人臍帶間充質(zhì)干細胞的研究進展及在心臟疾病中的應用

田洪榛，柏翠芳，陳光輝

· 綜述 ·

人臍帶間充質(zhì)干細胞的研究進展及在心臟疾病中的應用

田洪榛1，2，柏翠芳3，陳光輝1

近年來人們飲食及生活方式發(fā)生了巨大變化，特別是人口老齡化的加速，我國面臨心臟疾病發(fā)病率和死亡率快速增長的嚴峻形勢。心肌細胞是不可再生細胞，常規(guī)藥物治療、血運重建、冠狀動脈旁路移植等均不能使心肌細胞再生，尋找能夠彌補心肌缺失的方法顯得極為迫切。間充質(zhì)干細胞（MSCs）具有自我更新、不斷增殖、多向分化和免疫調(diào)節(jié)等能力，已成為再生醫(yī)學的研究焦點。1970年，F(xiàn)riedenstein等首次在骨髓中發(fā)現(xiàn)并提取到骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）［1］。但從骨髓中提取BMMSCs的過程復雜，并對捐獻者造成損傷。胚胎干細胞（ESCs）能分化成體內(nèi)所有的細胞，是多能性干細胞的典型代表。近年研究發(fā)現(xiàn)誘導多能干細胞（iPSCs）具有與ESCs相似的多能性［2］。多能性是指這些細胞移植到免疫缺陷小鼠時可分化成三胚層（外胚層、中胚層及內(nèi)胚層）的任意細胞的能力。但是胚胎干細胞的應用會產(chǎn)生嚴重的倫理問題。而iPSCs可能存在如c-myc的融合致癌基因、插入突變、抑癌基因破壞等情況［3］，其臨床應用受到批評與限制。尋找新的干細胞來源成為當務之急。

近期兩項“吸血鬼療法”的研究結果引人關注。研究者將幼鼠的血液移植注入年長小鼠體內(nèi)，隨后觀察到年長小鼠的肌肉組織增加及神經(jīng)功能的恢復，提示該效應與幼鼠血液中的干細胞密切相關，發(fā)現(xiàn)血液中生長分化因子11（GDF11）和環(huán)磷酸腺苷應答元件結合蛋白（CREB）與此效應相關［4，5］。人類干細胞主要來自羊水、臍帶和胎盤，主要是間充質(zhì)干細胞。因人臍帶來源豐富，不對捐獻者造成損傷，不產(chǎn)生倫理問題，成本較低，目前人臍帶間充質(zhì)干細胞（HUCMSCs）正被廣泛研究。

1　HUCMSCs來源

人臍帶在懷孕的第5周開始發(fā)育，并繼續(xù)生長至50 cm左右。臍帶由三部分構成：羊膜被覆上皮、臍血管和位于兩者之間的黏液結締組織—沃頓膠質(zhì)。沃頓膠質(zhì)對臍血管臍帶有保護和支持作用。臍帶的粗細和重量主要取決于沃頓膠質(zhì)的數(shù)量。2003年，Mitchell等［6］首先在沃頓膠質(zhì)提取分離出具有多項分化潛能的間充質(zhì)干細胞，此后很多研究應用這種干細胞，并被稱作臍帶間充質(zhì)干細胞。

2　HUCMSCs的一般生物學特性

2.1HUCMSCs的細胞形態(tài)和表面標志 組織塊貼壁7 d后可見單個的梭形或多角形成纖維樣細胞；傳代后的細胞形態(tài)為相對均一的梭形，呈平行排列或旋渦狀、魚群狀排列生長。透射電鏡下觀察多次傳代后的細胞形態(tài)無明顯改變，活性穩(wěn)定。HUCMSCs體外培養(yǎng)傳代超過80代而沒有細胞形態(tài)的改變和細胞衰老跡象［6］。目前還沒有發(fā)現(xiàn)HUCMSCs的特異分子標記，只能通過檢測其免疫表型來間接鑒定。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HUCMSCs高表達MSCs標記（CD73、CD90、CD105）和黏附分子標記（CD54、CD13、CD29、CD44），低表達MHC-Ⅰ分子標記（HLA-ABC）等，不表達造血干細胞標記（CD31、CD34、CD45、CD117、CD14）、內(nèi)皮細胞標記（CD33、CD133）及MHC-Ⅱ分子標記（HLA-DR、-DA、-DP、-DQ）等［7］。據(jù)報道HUCMSCs與ESCs的基因信息近似，HUCMSCs低表達一些轉錄因子如Oct-4、Sox-2、Nanog、KLF-4等，這些轉錄因子也多在ESCs表達［8］。

