PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS的相關性研究

劉元偉 鄧妙 岑加萍 張紅艷 張治芬

●論 著

PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS的相關性研究

劉元偉 鄧妙 岑加萍 張紅艷 張治芬

目的 探討纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族多囊卵巢綜合征（PCOS）發(fā)病、胰島素抵抗及肥胖的關系。方法選擇浙江地區(qū)漢族PCOS患者120例和健康對照者102例，分別測量兩組身高、體重、腰圍，并計算BMI和腰臀比；采用PCR技術檢測兩組PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性分布；采用ELISA法檢測PCOS患者空腹胰島素，采用葡萄糖氧化酶法檢測PCOS患者空腹血糖，并計算胰島素抵抗指數（Homa-IR）。再根據BMI、Homa-IR將PCOS患者分為肥胖組（54例）與非肥胖組（66例），以及胰島素抵抗組（49例）與非胰島素抵抗組（71例），分別比較兩組基因型頻率。結果PCOS患者組PAI-1基因啟動子區(qū)4G/4G基因型頻率明顯高于健康對照組（P＜0．05）。PCOS患者PAI-1基因啟動子區(qū)4G/4G基因型頻率為胰島素抵抗者、非肥胖者分別高于非胰島素抵抗者、肥胖者（P＜0．05）。結論PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族PCOS發(fā)病、胰島素抵抗及肥胖有關；其中4G/4G基因型可能是PCOS發(fā)病、PCOS患者胰島素抵抗的危險因素，且可能影響非肥胖型PCOS患者病情發(fā)展。

多囊性卵巢綜合征 纖溶酶原激活物抑制劑1 基因多態(tài)性胰島素抵抗 肥胖

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種復雜的神經內分泌、代謝系統(tǒng)和卵巢局部調控因素異常的異質性疾病，主要病理生理機制是高胰島素血癥和胰島素抵抗，在育齡期女性中發(fā)病率為4%～18%，在無排卵性不育癥患者中發(fā)病率高達30%～60%[1-2]，臨床上主要表現為不同程度的月經異常、不孕、多毛、痤瘡、肥胖等[2-3]。PCOS確切病因尚未明確，有研究認為PCOS患者存在一定的血栓傾向，纖溶系統(tǒng)受損是重要原因，其中血漿纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）與PCOS發(fā)生、發(fā)展密切相關[4]。有研究表明PCOS患者PAI-1水平明顯高于正常組。PAI-1是纖溶系統(tǒng)活性的主要調控者，是防止血栓形成的重要保護機制，在胰島素抵抗狀態(tài)下，高胰島素血癥與PAI-1水平升高、活性增強同時存在[4-5]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，研究發(fā)現PAI-1基因啟動子區(qū)域一個堿基插入或缺失，均會影響PAI-1水平及活性，其中4G/ 4G基因型會升高PAI-1水平及活性，促進PCOS、糖尿病、冠心病和心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[4-7]。本研究旨在探討浙江地區(qū)漢族PCOS患者PAI-l基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS發(fā)病、胰島素抵抗及肥胖的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2013年6月至2014年6月在杭州市第一人民醫(yī)院婦科門診就診的PCOS患者120例為PCOS組；選擇同期健康體檢婦女102例作為健康對照組；PCOS診斷標準參照2003年歐洲人類生殖協會和美國生殖協會共同推薦的診斷標準[8]。PCOS組與健康對照組均排除高血壓、下丘腦性閉經、卵巢腫瘤、感染和自身免疫性疾病；接受試驗前3個月未使用影響生殖激素、胰島素、血糖、血脂等藥物，未實行計劃性減肥，無手術及創(chuàng)傷史，無影響凝血功能改變的疾??；所有對象均為漢族，無親緣關系。參照2000年WHO制定的亞太地區(qū)診斷標準（BMI≥25 kg/m2為肥胖），將PCOS患者分為肥胖組54例和非肥胖組66例。采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數（Homa-IR）評估胰島素敏感性（Homa-IR≥2.0為胰島素抵抗），并將PCOS患者分為胰島素抵抗組49例和非胰島素抵抗組71例。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集空腹靜脈血，離心，分別提取血漿和血細胞，分離血漿用于檢測空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS），要求所有受試者在采血前晚低糖、低脂飲食，采血當日清晨空腹。

