CML66在腎癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

汪寧 鐘歡 陳曉農(nóng) 湯建兒 陳煜 高建國(guó) 王榮江

CML66在腎癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

汪寧 鐘歡 陳曉農(nóng) 湯建兒 陳煜 高建國(guó) 王榮江

目的 探究慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤抗原66（CML66）在腎腫瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組化法檢測(cè)155例腎癌組織及其癌旁正常腎臟組織、36例腎血管平滑肌脂肪瘤組織中CML66蛋白的表達(dá)，分別比較腎癌組織與癌旁正常腎臟組織、腎血管平滑肌脂肪瘤組織的CML66陽性表達(dá)率，并分析腎癌組織CML66陽性表達(dá)率與臨床特征的關(guān)系。結(jié)果腎癌組織中CML66陽性表達(dá)率為83．9%，明顯高于癌旁正常腎臟組織的35．5%（P＜0．05）；但與腎血管平滑肌脂肪瘤組織的80．6%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。腎癌組織病理分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66陽性表達(dá)率均分別高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)/期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論CML66在腎癌組織中高表達(dá)有助于明確診斷，可作為評(píng)估腎癌病理分級(jí)、臨床分期的指標(biāo)，可能對(duì)腎癌術(shù)后輔助治療有一定的參考價(jià)值。

慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤抗原66 腎癌 免疫組化

目前腎癌的治療方式仍以根治性手術(shù)為主，腎癌對(duì)放化療不敏感，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移后預(yù)后較差，因此尋找敏感的腎癌標(biāo)志物以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤與判斷患者預(yù)后，從而指導(dǎo)個(gè)體化治療具有重要臨床意義。慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤抗原66（CML66）是一種廣譜腫瘤抗原或癌基因。最早它是通過重組cDNA表達(dá)文庫血清分析技術(shù)從慢性粒細(xì)胞性白血病患者血清中篩選出來的一種具有廣泛免疫原性的腫瘤抗原，相對(duì)分子質(zhì)量為66kDa，在人類染色體中位于8q 23.3，除了在慢性粒細(xì)胞性白血病中高表達(dá)，還表達(dá)于肺癌、黑色素瘤、前列腺癌組織及瘤細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)腎癌組織中CML66的表達(dá)，分別與癌旁正常腎臟組織、腎血管平滑肌脂肪瘤組織進(jìn)行比較，并探討腎癌組織CML66陽性表達(dá)率與臨床特征的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 以2009年4月至2014年4月湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的155例腎癌組織及距離腫瘤邊緣4cm以上的正常腎臟組織、36例腎血管平滑肌脂肪瘤組織為研究對(duì)象，均經(jīng)病理證實(shí)。腎癌患者中男89例，女66例；年齡33～83歲，平均（58.9± 11.6）歲；透明細(xì)胞癌60例，腎盂尿路上皮癌24例，嫌色細(xì)胞癌15例，乳頭狀癌10例，嗜酸細(xì)胞癌13例，混合癌9例，腺癌11例，囊性腎癌13例；左側(cè)75例，右側(cè)80例；采用1997年WHO分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行病理分級(jí)：Ⅰ、Ⅱ級(jí)83例，Ⅲ、Ⅳ級(jí)72例；采用2009年AJCC腎癌分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期97例，Ⅲ、Ⅳ期58例。所有腎癌患者手術(shù)前均未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，均無其他惡性腫瘤病史，術(shù)前均未接受過放化療或免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 CML66多克隆抗體購自英國(guó)Abcam公司；山羊血清、兔超敏免疫組化檢測(cè)試劑、DAB顯色試劑均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2.2 標(biāo)本采集 所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋常規(guī)脫水，每個(gè)石蠟切片選取最佳切取部位切片3～4張，制成厚4μm，HE染色。

1.2.3 免疫組化 切片組織滴加一抗CML66（1∶1 000），孵育、清洗，滴加二抗孵育、清洗、DAB顯色、終止反應(yīng)、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察、拍照。以已知腎腫瘤標(biāo)本切片作為陽性對(duì)照，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 結(jié)果判定 CML66陽性染色主要定位于腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)，根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度及其所占實(shí)質(zhì)細(xì)胞的百分比進(jìn)行半定量結(jié)果判斷：（1）先根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；（2）每張切片上觀察5個(gè)視野（×100），再根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)所占實(shí)質(zhì)細(xì)胞的百分比評(píng)分：陰性0分，＜10%為1分，10%～為2分，50%～為3分，≥75%為4分。以上2項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘所得為陽性等級(jí)：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++）；9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CML66在腎癌組織及其癌旁正常腎臟組織中的表達(dá) CML66在腎透明細(xì)胞癌中呈陽性表達(dá)，見圖1；在癌旁正常腎臟組織中呈陰性或弱陽性表達(dá)，見圖2。CML66蛋白主要定位于腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)，其中腎小管、集合管呈陽性表達(dá)，腎小球呈陰性表達(dá)。

圖1 CML66在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)（HE染色，×100）

圖2 CML66在癌旁正常腎臟組織中的表達(dá)（HE染色，×100）

2.2 腎癌組織與癌旁正常腎臟組織中CML66陽性表達(dá)率的比較 腎癌組織中CML66陽性表達(dá)率為83.9%，明顯高于癌旁正常腎臟組織的35.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 腎癌組織與癌旁正常腎臟組織中CML66陽性表達(dá)率的比較[例（%）]