2.2HUCMSCs的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用

2.2.1HUCMSCs具有極低的免疫原性 大量研究證實，HUCMSCs表達的 CD106、HLA-ABC 明顯低于 BMMSCs，因此HUCMSCs較BMMSCs具有更低的免疫原性［9］。在腦損傷和退行性變的動物試驗中進行細胞移植，發(fā)現(xiàn)機體并未針對移植細胞產(chǎn)生排斥反應［10］。近年來關于HUCMSCs的免疫特性進行了詳細的研究，Troyer和Weiss得出的結論是在體內(nèi)開放免疫環(huán)境中未見機體對HUCMSCs的免疫排斥，HUCMSCs在同種異基因移植的耐受性良好［11］。

2.2.2HUCMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用 HUCMSCs可通過高表達白介素6（IL-6）和血管生長因子來抑制T細胞增殖［12］，高表達具有抑制孕體胎兒排斥、介導異體皮和心臟移植免疫耐受效應的CD200［13］。還有研究表明HUCMSCs高表達人類白細胞抗原G（HLA-G）［14］或通過前列腺E2機制［15］抑制T細胞增殖，介導免疫耐受。HUCMSCs低水平表達ESCs的分子標記—OCT4，Nanog，Sox2和LIN28，從而能解釋將其移植到免疫缺陷大鼠體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤［16］。已證實在體外及小鼠體內(nèi)HUCMSCs能抑制人乳腺癌細胞的生長，其抗癌作用可能通過細胞-細胞接觸或分泌相關因子，使細胞凋亡相關基因及腫瘤抑制基因表達上調(diào)［17］。將HUCMSCs與樹突狀細胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，成熟樹突狀細胞表面標志CD80、CD83、CD86水平下降，HUCMSCs直接降低了樹突狀細胞的共刺激分子和抗原呈遞能力，避免T細胞啟動［18］。HUCMSCs能表達具有免疫調(diào)節(jié)功能的因子，如IDO-1、IL-10、LIF、PD-L1、COX-2、TGF-β1、TSG-6、CD200、HGF、HLA-E、HLA-G和HO-1，將HUCMSCs與T細胞共同培養(yǎng)，其通過接觸依賴機制和IDO-1等可溶性分子抑制T細胞增殖，并可激活T細胞抑制TGF-γ的水平，誘導IL-10分泌［19］。這些研究表明HUCMSCs在體外對T淋巴細胞、樹突狀細胞具有負性調(diào)節(jié)作用。

3　HUCMSCs的多分化潛能

既往研究證實HUCMSCs在體外、體內(nèi)均可分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、肝樣細胞、胰島細胞等［20，21］。

3.1HUCMSCs向心肌細胞分化的方法 已經(jīng)證實向培養(yǎng)基中加入5氮胞苷（5-Aza）、二甲基亞砜（DMSO）、1-磷酸鞘氨醇（S1P）等誘導劑，能在體外誘導HUCMSCs定向分化為心肌樣細胞。國外發(fā)現(xiàn)血管緊張素受體阻滯劑和匹格列酮等可促進HUCMSCs分化為心肌樣細胞［22，23］。