1.2.2 體格測量 測量身高、體重、臀圍、腰圍。BMI=體重/身高2；腰臀比=腰圍/臀圍。

1.2.3 生化檢測 采用ELISA法檢測FINS，采用葡萄糖氧化酶法檢測FBG；均由我院中心實驗室檢測。

1.2.4 基因分析 （1）細胞DNA的提?。菏褂肈NA純化試劑盒（美國AXYGEN公司）抽提DNA；（2）PCR法目的片段擴增；（3）引物設計：參照文獻設計PCR引物序列（上海輝睿生物科技有限公司），PAI-1基因啟動子區(qū)引物序列：①5G引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGG-3′；②4G引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGA-3′；③共同下游引物序列：5′-CAGGTCACTGTGGAGTTATC-3′；④陽性對照上游引物：5′-AGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3′。4G和5G分別在2個反應體系中進行：一管加入引物①、③、④；另一管加入引物②、③、④。經PCR反應、瓊脂糖凝膠電泳，電泳分型：含4G、5G的PCR產物長度均為135bp，陽性對照段PCR產物長為256bp，若只出現4G則為4G/4G基因型；只出現5G則為5G/ 5G基因型；4G、5G同時出現為4G/5G基因型。由于本研究5G/5G基因型較少，故將4G/5G和5G/5G合并為5G基因型、4G/4G基因型作為4G基因型進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS發(fā)病的關系 PCOS組與健康對照組平均年齡為（24.10±5.51）、（26.10±5.21）歲，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兩組患者BMI分別為（24.62±8.07）、（21.03±4.96）kg/m2，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。222例漢族婦女基因分析結果顯示，PAI-1基因啟動子區(qū)4G基因型頻率為42.79%（95/222），5G基因型頻率為57.21%（127/222）；其中PCOS組與健康對照組5G基因型頻率分別為53.33%（64/120）和61.76%（63/102）；4G基因型頻率分別為46.67%（56/120）和38.24%（39/102），兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 PAI-l基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與胰島素抵抗的關系 胰島素抵抗組與非胰島素抵抗組PCOS患者腰臀比分別為0.83±0.45、0.79±0.12，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兩組患者BMI分別為（25.14±4.76）、（23.26±1.97）kg/m2，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩組患者Homa-IR分別為2.71±0.81、1.98±0.54，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。胰島素抵抗組與非胰島素抵抗組5G基因型頻率分別為48.98%（24/49）和56.34%（40/71）；4G基因型頻率分別為51.02%（25/49）和43.66%（31/71），兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與肥胖的關系 肥胖組BMI、腰臀比和Homa-IR分別為（28.3± 3.0）kg/m2、0.87±0.14和2.6±1.3，均分別高于非肥胖組（22.1±1.2）kg/m2、0.81±0.06和2.1±0.9，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。肥胖組與非肥胖組5G基因型頻率分別為59.26%（32/54）和48.48%（32/66）；4G基因型頻率分別為40.74%（22/54）和51.52%（34/66），兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

PAI-1基因啟動子區(qū)上游675堿基位點上存在鳥嘌呤插入或缺失，表現出4G/4G、4G/5G和5G/5G等3種基因型；而PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與血漿PAI-1水平升高、活性增高有關。4G等位基因附近只有轉錄激活物作用位點；5G等位基因附近不僅有轉錄激活物作用位點，還有轉錄抑制物作用位點；因此，4G等位基因轉錄活性高于5G等位基因。

