基于新一代高通量測(cè)序技術(shù)分析拮抗酵母Cryptoccocus laurentii誘 導(dǎo)處理櫻桃番茄果實(shí)后轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化

唐 瓊，鄭曉冬*

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

櫻桃番茄是世界范圍內(nèi)最重要的果蔬作物與模式植物之一[1]，造成其采后病害的主要微生物是灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和鏈格孢（Alternaria alternata），它們可能會(huì)長(zhǎng)時(shí)間潛伏在果實(shí)表面，直到果實(shí)成熟、衰老或通過(guò)果實(shí)的機(jī)械傷口侵染果實(shí)組織，一般情況下，病原菌孢子進(jìn)入果實(shí)傷口后會(huì)迅速萌發(fā)，同時(shí)啟動(dòng)相關(guān)致病機(jī)制，最終導(dǎo)致果實(shí)的腐爛變質(zhì)[2-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，櫻桃番茄果實(shí)采后真菌病害的控制主要依賴于化學(xué)殺菌劑，化學(xué)殺菌劑的普遍使用使得病原菌逐漸對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，此外，長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑造成的毒性殘留對(duì)環(huán)境、食品和人體存在潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，尋找新型、綠色、安全的用于防治櫻桃番茄采后病害的方法尤為必要。

在國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道的非殺菌劑方法中，利用安全有效的微生物，特別是生防酵母對(duì)病原菌的拮抗作用開展果實(shí)采后病害的生物防治手段在近10年來(lái)成為研究熱點(diǎn)，并被認(rèn)為是最有可能替代化學(xué)殺菌劑的方法之一[5-6]。羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）是目前國(guó)內(nèi)外廣泛研究的1 株采后生物防治微生物菌株，研究表明它不僅能有效直接地抑制蘋果、梨、桃、葡萄、櫻桃番茄、柑橘、楊梅、櫻桃、草莓等果實(shí)的多種真菌病害[3,7-9]，還能顯著地在梨、棗、桃、葡萄和櫻桃番茄果實(shí)中誘導(dǎo)抗性以增強(qiáng)其防御病害能力[10]。羅倫隱球酵母抑制病原菌的主要作用機(jī)制是營(yíng)養(yǎng)和生存空間的競(jìng)爭(zhēng)，而關(guān)于其增強(qiáng)果實(shí)抗病性機(jī)制的研究主要集中于：羅倫隱球酵母激發(fā)了果實(shí)中抗性相關(guān)關(guān)鍵酶如幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶等的活性，誘導(dǎo)相關(guān)抗性基因的表達(dá)，促進(jìn)相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累等[8,10-11]，而其通過(guò)哪些抗性信號(hào)分子或信號(hào)通路激發(fā)果實(shí)內(nèi)部響應(yīng)機(jī)制的研究仍需要進(jìn)行深入的探索。

轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶，通過(guò)基于Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)的新一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，在不需要物種基因組詳細(xì)信息的情況下能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在特定狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息[12-13]，因而其可成為研究櫻桃番茄果實(shí)響應(yīng)拮抗酵母羅倫隱球酵母處理后差異表達(dá)基因變化的重要手段。羅倫隱球酵母處理后，果實(shí)體內(nèi)被激發(fā)出復(fù)雜的抗性信號(hào)分子誘導(dǎo)果實(shí)內(nèi)部抗性響應(yīng)，此時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲得的信息能如實(shí)反映出果實(shí)抗性響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)羅倫隱球酵母處理后的櫻桃番茄果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得櫻桃番茄果實(shí)響應(yīng)羅倫隱球酵母誘導(dǎo)的基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能注釋和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，期望從RNA水平揭示羅倫隱球酵母的誘導(dǎo)機(jī)制和櫻桃番茄果實(shí)的響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，為全面挖掘羅倫隱球酵母增強(qiáng)果實(shí)抗病性的作用機(jī)制提供基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅倫隱球酵母C. laurentii(Kufferath) Skinner（CGMCC No. 3590）為本實(shí)驗(yàn)保藏的1 株菌株。

PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit、逆轉(zhuǎn)錄酶、PrimeScriptTMDouble Strand cDNA Synthesis、cDNA Library Construction、3’-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase、RNAiso Plus動(dòng)物/植物/微生物/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTM寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；血球計(jì)數(shù)板 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠；QYC-211全溫空氣搖床 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MLS-3750全自動(dòng)滅菌鍋 日本Sanyo有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；VS-840K-U超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)；3K-15離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；移液槍 德國(guó)Eppendorf公司；旋渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；StepOne Real-Time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)ABI公司；NanoDrop ND1000分光光度計(jì)美國(guó)Thermo公司；PTC-225型Thermal Cycler PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 番茄的選擇和預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)所用番茄（Solanum lycopersiconvar.cerasiforme）均為正常成熟度的新鮮（采摘當(dāng)天送回實(shí)驗(yàn)室）果實(shí)。選擇無(wú)機(jī)械損傷、未感染、大小和成熟度等外觀品質(zhì)均勻一致的番茄果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1～2 min，用自來(lái)水沖洗并在室溫下放干備用[9,14]。

1.3.2 羅倫隱球酵母的培養(yǎng)和收集

羅倫隱球酵母的培養(yǎng)、活化及收集參照Guo Jun等[15]的方法。

1.3.3 番茄果實(shí)組織樣品制備

將番茄分別浸泡于1×108cells/mL的拮抗酵母細(xì)胞懸浮液和無(wú)菌蒸餾水10 min后取出，室溫晾干后用PE塑料膜密封做保濕處理，并在恒溫恒濕貯藏室（25 ℃，相對(duì)濕度95%）內(nèi)貯藏，48 h后取樣。取樣時(shí)先用無(wú)菌手術(shù)刀將果皮切去，然后切下番茄赤道上接近表皮處薄薄一層果肉組織于研缽，馬上用液氮冷凍后置于-80 ℃低溫冰箱貯藏，以用于果肉組織RNA提取。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含20 個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.4 番茄果實(shí)傷口組織中總RNA的提取及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

將超低溫凍結(jié)的番茄果實(shí)迅速轉(zhuǎn)移到用液氮預(yù)冷的研缽中，用液氮研磨后按照RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書提取其總RNA，然后用NanoDrop ND1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的濃度和質(zhì)量，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的RNA用于cDNA的合成。使用Oligod（T）的磁珠試劑盒富集mRNA，并在94 ℃條件下將mRNA斷裂為約150～170 nt大小的片段，以打斷后的mRNA為模板根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書合成一鏈cDNA，隨后以第1鏈為模板合成二鏈cDNA，并使用試劑盒對(duì)合成的雙鏈cDNA純化、黏性末端修復(fù)、3’末端加上堿基“A”、連接接頭以及純化回收。

1.3.5 測(cè)序及數(shù)據(jù)過(guò)濾

采用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System分別對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行平均長(zhǎng)度的測(cè)定和定量分析，cDNA文庫(kù)質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，使用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeqTM4000進(jìn)行測(cè)序，得到原始測(cè)序序列（raw reads），所有測(cè)序工作在深圳華大基因科技有限公司完成。數(shù)據(jù)分析之前需先去除包含接頭的reads、去除未知堿基N含量大于5%的reads以及長(zhǎng)度過(guò)大過(guò)小等低質(zhì)量的reads，以得到高質(zhì)量序列（clean reads）。

1.3.6 Unigene表達(dá)量計(jì)算和差異表達(dá)基因檢測(cè)

使用短閱讀子組裝軟件Trinity v2.0.6對(duì)clean reads進(jìn)行組裝，對(duì)組裝后的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余，得到Unigene。Unigene表達(dá)量的計(jì)算使用RSEM軟件（v2.2.5），該軟件采用FPKM（fragment per kilo bases per million reads）方法計(jì)算基因表達(dá)量，以FPKM數(shù)值0.1作為判斷基因是否表達(dá)的閾值。差異表達(dá)基因定義為差異基因篩選閾值錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.001且差異表達(dá)倍數(shù)≥2或≤0.5的基因，采用PossionDis方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 差異表達(dá)基因GO功能注釋和Pathway富集分析