3.2HUCMSCs誘導心肌樣細胞機制 5-Aza處理HUCMSCs后，DLL4和Notch1基因的轉錄、表達水平升高（7 d時分別高達初始水平的7.8和11.4倍）［24］，GATA4和Flk-1、Nkx2.5、Isl-1、Brachyury（T）等心臟發(fā)育過程中關鍵的轉錄因子表達增高，肌鈣蛋白I（cTnI）表達水平增高［25］。提示DLL4-Notch信號通路在HUCMSCs向心肌樣細胞的分化過程中有重要作用。還有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-Aza處理后，HUCMSCs的ERK磷酸化水平和MEF-2蛋白表達升高，進而引發(fā)STAT3磷酸化以及MEF-2C和MyoD基因表達的上調(diào)，進一步激活心肌特異基因包括desmin、β-MHC、NKx2.5、cTnT、ANP 的轉錄，使HUCMSCs向心肌樣細胞分化［26］。

研究證實轉錄因子Nkx2.5促進HUCMSCs分化為心肌樣細胞，并使心肌樣細胞的cTnI、Desmin、Nkx2.5和GATA-4表達增加［27］。缺氧預處理能增強HUCMSC的增殖和向心肌樣細胞分化的能力，增加HUCMSCs和分化心肌樣細胞的抗缺氧能力，提高其在治療心肌梗死及心力衰竭的存活率［28］。急性心肌梗死大鼠模型的試驗提示，在急性心肌梗死后梗死相關的生物和物理因子通過TGF-β/ BMP-2途徑誘導HUCMSCs向心肌樣細胞分化［29］。干細胞的分化涉及多個基因的轉錄表達，多條信號通路及相互作用，最終才能分化為特定的終末分化細胞。目前仍需進一步研究來了解干細胞的分化機制。

4　HUCMSC在心臟疾病的臨床應用

Sun L等［30］將HUCMSCs經(jīng)靜脈輸注到兔、豚鼠和大鼠后，未觀察到肝臟、腎臟功能損害，無溶血及全身過敏反應，熱原及血液學指標未見異常，提示HUCMSCs的免疫耐性良好，經(jīng)靜脈途徑應用安全。許多急性心肌梗死的動物模型試驗提示移植HUCMSCs后，能通過保護心肌細胞免于凋亡、促進血管生成、減少心肌纖維化等作用，提高左室射血分數(shù)、縮小心肌梗死面積、改善心臟收縮功能［31，32］。

Xia等［33］對15例高齡冠心病合并冠狀動脈慢性閉塞的患者進行了HUCMSCs經(jīng)冠狀動脈移植，隨訪2年期間未發(fā)生心血管不良事件、心律失常等，患者的左室收縮功能顯著改善，心肌缺血及梗死面積縮小，這些效應與HUCMSCs對血管緊張素、醛固酮及炎癥因子的作用相關。Gao等［34］開展了關于HUCMSCs一項隨機雙盲對照研究，將116例急性ST段抬高的心肌梗死患者隨機分成治療組和安慰劑組，在成功血運重建后，治療組經(jīng)冠狀動脈注入了干細胞混懸液，隨訪18個月發(fā)現(xiàn)治療組的心肌活力增加、梗死面積縮小，左室射血分數(shù)明顯升高，左室舒張末期容積和左室收縮末期容積明顯減小，提示經(jīng)冠狀動脈移植HUCMSCs治療急性心肌梗死是一種安全有效的方法。Samuel Golpanian等［35］對TESI和TAC-HFT兩項隨機研究進行亞組分析顯示：心內(nèi)膜下注射間充質(zhì)干細胞治療缺血性心肌病在年齡大于60歲或小于60歲的患者均安全有效，年齡不影響干細胞的治療效果。Mushtaq M等［36］正在進行POSEIDON-DCM的隨機對照研究，這是一個關于自體骨髓間充質(zhì)干細胞和異體骨髓間充質(zhì)干細胞對擴張型心肌病的治療效果與安全性的研究，期待試驗結果的公布。

綜上，HUCMSCs具有極低的免疫原性、良好的多分化潛能和免疫調(diào)節(jié)、抗癌效應，其來源豐富，成本低，對供體無損傷，不涉及倫理問題，是再生醫(yī)學研究的重要成員。目前已嘗試在包括心肌梗死、心力衰竭、心肌病、白血病、糖尿病、多發(fā)性硬化等多系統(tǒng)多種疾病應用，但治療機制還不十分清楚，其治療的安全性及長期療效更需大樣本、多中心的隨機前瞻性試驗進行驗證。

［1］ Friedenstein AJ，Chailakhjan RK，Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells［J］. Cell Tissue Kinet，1970，3（4）：393-403.