PCOS患者血漿PAI-1活性明顯增高，可能與PAI-1 4G等位基因密切相關，因此推測PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS發(fā)病有關。目前國內外相關研究存在爭議：Sales等[9]對巴西地區(qū)PCOS患者與健康對照人群各79例進行PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性檢測，PCOS組4G/4G基因型頻率明顯高于健康對照組，但兩組間4G/5G、5G/5G基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義，提示4G基因型可能與PCOS發(fā)病相關。Kilicci等[10]對土耳其地區(qū)PCOS患者與健康對照組各100例的相同基因位點進行基因型檢測，兩組間4G、5G等位基因和3種基因型頻率差異均無統(tǒng)計學意義。國內研究發(fā)現PCOS患者PAI-1基因啟動子區(qū)4G/4G基因型頻率明顯高于健康人群，5G/5G基因型頻率低于健康人群，亦提示4G基因型可能與PCOS發(fā)病有關[11-12]。Lee等[13]報道在歐洲、土耳其及亞洲人群中，PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS易感性顯著相關。Liu等[14]報道在亞洲人群中PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS發(fā)病具有明顯相關性，但在高加索人群中差異無統(tǒng)計學意義；提示PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性分布存在種族和地域的差異。本研究對浙江地區(qū)漢族PCOS患者PAI-1基因型進行檢測，發(fā)現PCOS組以4G基因型為主，健康對照組以5G基因型為主，提示4G基因型可能與浙江地區(qū)漢族PCOS發(fā)病有關；但本研究PCOS組與健康對照組間BMI差異有統(tǒng)計學意義，不能排除BMI對PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性分布的影響。

胰島素可激活人肝癌細胞株HepG2細胞的信號轉導系統(tǒng)，從而影響PAI-1的生物合成；這揭示了胰島素誘導下絲裂原活化蛋白激酶的激活對PAI-1的調節(jié)作用。Lopez-Alemany等[15]首次在研究中提及PAI-1與胰島素信號轉導的關系，以及αvβ3整合素對胰島素信號轉導而起到調節(jié)作用；PAI-1與αvβ3整合素競爭，與玻璃體結合蛋白結合，在小鼠胚胎成纖維細胞中PAI-1阻止αvβ3整合素與胰島素轉導的協同作用，減弱胰島素誘導的蛋白激酶B磷酸化作用，使得血管內皮生長因子表達和細胞遷移，進一步加重胰島素抵抗。PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性通過升高血漿PAI-1水平及活性，從而影響胰島素的敏感性，與胰島素抵抗密切相關。胰島素抵抗是PCOS重要的生理、病理機制，且PCOS患者存在纖溶系統(tǒng)失衡、血漿PAI-1水平升高等，間接提示PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性可能與PCOS患者胰島素抵抗有關。本研究發(fā)現PCOS胰島素抵抗組4G/4G基因型頻率明顯高于非胰島素抵抗組，差異有統(tǒng)計學意義；這提示PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS患者胰島素抵抗存在一定聯系。Sales等[9]在探討PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS的關系中指出，PCOS患者PAI-1水平為4G/4G基因型高于4G/5G、5G/5G基因型，且與胰島素抵抗的發(fā)生有關，與本研究結果一致。

近年來研究表明，脂肪組織分泌的多種細胞因子可促進PAI-1合成，推測PAI-1與肥胖關系密切[16]。Ma等[17]一項動物研究發(fā)現，缺乏PAI-1的老鼠可完全防止肥胖的發(fā)生，提示PAI-1與肥胖可能存在直接的因果關系。Tarkun等[18]研究發(fā)現PCOS患者無論是否肥胖，PAI-1水平及活性均明顯升高；瘦型PCOS患者PAI-1水平及活性升高不依賴于BMI，與胰島素抵抗直接相關。趙君利等[19]研究表明PCOS肥胖患者的Homa-IR、BMI和腰臀比均高于非肥胖者，肥胖者的Homa-IR低于非肥胖者，這說明肥胖者胰島素抵抗程度較非肥胖者嚴重，而非肥胖患者PAI-1基因啟動子區(qū)4G基因型頻率高于肥胖者。本研究發(fā)現PCOS肥胖患者BMI、Homa-IR均明顯高于非肥胖者，表明PCOS肥胖患者胰島素抵抗程度明顯高于非肥胖者；非肥胖者4G/4G基因型頻率明顯高于肥胖組。以上結果與Tarkun等[18]、趙君利等[19]報道一致。因此，我們推測4G基因型可能是PCOS非肥胖患者血漿PAI-1水平及活性升高的重要因素，肥胖和胰島素抵抗可能是影響PCOS肥胖患者PAI-1水平及活性的重要因素。此外，本研究發(fā)現PCOS患者4G/ 4G基因型頻率為胰島素抵抗組高于非胰島素抵抗組、非肥胖組高于肥胖組，差異均有統(tǒng)計學意義，可能是本研究樣本量偏小、PCOS患者非肥胖且胰島素抵抗患者的比例偏高所致。因此，重視PCOS肥胖患者的體重控制外，應長期監(jiān)測帶有4G基因型的PCOS非肥胖患者的Homa-IR及PAI-1水平，并及時關注血糖、纖溶凝血系統(tǒng)等改變，這對預防糖尿病、心腦血管疾病等遠期并發(fā)癥具有重要意義。