根據(jù)GO及KEGG注釋結(jié)果以及官方分類首先將差異基因進(jìn)行GO功能注釋和Pathway分類，接著使用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行Pathway富集分析。對(duì)P-value進(jìn)行FDR校正，F(xiàn)DR≤0.01的Pathway視為顯著富集。P-value計(jì)算如下：

式中：N為全基因組中的基因總數(shù)；M為功能基因集中的基因個(gè)數(shù)；n為目標(biāo)基因個(gè)數(shù)；P-value為n個(gè)目標(biāo)基因中至少有m個(gè)被功能基因注釋的概率。

1.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的驗(yàn)證

cDNA第1鏈的合成步驟參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，用無(wú)菌水對(duì)反轉(zhuǎn)錄樣品進(jìn)行梯度（2、4、6、8、10 倍）稀釋，并以梯度濃度cDNA為模板進(jìn)行qPCR（每個(gè)濃度3 個(gè)重復(fù)），選取Ct值在15～25間的cDNA濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次及以上直至兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，qPCR實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟參照SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒說(shuō)明書。qPCR條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，上述過(guò)程往復(fù)循環(huán)35 次，溶解曲線條件如下：95 ℃變性15 s，以0.3 ℃為步階從60 ℃升溫至95 ℃，95 ℃保溫15 s。利用StepOne Real-Time PCR（Applied Biosystem）儀檢測(cè)反應(yīng)體系熒光變化，相對(duì)定量計(jì)算采用2-ΔΔCt方法[16]。

目的基因的引物設(shè)計(jì)和合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR擴(kuò)增目的基因的引物序列Table 1 Primers used for validation of microarray data by RT-qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS/PC ver. II. x軟件進(jìn)行分析。組內(nèi)比較個(gè)數(shù)為2 個(gè)，采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)進(jìn)行平均數(shù)分離，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)以上重復(fù)并按照完全隨機(jī)區(qū)組原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，P＜0.05，差異顯著，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和質(zhì)控報(bào)告

采用Illumina HiSeqTM4000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)無(wú)菌水對(duì)照組及羅倫隱球酵母處理組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共測(cè)了8.93 Gb數(shù)據(jù)，經(jīng)檢測(cè)，樣品各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)達(dá)到質(zhì)量要求。在未接種病原菌條件下，對(duì)照組和羅倫隱球酵母處理組測(cè)序后都得到34.58 Mb raw reads，其中過(guò)濾后的clean reads分別占86.57%和86.67%。數(shù)據(jù)過(guò)濾后，使用Trinity對(duì)clean reads進(jìn)行組裝得到轉(zhuǎn)錄本，對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余得到48 695 個(gè)Unigene，將Unigene比對(duì)到七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，最終分別有31 952（NR：65.62%）、42 189（NT：86.64%）、20 098（Swissprot：41.27%）、12 065（COG：24.78%）、22 926（KEGG：47.08%）、5 778（GO：11.87%）、22 412（Interpro：6.03%）個(gè)Unigene獲得功能注釋，注釋結(jié)果說(shuō)明本次測(cè)序情況較為理想，適合之后的深度分析。

2.2 羅倫隱球酵母處理后的差異表達(dá)基因檢測(cè)結(jié)果

圖1 羅倫隱球酵母處理后櫻桃番茄果實(shí)差異表達(dá)基因分布Fig. 1 Distribution of differentially expressed genes in cherry tomato treated with C. laurentii