［2］ Yamanaka S，Takahashi K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］. Cell，2006，126（4）：663-76.

［3］ Cavazzana-Calvo M，Payen E，Negre O，et al. Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human betathalassaemia［J］. Nature，2010，467（7313）：318-22.

［4］ Sinha M，Jang YC，Oh J，et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle［J］. Science， 2014，344（6184）：649-52.

［5］ Villeda SA，Plambeck KE，Middeldorp J，et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice［J］. Nat Med，2014，20（6）：659-63.

［6］ Mitchell K，Weiss ML，Mitchell JB，et al. Matrix cells from Wharton's jelly from neurons and glia［J］. Stem Cells，2003，21（1）：50-60.

［7］ Ishige I，Nagamura-Inoue T，Honda MJ，et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial， venous， and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord［J］. Int J Hematol，2009，90（2）：261-9.

［8］ Greco SJ，Liu K，Rameshwar P. Functional similarities among genes regulated by OCT4 in human mesenchymal and embryonic stem cells［J］. Stem Cells，2007，25（12）：3143-54.

［9］ Lu LL，Liu YJ，Yang SG，et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesissupportive function and other potentials［J］. Haematologica，2006，91（8）：1017-26.

［10］ Liao W，Xie J，Zhong J，et al. Therapeutic effect of human umbilical cord multipotent mesenchymal stromal cells in a rat model of stroke［J］. Transplantation，2009，87（3）：350-9.

［11］ La Rocca G，Anzalone R，F(xiàn)arina F. The expression of CD68 in human umbilical cord mesenchymal stem cells： new evidences of presence in non-myeloid cell types［J］. Scand J Immunol，2009，70（2）：161-2.

［12］ Troyer DL，Weiss ML. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population［J］. Stem Cells，2008，26（3）：591-9.

［13］ Djouad F，Charbonnier LM，Bouffi C，et al. Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an interleukin-6-dependent mechanism［J］. Stem Cells，2007，25（8）：2025-32.

［14］ Fong CY，Chak LL，Biswas A，et al. Human Wharton's jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells［J］. Stem Cell Rev，2011，7（1）：1-16.

［15］ Le Blanc K. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymalstem cells［J］. Cytotherapy，2003，5（6）：485-9.

［16］ Chen K，Wang D，Du WT，et al. Human umbilical cord mesenchymalstem cells hUC-MSCs exert immunosuppressive activities through a PGE2-dependent mechanism［J］. Clin Immunol，2010，135（3）：448-58.

［17］ Fong CY，Richards M，Manasi N，et al. Comparative growth behaviour and characterization of stem cells from human Wharton's jelly［J］. Reprod Biomed，2007，15（6）：708-18.

［18］ Witkowska-Zimny M，Wrobel E. Perinatal sources of mesenchymal stem cells： Wharton's jelly， amnion and chorion［J］. Cell Mol Biol Lett，2011，16（3）：493-514.

［19］ Donders R，Vanheusden M，Bogie JF，et al. Human Wharton’s Jelly-Derived Stem Cells Display Immunomodulatory Properties and Transiently Improve Rat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis［J］. Cell Transplant，2015，24（10）：2077-98.

［20］ Anzalone R，Iacono ML，Corrao S，et al. New emerging potentials for human Wharton’s jelly mesenchymal stem cells： immunological features and hepatocyte-like differentiative capacity［J］. Stem Cells Dev，2010，19（4）：423-38.