綜上所述，PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族PCOS的發(fā)病有關，而4G/4G基因型可能是PCOS發(fā)病的危險因素。4G/5G基因型分布與PCOS胰島抵抗、肥胖等因素有關，其中4G/4G基因型可能是影響浙江地區(qū)漢族PCOS患者糖代謝異常發(fā)生、PCOS非肥胖患者病情發(fā)展的危險因素。因此，對不利基因型個體進行隨訪與深入研究，將有利于PCOS患者的防治。此外，我們認為測定血漿PAI-1水平對早期發(fā)現血栓前狀態(tài)、早期預防和早期治療，提高PCOS患者遠期生存質量具有良好的指導作用。

[1] Li R,Zhang Q,Yang D,et al．Prevalence of polycystic ovary syndrome in women in China:a large community-based study[J]．Human Reproduction,2013,28(9):2562-2569．

[2] 華克勤,豐有吉．實用婦產科學[M]．北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:430-431．

[3] 王麗娜,李美芝．與卵巢疾病有關的綜合征-多囊卵巢綜合征的臨床診斷和治療[J]．中國實用婦科與產科雜志,2006,22(5):325-327．

[4] Orio F Jr,Palomba S,Cascella T,et al．Is plasminogen activator inhibitor-1 a card-iovascular risk factor in young women with polycysticovarysyndrome?[J]．RrprodBiomedOnline,2004,9:505-510．

[5] Furumoto,Tomoo,Fujii Satoslli,et al．Maladaptive arterial remodeling with systemic hypertension associated with increased concentrations in blood of plasminogen activator inhibitortype-l (PAI-1)[J]．TheAmericanJournalof Cardiology,2014(93):997-1001．

[6] Diamanti-Kandarakis E,Palioniko G,Alexandraki K,et al．The prevalence of 4G/5G polymorphism of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)gene in polycystic ovarian syndrome and its association with plasma PAI-1 levels[J]．Eur J EndocrInol,2004,15: 793-798．

[7] Glueck C J,Sieve L,Zhu B,et al．Plasminogen activator inhibitor activity,4G/5G polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-l gene,and first-trimester miscarriage in women with polycystic ovary syndrome[J]．Metabolism,2006,55:345-352．

[8] Fr D D,Tarlatzis R．Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome [J]．Fertil Steril,2004,81(1):19-25．

[9] Sales M F,Sóter M O,Candido A L,et al．Correlation between plasminogen activeateor inhibitor-1 (PAI-1)promoter 4G/5G polymorphism and metabolic/proinflammatory factors in polycystic ovary syndrome[J]．Gynecological Endocrinology,2013,29(10): 936-939．

[10] Kilicci C,Bayram B,Ozkurt M,et al．Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 Gene 4G/5G Polymorphism and Polycystic Ovary Syndrome[J]．Genetic Testing and Molecular Biomarkers,2013, 15(7-8):565-567．

[11] 莊朝輝,沈宗姬,黃亞珍,等．PAI-1基因4G/5G多態(tài)性與肥胖型多囊卵巢綜合征的相關性研究[J]．中國醫(yī)學創(chuàng)新,2013,10(21):1-3．