利用RSEM法計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平，并以FDR≤0.001且差異表達(dá)倍數(shù)≥2的條件用PossionDis方法進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選和檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1×108cells/mL羅倫隱球酵母處理番茄果肉組織后，3 141 個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生了變化，54%（1 689 個(gè)基因）的基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，46%（1 452 個(gè)基因）的基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)（圖1A）。5 倍以內(nèi)表達(dá)量變化的基因占差異表達(dá)基因總數(shù)的69.98%，其中，表達(dá)量變化1.0～2.0 倍的基因占總數(shù)的42.44%，上調(diào)基因占21.49%，下調(diào)基因占20.95%；表達(dá)量變化2.0～5.0 倍的基因占總數(shù)的27.54%，上調(diào)基因占15.89%，下調(diào)基因占11.65%；5 倍以上表達(dá)量的基因共有943 個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)515 個(gè)，下調(diào)表達(dá)428 個(gè)（圖1B）。相較而言，羅倫隱球酵母處理番茄果肉組織后，表達(dá)量變化在2 倍以內(nèi)的上調(diào)基因和下調(diào)基因的數(shù)量相當(dāng)，而表達(dá)量變化在2 倍以上的基因中上調(diào)基因數(shù)量明顯高于下調(diào)基因數(shù)量。

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和富集分析

圖2 羅倫隱球酵母處理后差異表達(dá)基因的GO功能注釋Fig. 2 GO annotation of differentially expressed genes treated with C. laurentii

GO旨在開發(fā)一個(gè)計(jì)算方法描述基因在分子、細(xì)胞和組織水平的功能體現(xiàn)，它有3 個(gè)本體，分別指基因的分子功能、所在的細(xì)胞位置和參與的生物過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GO注釋結(jié)果和官方分類對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋（圖2）。其中，催化活性相關(guān)基因占據(jù)12.79%，代謝過(guò)程占據(jù)相關(guān)基因12.42%，細(xì)胞過(guò)程相關(guān)基因占據(jù)10.59%。細(xì)胞殺傷進(jìn)程、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞核相關(guān)基因均顯示上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，而受體活性相關(guān)和再合成過(guò)程基因則呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。代謝過(guò)程、脅迫響應(yīng)與催化活性相關(guān)基因較多呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，而細(xì)胞成分相關(guān)基因較多顯示下調(diào)趨勢(shì)。GO功能富集分析結(jié)果顯示：差異基因所涉及的細(xì)胞位置中顯著變化的GO terms是細(xì)胞外區(qū)域（GO：0005576），所參與的生物過(guò)程中顯著變化的GO terms與植物系統(tǒng)防御通路相關(guān)，分別是防御反應(yīng)（GO：0006952）和離子轉(zhuǎn)運(yùn)（GO：0006820）。

2.4 差異表達(dá)基因的Pathway富集分析

KEGG是處理生物通路、基因組、藥物、疾病和化學(xué)物質(zhì)之間聯(lián)系的集成數(shù)據(jù)庫(kù)，差異基因的Pathway富集分析結(jié)果表明差異表達(dá)基因分布在132 個(gè)通路中，其中排名前10的顯著性富集通路如表2所示，這些差異表達(dá)基因主要涉及的通路如下：次生代謝產(chǎn)物的生物合成、植物-病原體相互作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等路徑。

表2 羅倫隱球酵母處理后櫻桃番茄果實(shí)中差異表達(dá)基因顯著富集的10 條Pathway條目Table 2 Top 10 enrichment degree pathways of differentially expressed genes after treatment with C. laurentii

2.4.1 羅倫隱球酵母對(duì)番茄果肉組織中植物激素信號(hào)通路的影響

羅倫隱球酵母處理櫻桃番茄果實(shí)引起果肉組織中大量植物激素代謝相關(guān)編碼基因的差異表達(dá)，尤其是乙烯與茉莉酸代謝通路上的相關(guān)基因（表3）。例如，乙烯合成通路中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶基因（ACS）與1-氨基環(huán)丙烷-1-甲酸氧化酶基因（ACO）2 組關(guān)鍵基因，均發(fā)生不同程度上調(diào)表達(dá)（上調(diào)倍數(shù)1.13～6.32不等），茉莉酸合成通路中的關(guān)鍵酶基因AOS2均發(fā)生不同程度上調(diào)表達(dá)（上調(diào)倍數(shù)2.43～6.32不等）。乙烯信號(hào)通路中的乙烯響應(yīng)因子Pti5基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著上調(diào)，上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為4.89；茉莉酸信號(hào)通路上的轉(zhuǎn)錄因子基因MYC2、水楊酸信號(hào)通路上的受體蛋白基因NPR1及MAPK家族成員MAPK3、MAPK9均顯著上調(diào)表達(dá)（上調(diào)倍數(shù)2.07～9.29不等）。經(jīng)羅倫隱球酵母處理后的番茄果實(shí)組織中GH3類似蛋白（與生長(zhǎng)素合成相關(guān)）編碼基因（GH3.6）的轉(zhuǎn)錄也出現(xiàn)顯著上調(diào)變化。但是，乙烯信號(hào)通路中的乙烯受體基因ETR、絲/蘇氨酸蛋白激酶基因CTR1、茉莉酸代謝途徑中負(fù)調(diào)控因子基因JAZ及水楊酸信號(hào)通路上的轉(zhuǎn)錄因子基因TGA7-like的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下調(diào)。

表3 拮抗酵母對(duì)番茄果實(shí)組織中植物激素相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Table 3 Effect of C. laurentii on cherry tomato genes related to phytohormone metabolism

2.4.2 羅倫隱球酵母對(duì)番茄果肉組織中次級(jí)代謝路徑的影響

表4 拮抗酵母對(duì)番茄果實(shí)組織中次級(jí)代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Table 4 Effect of C. laurentii on cherry tomato genes related to secondary metabolism

羅倫隱球酵母誘導(dǎo)番茄果實(shí)抗病的過(guò)程中還引起了植物抗性相關(guān)的次級(jí)代謝路徑的變化，大部分與生物堿、類黃酮、萜類化合物、氨基酸代謝有關(guān)，尤其是苯丙氨酸路徑，如苯丙氨酸代謝中，苯丙氨酸解氨酶基因（PAL3和PAL5）、香豆素輔酶A基因（4CL3）和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（ATOMT）的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的上調(diào)表達(dá)（表4）。

2.4.3 羅倫隱球酵母對(duì)番茄果肉組織中抗病相關(guān)路徑的影響

在本實(shí)驗(yàn)中羅倫隱球酵母處理番茄果實(shí)后引起了大量病程相關(guān)蛋白（pathogen-related proteins，PRs）和轉(zhuǎn)錄因子編碼基因轉(zhuǎn)錄的變化（表5）。其中，PRs基因（PR1、STH-2、TSI-1、PR1A1、PR10、PR06、PR-P2、PR5）發(fā)生不同程度的上調(diào)表達(dá)（上調(diào)倍數(shù)3.55～10.57）。

表5 拮抗酵母對(duì)番茄果實(shí)組織中抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Table 5 Effect of C. laurentii on defense-related genes in cherry tomato fruit

2.5 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取了12 個(gè)與植物抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因（ERF1A-like、ERF2-like、Pti5、ERF018-like、TEM1-like、ABR1-like isoform2、Pti6、ABR1-like isoform1、ERF114-like、ERF054-like、CBF2、CBF1）進(jìn)行qPCR分析，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，Actin為內(nèi)參，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過(guò)羅倫隱球酵母處理后，番茄果肉組織中上述12 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因中5 個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)（差異表達(dá)倍數(shù)＞2），3 個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)。RT-qPCR分析顯示，RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)基因的變化趨勢(shì)一致。

圖3 基于RT-qPCR的櫻桃番茄果肉組織基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析Fig. 3 Differentially expressed genes detected by RT-qPCR

3 討 論

羅倫隱球酵母作為生物激發(fā)子可以通過(guò)激活寄主內(nèi)部復(fù)雜的抗性信號(hào)因子及其交互作用誘導(dǎo)果實(shí)內(nèi)部抗性響應(yīng)[17]，前期研究結(jié)果表明，羅倫隱球酵母能顯著誘導(dǎo)櫻桃番茄果實(shí)對(duì)腐生營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抗性響應(yīng)[10]，為進(jìn)一步探究羅倫隱球酵母誘導(dǎo)櫻桃番茄果實(shí)抗病機(jī)理，采用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeqTM4000對(duì)羅倫隱球酵母處理及對(duì)照處理的櫻桃番茄果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和功能分析，結(jié)果以差異表達(dá)倍數(shù)≥2或≤0.5為標(biāo)準(zhǔn)挑選差異表達(dá)基因，得到上調(diào)表達(dá)基因1 689 個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因1 452 個(gè)。

