜組織VEGF和HIF-1α mRNA的表達(dá)目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量用以下公式計(jì)算：folds=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因）樣品組/（Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因）對(duì)照組[5]，得出VEGF和HIF-1α相對(duì)表達(dá)量即folds值。結(jié)果顯示，VEGF和HIF-1α相對(duì)表達(dá)量平均值分別為0.45±0.041和0.65±0.053，對(duì)照組VEGF和HIF-1α相對(duì)表達(dá)量均為1，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示PCOS組VEGF和HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1（封二）。

2.2 PCOS組患者子宮內(nèi)膜組織VEGF和HIF-1α蛋白的表達(dá)以β-actin作為內(nèi)參蛋白，PCOS組VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)分別為0.085±0.053和0.036±0.021，而對(duì)照組為0.25±0.015和0.096± 0.032，PCOS組中VEGF與HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2（封二）。

3 討論

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是目前無排卵型不孕癥的最主要原因。既往研究[6]多關(guān)注的是PCOS與肥胖、糖尿病、胰島素耐受等代謝性疾病的關(guān)系。近年子宮內(nèi)膜容受性的研究已成為PCOS不孕癥的研究熱點(diǎn)問題。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對(duì)于胚胎的接受程度，至今已發(fā)現(xiàn)多種因素與其相關(guān)，如細(xì)胞間黏附因子（整合素、選擇素等）[7]、孕激素[8]、性激素及細(xì)胞生長因子（白介素、轉(zhuǎn)化生長因子等）[9-12]。而子宮內(nèi)膜血管生成及相關(guān)血管生成因子的表達(dá)與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[3-4]。在子宮內(nèi)膜血管生成信號(hào)通路中，低氧誘導(dǎo)因子對(duì)血管生成及血管生成相關(guān)基因表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用[4]。

VEGF是一類血管生成因子，具有誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分裂，促使新生血管形成的作用。既往研究表明[13]在子宮內(nèi)膜癌及子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中VEGF特異性高表達(dá)，VEGF特異性高表達(dá)可顯著增加子宮內(nèi)膜血供，提供腫瘤及子宮內(nèi)膜異常增生所需的大量營養(yǎng)物質(zhì)，而在PCOS患者子宮內(nèi)膜組織中，VEGF出現(xiàn)特異性低表達(dá)，且VEGF特異性低表達(dá)與PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性及PCOS患者不孕密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者子宮內(nèi)膜組織中VEGF呈現(xiàn)特異性低表達(dá)，與既往研究符合。

低氧誘導(dǎo)因子家族（hypoxia-inducible factors，HIFs）是低氧誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的特異性蛋白家族，編碼一類轉(zhuǎn)錄激活因子，參與細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧多種生理生化過程，調(diào)控特異性基因的表達(dá)過程。研究顯示，HIF-1α在人體組織新生血管形成過程中發(fā)揮重要作用。HIF-1α是調(diào)控子宮內(nèi)膜血管生成的重要調(diào)控因子，可直接調(diào)控VEGF的表達(dá)。既往報(bào)道指出[15]，在肝癌細(xì)胞中，由于腫瘤細(xì)胞特殊代謝通路及腫瘤細(xì)胞特殊微環(huán)境，誘導(dǎo)激活HIF-1α的表達(dá)并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，HIF-1α與PCG家族蛋白Cbx4結(jié)合（一類E3泛素連接酶）形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而啟動(dòng)VEGF的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，加速肝癌組織血管生成過程，刺激肝癌細(xì)胞分裂增殖；而在骨肉瘤細(xì)胞中[16]，利用HIF-1α特異性siRNA敲除HIF-1α基因，VEGF在mRNA水平顯著下調(diào)。本研究檢測(cè)的HIF-1α在低氧環(huán)境中特異性高表達(dá)，在正常氧壓環(huán)境中，HIF-1α羥基化，但是在低氧條件下，由于HIF-1α羥基化介導(dǎo)的降解通路被阻斷，HIF-1α基因在細(xì)胞核內(nèi)累積，細(xì)胞產(chǎn)生一系列HIF-1α依賴的應(yīng)對(duì)低氧的生理生化反應(yīng)。在血管生成信號(hào)通路中，HIF可通過激活PI3K/AKT、MEK等通路調(diào)控血管生成細(xì)胞的增殖、遷移，調(diào)節(jié)血管內(nèi)滲透壓及血管生成趨向性[17]。

綜上所述，PCOS不孕不育患者子宮內(nèi)膜HIF-1α和VEGF表達(dá)都出現(xiàn)顯著下調(diào)，結(jié)合既往研究，我們目前考慮PCOS不孕不育患者子宮內(nèi)膜中HIF-1α可調(diào)控VEGF的表達(dá)，HIF-1α和VEGF表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致患者子宮內(nèi)膜血管生成受阻，從而影響內(nèi)膜容受性及胚胎著床過程，造成PCOS患者不孕不育。但是PCOS不孕不育患者子宮內(nèi)膜HIF-1α調(diào)控VEGF的具體過程，還需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

［1］Michael T Sheehan.Polycystic ovarian syndrome：diagnosis and management［J］.Clin Med Res，2004，2（1）：13-27.