2.3 腎癌組織與腎血管平滑肌脂肪瘤組織CML66陽性表達(dá)率的比較 腎血管平滑肌脂肪瘤組織中CML66陽性表達(dá)率為80.6%（29/36），與腎癌組織（83.9%）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 腎癌組織中CML66陽性表達(dá)率與臨床特征的關(guān)系 腎癌組織病理分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66陽性表達(dá)率均分別高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)/期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

基因序列分析發(fā)現(xiàn)，線蟲、果蠅和小鼠均有與CML66基因同源的序列存在，特別是在小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)的序列，其同源性高達(dá)92%。諾瑟雜交法檢測(cè)結(jié)果表明，CML66在人體睪丸正常組織中高表達(dá)、心臟略有表達(dá)，其余均不表達(dá)，因此被認(rèn)為是一種廣譜腫瘤抗原或癌基因[1]。重組cDNA表達(dá)文庫血清學(xué)分析篩選卵巢癌文庫時(shí)發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者中存在CML66抗體，原核表達(dá)CML66蛋白，ELISA、Western blot和斑點(diǎn)印跡檢測(cè)結(jié)果均為腫瘤患者CML66血清水平明顯高于正常人。本次研究顯示，CML66在癌旁正常腎臟組織中呈陰性或弱陽性表達(dá)，而在腎癌組織中呈陽性表達(dá)；這提示CMLL66作為一種癌基因，參與腎癌的發(fā)生、發(fā)展。CML66在腎血管平滑肌脂肪瘤與腎癌組織中的陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這提示CML66不能作為區(qū)別腎臟良惡性變的敏感性指標(biāo)。Wang等[2]采用RNA干擾技術(shù)低表達(dá)CML66，導(dǎo)致宮頸癌Hela細(xì)胞失去增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力；這提示CML66不僅是一種腫瘤抗原標(biāo)志物，還可能作為一種癌基因直接調(diào)控腫瘤進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)CML66具有免疫原性，在相關(guān)腫瘤患者血清中可測(cè)到其相應(yīng)抗體，因此可作為相關(guān)腫瘤免疫診斷與治療的指標(biāo)[1]。

表2 腎癌組織中CML66陽性表達(dá)率與臨床特征的關(guān)系[例（%）]

CML66作為原癌基因，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CML66可與LIS1和Dynein形成復(fù)合體，參與由Dynein介導(dǎo)的染色體分離和胞質(zhì)分裂[3-5]；RNAi介導(dǎo)的CML66表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致多種形態(tài)的異常細(xì)胞分裂，如細(xì)胞分裂中期染色體的異常排列、細(xì)胞出現(xiàn)多個(gè)分裂極、出現(xiàn)多核細(xì)胞[3-4]，而這正是腫瘤早期發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。本研究結(jié)果顯示，CML66在腎癌組織中高表達(dá)，與病理分級(jí)、臨床分期有關(guān)，腎癌組織病理分級(jí)Ⅲ、Ⅳ級(jí)，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66陽性表達(dá)率均分別高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)/期；這提示高表達(dá)CML66可能促進(jìn)腎癌細(xì)胞浸潤(rùn)，其表達(dá)程度可能可以預(yù)測(cè)腎癌預(yù)后。2項(xiàng)基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)CML66基因在肺癌原發(fā)灶[6]和肺癌骨微轉(zhuǎn)移灶[7]中上調(diào)，提示CML66可作為腫瘤早期和早期微轉(zhuǎn)移的評(píng)估指標(biāo)。表2提示腎癌組織中CML66陽性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，可能與本研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)偏少有關(guān)。

本研究推測(cè)，隨著腎癌病理分級(jí)、臨床分期的提高，CML66蛋白表達(dá)量不斷增加，且參與細(xì)胞惡性演變過程。但CML66在腎血管平滑肌脂肪瘤中亦呈陽性表達(dá)，因此有必要擴(kuò)大樣本量并進(jìn)一步研究CML66在腎癌中上調(diào)的遺傳學(xué)機(jī)制、對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及具體信號(hào)通路，以期為腎癌的早期診斷和治療提供新的分子靶標(biāo)。

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Expression of CML66 in renal carcinoma and its clinical significance

WANG Ning. ZHONG Huan. CHEN Xiaonong. et al. Department of Urology. the First Affiliated Hospital of Huzhou Normal College. Huzhou 313000. China

Objective To investigate the expression of CML66 in renal carcinoma and its clinical significance．MethodsThe expression of CML66 in 155 samples of renal cell carcinoma and its adjacent normal tissue and 36 samples of renal angiomyolipoma were detected by immunohistochemical method．The relationship between CML66 expression and clinical charactenristics of renal cell carcinorma was analyzed．ResultsThe positive expression rates of CML66 in renal cell carcinoma was 83．9%,significantly higher than the adjacent normal renal tissue(P＜0．05),but there was no significant difference in CML66 expression between renal cell carcinoma and renal angiomyolipoma(P＞0．05)．The positive expression rates of CML66 in renal cell carcinoma of pathological grade and clinical stagesⅢ/Ⅳwere significantly higher than those in gradeⅠ/Ⅱrenal carcinoma (P＜0．05)．ConclusionOverexpression of CML66 may be used as an indicator for diagnosis of renal cell carcinoma and evaluation of pathological grade and clinical stages．

CML66 Renal tumorImmunohistochemical method

2016-02-25）

（本文編輯：陳丹）

湖州市科技局公益性重點(diǎn)項(xiàng)目（2014GZB03）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃骨干人才項(xiàng)目（2016RCB019）

313000 湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科

王榮江，E-mail：wn6530289162@163.com