3.1 植物激素信號(hào)通路參與羅倫隱球酵母誘導(dǎo)番茄果實(shí)抗病過(guò)程

植物激素在植物生物和非生物脅迫中起著重要的作用，目前大量研究報(bào)道表明乙烯、水楊酸、茉莉酸、脫落酸、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等是植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子[18]。其中，乙烯和茉莉酸是誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的關(guān)鍵信號(hào)分子，而水楊酸在其介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性中，通過(guò)與其下游的正調(diào)控因子NPR1互作，激活轉(zhuǎn)錄因子WRKY和TGA家族及PRs等抗性基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抗性[19]。本實(shí)驗(yàn)中，羅倫隱球酵母誘導(dǎo)處理后，乙烯生物合成中的關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶基因（ACS）和1-氨基環(huán)丙烷-1-甲酸氧化酶基因（ACO）顯著上調(diào)表達(dá)，而在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，乙烯反應(yīng)負(fù)調(diào)控因子乙烯受體基因ETR顯著下調(diào)表達(dá)，其下游的乙烯響應(yīng)因子基因Pti5/6顯著上調(diào)表達(dá)。研究報(bào)道顯示，乙烯響應(yīng)因子ERFs可通過(guò)GCC-box這一結(jié)構(gòu)元調(diào)控PRs編碼基因PR1、PR2、PR3、PR5等基因的表達(dá)，以作出相應(yīng)的抗病響應(yīng)[20]，Guo Jun等[21]研究表明Pti5作為PRs基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在羅倫隱球酵母誘導(dǎo)條件下上調(diào)表達(dá)并直接調(diào)控PR5基因的上調(diào)表達(dá)，參與果實(shí)抗性反應(yīng)，這與本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果是一致的。其次，水楊酸代謝通路上的NPR1轉(zhuǎn)錄因子和PR1抗性蛋白基因分別上調(diào)表達(dá)7.51 倍和4.51 倍，同時(shí)水楊酸合成關(guān)鍵酶基因苯丙氨酸解氨酶編碼及原因PAL也顯著上調(diào)表達(dá)。在茉莉酸信號(hào)通路中，負(fù)調(diào)控因子JAZ蛋白家族可以與茉莉酸應(yīng)答正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYC2結(jié)合，抑制茉莉酸早期應(yīng)答基因的表達(dá)[22]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羅倫隱球酵母處理后，JAZ基因顯著下調(diào)表達(dá)8.32 倍，同時(shí)正轉(zhuǎn)錄因子MYC2基因顯著上調(diào)表達(dá)9.29 倍，這暗示羅倫隱球酵母處理激活了茉莉酸誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)路徑。GH3類生長(zhǎng)素參與植物誘導(dǎo)抗病過(guò)程，羅倫隱球酵母處理后的番茄果實(shí)組織中GH3類蛋白編碼基因顯著上調(diào)表達(dá)。綜上所述，植物激素乙烯、茉莉酸、水楊酸、生長(zhǎng)素信號(hào)通路參與了羅倫隱球酵母誘導(dǎo)激活櫻桃番茄果實(shí)對(duì)灰霉的防御調(diào)控機(jī)制。

3.2 羅倫隱球酵母激活櫻桃番茄果實(shí)次級(jí)代謝通路關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和對(duì)能量代謝的影響

次級(jí)代謝由初生代謝衍生而來(lái)，是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與環(huán)境相互作用而適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果，植物在受到病原菌侵染后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生并積累大量的次生代謝產(chǎn)物，其中，苯丙烷類、萜類、類固醇類等是主要的類型[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羅倫隱球酵母激活櫻桃番茄果實(shí)次級(jí)代謝的相關(guān)基因主要有：苯丙氨酸解氨酶PAL、ATOMT1和香豆素輔酶A（4CL3）基因，這表明從整體基因轉(zhuǎn)錄水平上看，植物次級(jí)代謝尤其是苯丙烷類合成代謝過(guò)程在羅倫隱球酵母誘導(dǎo)櫻桃番茄果實(shí)采后抗病性過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