［21］ Anzalone R，Lo Iacono M，Loria T，et al. Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells as candidates for beta cells regeneration： extending the differentiative and immunomodulatory benefits of adult mesenchymal stem cells for the treatment of type 1 diabetes［J］. Stem Cell Rev，2011，7（2）：342-63.

［22］ Shinmura D，Togashi I，Miyoshi S，et al. Pretreatment of human mesenchymal stem cells with pioglitazone improved efficiency of cardiomyogenictransdifferentiation and cardiac function［J］. Stem Cells，2011，29（2）：357-66.

［23］ Numasawa Y，Kimura T，Miyoshi S，et al. Treatment of human mesenchymal stem cells with angiotensin receptor blocker improved efficiency of cardiomyogenictransdifferentiation and improved cardiac function via angiogenesis［J］. Stem Cells，2011，29（9）：1405-14.

［24］ Zhu L，Ruan Z，Yin Y，et al. Expression and significance of DLL4--Notch signaling pathway in the differentiation of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes induced by 5-azacytidine［J］. Cell BiochemBiophys，2015，71（1）：249-53.

［25］ Gao LR，Zhang NK，Ding QA，et al. Common expression of stemness molecular markers and early cardiac transcription factors in Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells and hESCs［J］. Cell Transplant，2013，22（10）：1883-900.

［26］ Qian Qian，Hui Qian，Xu Zhang，et al. 5-Azacytidine Induces Cardiac differentiation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells by activating extracellular regulated kinase［J］. Stem Cells Dev，2012，21（1）：67-75.

［27］ Ruan Z，Zhu L，Yin Y，et al. Overexpressing NKx2.5 increases the differentiation of human umbilical cord drived mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells［J］. Biomed Pharmacother，2016，78：110-5.

［28］ Zhang L，Yang J，Tian YM，et al. Beneficial Effects of Hypoxic Preconditioning on Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells［J］. Clin J Physiol，2015，58（5）：343-53.

［29］ Chang SA，Lee EJ，Kang HJ，et al. Impact of Myocardial Infarct Proteins and Oscillating Pressure on the Differentiation of Mesenchymal Stem Cells： Effect of Acute Myocardial Infarction on Stem Cell Differentiation［J］. Stem Cells，2008，26（7）：1901-12.

［30］ Sun L，Xu R，Sun X，et al. Safety evaluation of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stromal cell［J］. Cytotherapy，2016，18（3）：413-22.

［31］ Zhao Y，Sun X，Cao W，et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury［J］. Stem Cells Int，2015，2015：761643.

［32］ Latifpour M，Nematollahi-Mahani SN，Deilamy M，et al. Improvement in cardiac function following transplantation of human umbilical cord matrix-derived mesenchymal cells［J］. Cardiology，2011，120（1）：9-18.

［33］ Xia Li，You-dong Hu，Ying Chen，et al. Mechanisms of Improvement of Left Ventricular Function by Intracoronary Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Infusion in Very Old Patients with Coronary Chronic Total Occlusion［J］. Current Pharmaceutical Design，2015，21（26）：3844-50.

［34］ Gao LR，Chen Y，Zhang NK，et al. Intracoronary infusion of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction： double-blind， randomized controlled trial［J］. BMC Med，2015，13：162.

［35］ Samuel Golpanian，Jill El-Khorazaty，Adam Mendizabal，et al. Effect of Aging on Human Mesenchymal Stem Cell Therapy in Ischemic Cardiomyopathy Patients［J］. J Am Coll Cardiol，2015，65（2）：125-32.

［36］ Mushtaq M，DiFede DL，Golpanian S. Rationale and design of the Percutaneous Stem Cell Injection Delivery Effects on Neomyogenesis in Dilated Cardiomyopathy （the POSEIDON-DCM study）： a phase I/II， randomized pilot study of the comparative safety and efficacy of transendocardial injection of autologous mesenchymal stem cell vs. allogeneic mesenchymal stem cells in patients with non-ischemic dilated cardiomyopathy［J］. J CardiovascTransl Res，2014，7（9）：769-80.

本文編輯：姚雪莉

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