［2］Lopes IM，Baracat MC，Simoes Mde J，et al.Endometrium in women with polycystic ovary syndrome during the window of implantation［J］.Rev Assoc Med Bras，2011，57（6）：702-709.

［3］Peitsidis P，Agrawal R.Role of vascular endothelial growth factor in women with PCO and PCOS：a systematic review［J］.Reprod Biomed Online，2010，20（4）：444-452.

［4］Hirota K，Semenza GL.Regulation of angiogenesis by hypoxia-inducible factor 1［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2006，59（1）：15-26.

［5］Abdelmohsen K，Hutchison ER，Lee EK，et al.MiR-375 inhibits differentiation of neurites by lowering HuD Levels［J］. Molecular and cellular biology，2010，30（17）：4197-4210.

［6］Cussons AJ，Stuckey BG，Walsh JP，et al.Polycystic ovarian syndrome：marked differences between endocrinologists and gynaecologists in diagnosis and management［J］.Clin Endocrinol（Oxf），2005，62（3）：89-95.

［7］Giudice LC.Endometrium in PCOS：Implantation and predisposition to endocrine CA［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2006，20（2）：235-244.

［8］Usadi RS，Legro RS.Reproductive impact of polycystic ovary syndrome［J］.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2012，19（6）：505-511.

［9］Kolbus A，Walch K，Nagele F，et al.Interleukin-1 alpha but not interleukin-1 beta gene polymorphism is associated with polycystic ovary syndrome［J］.J Reprod Immunol，2007，73（2）：188-193.

［10］Raja-Khan N，Urbanek M，Rodgers RJ，et al.The role of TGF-beta in polycystic ovary syndrome［J］.Reprod Sci，2014，21（1）：20-31.

［11］Barreca A，Del Monte P，Ponzani P，et al.Intrafollicular insulin-like growth factor-II levels in normally ovulating women and in patients with polycys－tic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，1996，65（4）：739-745.

［12］Sahin SB，Ayaz T，Cure MC，et al.Fibroblast growth factor 21 and its relation to metabolic parameters in women with polycystic ovary syndrome［J］.Scand J Clin Lab Invest，2014，74（6）：465-469.

［13］Dobrzycka B，Terlikowski SJ，Kwiatkowski M，et al.Prognostic significance of VEGF and its receptors in endometrioid endometrial cancer［J］.Ginekol Pol，2010，81（6）：422-425.

［14］唐智華，楊雪峰.多囊卵巢綜合征患者著床窗口期子宮內(nèi)膜VEGF、MIF的表達(dá)及意義［J］.中國婦幼保健，2011， 26（5）：737-739.

［15］Li J，Xu Y，Long XD，et al.Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity［J］.Cancer Cell，2014，25（1）：118-131.

［16］Wu Q，Yang SH，Wang RY，et al.Effect of silencing HIF-1alpha by RNA interference on expression of vascular endothelial growth factor in osteosarcoma cell line SaOS-2 under hypoxia［J］.Ai Zheng，2005，24（5）：531-535.

［17］Karar J，Maity A.PI3K/AKT/mTOR Pathway in Angiogenesis［J］.Front Mol Neurosci，2011，4（51）：1-8.

（收稿：2015-10-17修回：2016-03-11）

Expression of HIF-1in Polycystic Ovary Syndrome Patients and Its Relationship with Endometrial Receptivity

JIN Weiwei,CAI Pingsheng,FANG Yiping,YAO Rui.Department of Obstetrics and Gynecology,WenzhouHospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Wenzhou(325000),China

ObjectiveTo determine the level of of hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in endometrium from polycystic ovary syndrome（PCOS）patients.MethodsForty women with PCOS-induced sterility and another 40 women with infertility due to male factor or fallopian tube factor were enrolled in this study.The relative expressions of HIF-1 and VEGF mRNA and protein in endometrial tissues from two groups were detected by real-time quantitative PCR and Western blot,respectively.ResultsThe expressions of HIF-1 and VEGF mRNA in PCOS patients were significantly higher than that in the other group（HIF-1：0.45± 0.041 vs 1;VEGF：0.65±0.053 vs 1;all P＜0.01）;the expressions of proteins were in the same pattern（HIF-1：0.085±0.053 vs 0.25±0.015;VEGF：0.036±0.021 vs 0.096±0.032;all P＜0.01）.ConclusionThe expressions of HIF-1and VEGF in PCOS women are declined.

polycystic ovary syndrome;endometrial receptivity;HIF-1;VEGF

浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科（溫州325000）

蔡平生，Tel：13757890261；E-mail：462080386@qq.com