植物抗病反應(yīng)的激活是一個(gè)需要消耗能量的過(guò)程，植物體內(nèi)防御機(jī)制的激活使能量代謝集中于逆境響應(yīng)，因而會(huì)影響植物正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖功能[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羅倫隱球酵母處理后，櫻桃番茄果實(shí)組織中與能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路上的編碼基因也發(fā)生了顯著的差異表達(dá)，其中，次生代謝物質(zhì)合成、淀粉和蔗糖代謝與糖酵解/糖異生代謝4 組代謝通路差異顯著。在羅倫隱球酵母下調(diào)的番茄果實(shí)差異基因中，有35 個(gè)涉及淀粉和蔗糖代謝和16 個(gè)涉及糖酵解/糖異生代謝通路，分別占該代謝通路總蛋白的50.7%和41.1%，這揭示了羅倫隱球酵母處理部分抑制了番茄果實(shí)的能量代謝。

3.3 羅倫隱球酵母誘導(dǎo)櫻桃番茄果實(shí)PRs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

PRs是植物抵御生物和非生物脅迫時(shí)產(chǎn)生和積累的一類蛋白質(zhì)總稱，在植物防衛(wèi)體系中發(fā)揮著重要作用[25-26]。PRs蛋白可被劃分為17 個(gè)家族，具有廣泛而重要的生物學(xué)功能，采后果實(shí)PRs的研究主要集中于以下幾類：PR-1是病原菌誘導(dǎo)的具有抗真菌活性的PRs，也是系統(tǒng)性獲得抗性增強(qiáng)的標(biāo)志[27-28]；PR-2蛋白家族編碼的β-1,3-葡聚糖酶能水解真菌的細(xì)胞壁的葡聚糖，因而具有抗真菌活性；PR-3、PR-4、PR-8和PR-11蛋白具有幾丁質(zhì)酶活性，它們能直接降解真菌細(xì)胞壁中的β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)，因而在植物防御反應(yīng)中起非常重要的作用，蘋果中的PR-8基因能被假絲酵母（Candida oleophila）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[25-26]；PR-5具有增強(qiáng)膜透性、水解葡聚糖鏈、促進(jìn)凋亡的作用[29]，有報(bào)道表明，1×108cells/mL羅倫隱球酵母能顯著誘導(dǎo)柑橘皮中PR-5的上調(diào)表達(dá)[15]；PR-10因具有核糖核酸酶活性而成為17 種PRs中唯一具有抗病毒功能蛋白[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PR-1、PR-5、PR-10、PR-P2、PR-P6、PR-1A1等多組PRs基因參與了羅倫隱球酵母誘導(dǎo)櫻桃番茄果實(shí)抗病過(guò)程，這表明羅倫隱球酵母誘導(dǎo)番茄果實(shí)抗病響應(yīng)過(guò)程中，PRs發(fā)揮著重要作用，其作用機(jī)制主要包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降解病原真菌細(xì)胞壁組成成分、強(qiáng)化植物細(xì)胞壁等多種生理過(guò)程。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)羅倫隱球酵母處理組和無(wú)菌水對(duì)照組兩個(gè)樣本進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在未接種病原菌條件下，對(duì)照組和羅倫隱球酵母處理組測(cè)序后的clean reads均有85%以上能夠與參考序列匹配并且檢測(cè)到3 141 個(gè)差異表達(dá)基因，隨后采用GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)處理組的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和通路富集分析，結(jié)果表明這些差異表達(dá)基因涉及植物激素代謝、次級(jí)代謝和氨基酸代謝等多種與果實(shí)抗性密切相關(guān)的代謝路徑和信號(hào)通路，此外，對(duì)隨機(jī)選取的差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致。這些結(jié)果為全面揭示羅倫隱球酵母誘導(dǎo)果實(shí)抗病的分子作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。