[12] 張朝暉,楊金蘭,田玉栓,等．PAI-1基因多態(tài)性與多囊卵巢綜合征的研究[J]．中國婦幼健康研究,2008,19(6):541-543．

[13] Lee Y H,Song G G．Plasminogen activator inhibitor-1 4G/5G and the MTHFR 677C/T polymorphis-ms and susceptibility to polycystic ovary syndrome:a meta-analysis[J]．Obstet Gynecol Reprod Biol,2014,175(4):8-14．

[14] Liu Y,Sun M G,Jiang R,et al．Plasminogen Activator Inhibitor-1-675 4G/5G Polymorphism and Polycystic Ovary Syndrome Risk:A Meta Analysis[J]．Assist Reprod Genet,2014,31 (3):363-370．

[15] Lopez-Alemany R,Redondo J M,Nagamine Y,et al．Plasminogen activator inhibitor type-1 inhibits insulin signaling by competing with alphavbeta3 integrin for vitronectin binding[J]．Eur J Biochem,2003,270(5):814-821．

[16] Michalska M,Iwan-Zie tek I,Gnilka W,et al．PAI-1 and a2-AP in Patients with Morbid Obesity[J]．Clin Exp Med,2013,22(6):801-807．

[17] Ma L J,Mao S L,Taylor K L,et al．Prevention of obesity and insulin resistance in mice lacking plasminogen activator inhibitor 1 [J]．Diabetes,2004,53(2):336-346．

[18] Tarkun I,Canturk Z,Arslan B C,et al．The plasminogen activator system in young and lean women with polycystic ovary syndrome[J]．Endocr J,2014,51(5):467-472．

[19] 趙君利,陳子江,趙躍然,等．纖溶酶原激活物抑制因子1基因啟動子區(qū)4G和5G多態(tài)基因型分布及其多囊卵巢綜合征的相關性研究[J]．中華婦產科雜志,2005,40:528-531．

Correlation of 4G/5G polymorphism of plasminogen activator inhibitor-1 gene promoter region with polycystic ovarian syndrome

LIU YuANWEI. DENG Miao. CEN Jiaping. et al. Department of Gynecology. Hangzhou Women's Hospital. Hangzhou 310008. China

Objective To investigate the correlation of 4G/5G polymorphism of plasminogen activator-1(PAI-1)gene promoter region with polycystic ovary syndrome(PCOS)in Zhejiang Han population．MethodsOne hundred and twenty patients with PCOS and 102 healthy women(control group)were enrolled from Zhejiang Han population．Body mass index(BMI)and waist-to-hip ratio(WHR)were determined．The 4G/5G polymorphism of the PAI-1 gene promoter region was amplified by the polymerase chain reaction(PCR)．Blood samples of PCOS patients were obtained,fasting insulin was detected by ELISA and fasting glucose was measured by glucose oxidase method,and insulin resistance index(Homa-IR)was calculated．Based on the BMI,PCOS patients were divided into obese(n=54)and non-obese(n=66)groups．Based on Homa-IR,the patients were divided into insulin resistant(IR,n=49)and non-IR(n=71)groups．ResultsThe rate of PAI-1 gene promoter region 4G/4G genotype was significantly higher in the PCOS patients than that in control group(P＜0．05)．The rate of 4G/4G genotype was significantly higher in the IR and non-obese groups than that in non-IR and obese groups(P＜0．05)．ConclusionThe genotype 4G/4G in PAI-1 gene promoter region may be associated with the pathogenesis of PCOS in Zhejiang Han population,which may be involved in the development of IR and PCOS,especially in non-obese patients．

Polycystic ovary syndrome Plasminogen activator inhibitor-1 Gene polymorphism Insulin resistance Obese

2015-04-20）

（本文編輯：陳丹）

浙江省科技計劃項目（2009C33114）

310008 杭州市第一人民醫(yī)院集團杭州市婦產科醫(yī)院婦產科

張治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn