建立鼻咽癌標(biāo)本庫的經(jīng)驗(yàn)和體會

陳超 潘建基 鄒長棪 宗井鳳 林可焴 何火聰 蘇穎

科學(xué)研究是防治癌癥的重要手段之一，而腫瘤標(biāo)本則是研究惡性腫瘤的重要生物材料。在上個世紀(jì)末，一些發(fā)達(dá)國家已相繼建成了較為完善的標(biāo)本庫。因此，在我國建立科學(xué)規(guī)范的標(biāo)本庫，長期有效地收集腫瘤標(biāo)本是一項(xiàng)重要工作。鼻咽癌多發(fā)于福建、廣東等沿海地區(qū)，研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，尋找相關(guān)標(biāo)志物，有助于為患者制訂個體化的治療方案，而這一切必須建立在一個樣品合格、信息完備且操作規(guī)范的鼻咽癌組織標(biāo)本庫基礎(chǔ)之上，因此鼻咽癌標(biāo)本庫應(yīng)運(yùn)而生［1～4］。本研究利用我院鼻咽癌組織標(biāo)本資源，初步建立了鼻咽癌組織標(biāo)本庫并取得了一定經(jīng)驗(yàn)?，F(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備

液氮罐（180 L，Thermo公司）、-80℃超低溫冰箱（forma 994）、凈化工作臺（SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司）和臺式離心機(jī)（Thermo公司）等。

1.2 標(biāo)本的采集和保存規(guī)范

我院鼻咽癌標(biāo)本庫成立于2012年4月25日，標(biāo)本庫接受本院醫(yī)學(xué)倫理委員會的管理。在標(biāo)本采集之前必須和患者或患者家屬簽署知情同意書（informed consent，IC）［5］。參照《腫瘤組織標(biāo)本庫常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊》等相關(guān)資料，制定了組織標(biāo)本的采集與保存規(guī)范等一系列標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。組織標(biāo)本的采集、保存等操作均嚴(yán)格按照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行。

1.3 組織標(biāo)本的采集

由經(jīng)驗(yàn)豐富的鼻咽鏡醫(yī)生夾取鼻咽癌患者2份鼻咽癌組織標(biāo)本，一份送病理科檢查，確定是否為鼻咽癌組織；另一份作為標(biāo)本庫材料保存。鼻咽鏡下取組織活檢流程：先用1%呋麻液和2%利多卡因局部噴灑鼻腔及鼻咽部，或用蘸有麻黃素的棉簽插入鼻腔以收縮鼻甲，然后用活檢鉗鉗取約直徑為5 mm的鼻咽病變組織。鼻咽黏膜血供為微小血管，組織出血量較少，很快可以自行止血，無需特殊處理；如果患者局部創(chuàng)面較大，出血較多，可將蘸有1%呋麻液的棉簽插入鼻腔及鼻咽部進(jìn)行止血，如果未能止血，則要考慮在三腔氣囊導(dǎo)尿管引導(dǎo)下鼻咽填塞局部壓迫止血。

標(biāo)本庫的組織標(biāo)本，放入凍存管后立刻置于-196℃液氮中，防止RNA等生物分子的降解，此操作應(yīng)在標(biāo)本離體30 min內(nèi)完成［6］，最后送到標(biāo)本庫，轉(zhuǎn)移到儲存液氮罐中長期保存［7］。

鼻咽部正常組織標(biāo)本由志愿者提供，這些志愿者同樣由經(jīng)驗(yàn)豐富的鼻咽鏡醫(yī)生夾取2份鼻咽正常組織標(biāo)本，一份送病理科檢查，確定這些志愿者為非鼻咽癌患者。另一份作為標(biāo)本庫材料，其運(yùn)輸、保存條件同上。

1.4 血液標(biāo)本的采集

采集鼻咽癌患者治療前和治療結(jié)束時的外周靜脈血液，采血以患者晨起進(jìn)食前為宜，血液標(biāo)本共2管，1管為EDTA抗凝管，采血后立即將其上下顛倒數(shù)次，使抗凝劑與血液充分混勻；另1管為非抗凝管。每管抽取外周血液 10 mL［8，9］。

1.5 血液標(biāo)本的分離與凍存

1.5.1 全血標(biāo)本的分裝 將EDTA抗凝管充分混勻，然后從中吸取1 mL的全血分裝至5個EP管中，每管200 μL。并在 EP 管上標(biāo)明“編號”“住院號”“全血”。

1.5.2 血漿的分離 全血標(biāo)本以2000r/min離心5min，小心吸取上層血漿（為避免污染，棄去距離白細(xì)胞層5 mm以下的血漿）。每500 μL血漿分裝一個EP管并標(biāo)明“編號”“住院號”“血漿”。

1.5.3 白細(xì)胞層的分離 小心吸取白細(xì)胞層，并放入一個新的EP管中，盡量不要混雜血漿和紅細(xì)胞，并標(biāo)明“編號”“住院號”“白細(xì)胞層”。

1.5.4 血清的分離 將非抗凝血液以3 000 r/min離心5 min，小心吸取上層上清液，每500 μL分裝一個EP管并標(biāo)明“編號”“住院號”“血清”。

1.5.5 血液標(biāo)本的凍存 每份血液標(biāo)本可獲得血漿和血清各3～5 mL，將全血、血漿、白細(xì)胞層和血清分別裝入不同顏色的凍存盒中，并在凍存盒上標(biāo)明編號，然后放入-80℃低溫冰箱保存。以上所有操作必須在血液采集后4 h內(nèi)完成［10］。

1.6 標(biāo)本庫數(shù)據(jù)庫的建立

標(biāo)本庫的數(shù)據(jù)資料由醫(yī)院的結(jié)構(gòu)化電子病歷系統(tǒng)和患者標(biāo)本信息管理系統(tǒng)兩部分組成［11］。本研究自行設(shè)計(jì)樣本庫信息管理系統(tǒng)，根據(jù)患者住院號、姓名等信息可以篩查到該患者的電子病歷，并可進(jìn)行樣本的分類和統(tǒng)計(jì)等。

1.6.1 醫(yī)院的結(jié)構(gòu)化電子病歷 我院采用海泰結(jié)構(gòu)化電子病歷，其內(nèi)容包括患者基本信息、入院和住院資料、診療措施等。根據(jù)電子病歷可以查詢到患者住院病程、住院手術(shù)記錄、住院醫(yī)囑、檢驗(yàn)檢查報(bào)告和電子病案庫等信息。

1.6.2 患者標(biāo)本信息管理系統(tǒng)

1.6.2.1 標(biāo)本信息的錄入 將標(biāo)本內(nèi)容包括標(biāo)本編號、姓名、性別、出生年份、年齡、住院號、病區(qū)、床號、取材日期、收到標(biāo)本的時間、體積、分裝數(shù)量、是否配對、治療前、治療結(jié)束、是否凝血、是否溶血、病理號、病理診斷和備注等信息［12］錄入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。

1.6.2.2 標(biāo)本存放及使用信息的錄入 標(biāo)本存放信息錄入的內(nèi)容包括冰箱號、層號、架號、盒號和孔號等。此外，標(biāo)本使用信息錄入的內(nèi)容包括標(biāo)本取走時間、標(biāo)本取走申請人、審批人、課題名稱、課題負(fù)責(zé)人和經(jīng)手人等。標(biāo)本作為不可再生資源，一旦出庫將不復(fù)存在［13］，因此標(biāo)本的取用必須經(jīng)過嚴(yán)格審核，標(biāo)本的使用亦應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進(jìn)行，做到標(biāo)本資源使用的科學(xué)化和合理化。

2 結(jié)果

2.1 組織標(biāo)本收集情況

目前標(biāo)本庫保存的鼻咽癌組織標(biāo)本共1 152例。鼻咽部正常組織標(biāo)本95例。鼻咽慢性炎癥標(biāo)本24例。

2.2 血液標(biāo)本收集情況

目前已收集鼻咽癌患者全血標(biāo)本、血漿標(biāo)本、白細(xì)胞層標(biāo)本和血清標(biāo)本各2 416例。其中治療前1 635例，治療結(jié)束781例，治療前和治療結(jié)束配對499例。血液標(biāo)本和組織標(biāo)本配對614例，其中與治療前、治療結(jié)束的血液標(biāo)本均配對者193例。

3 討論

以往許多組織標(biāo)本的收集總是隨著某項(xiàng)課題研究的開始而開始，同時也隨著該課題的結(jié)題而結(jié)束，這種做法一方面可能出現(xiàn)所收集的標(biāo)本不能完全滿足課題研究的需求，另一方面將不可避免地造成剩余標(biāo)本的浪費(fèi)。一個由專人負(fù)責(zé)、科學(xué)管理、長期保存的標(biāo)本庫有利于標(biāo)本的可持續(xù)收集和使用，同時也使不可再生資源的標(biāo)本得到了最大限度地保護(hù)［14］。

不同類型的組織標(biāo)本宜存放在不同顏色的凍存盒中，以便于分類管理。ID-color 81格2英寸彩色紙冷凍盒是一款有5種顏色的凍存盒。我們建立的標(biāo)本庫，全血標(biāo)本裝在紅色凍存盒，血漿標(biāo)本裝在黃色凍存盒，白細(xì)胞層標(biāo)本裝在白色凍存盒，血清標(biāo)本裝在藍(lán)色凍存盒，組織標(biāo)本裝在綠色凍存盒。每天記錄冰箱的溫度變化，如果溫度異常應(yīng)及時匯報(bào)和處理。每周測量液氮罐中液氮的體積，如果液氮不足，應(yīng)及時聯(lián)系訂購，補(bǔ)充液氮［15］。

腫瘤標(biāo)本庫的建立在促進(jìn)各地腫瘤醫(yī)院科研水平的發(fā)展方面起舉足輕重的作用。鼻咽癌是我省常見腫瘤，福建省腫瘤醫(yī)院作為三級甲等腫瘤專科醫(yī)院，其放射治療科作為福建省的重點(diǎn)學(xué)科，承擔(dān)多項(xiàng)鼻咽癌的基礎(chǔ)及臨床研究項(xiàng)目，建立針對鼻咽癌單病種的標(biāo)本庫對于開展鼻咽癌研究非常重要。我們從2012年開始創(chuàng)辦建立標(biāo)本庫，經(jīng)過幾年努力，目前鼻咽癌標(biāo)本庫已初具規(guī)模，可為鼻咽癌科學(xué)研究提供豐富的組織及血液標(biāo)本，這對促進(jìn)鼻咽癌研究的發(fā)展具有重要意義。

建立一個規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、信息完善的高質(zhì)量鼻咽癌組織標(biāo)本庫將為鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展等機(jī)制的研究及臨床醫(yī)學(xué)研究提供服務(wù)平臺。當(dāng)前如何進(jìn)一步完善各項(xiàng)標(biāo)本庫的管理措施，確保標(biāo)本長期保存的質(zhì)量，建立更科學(xué)的組織標(biāo)本采集、保存和信息化管理體系是需要不斷探索的課題，有關(guān)方面值得深入研究。

［1］Isabelle M，Teodorovic I，Morente MM，et al.TuBaFrost 5：multifunctional central database application for a European tumor bank［J］.Eur J Cancer，2006，42（18）：3103-3109.

［2］Van Geyt C，Van Wijk M，Bokhorst A，et al.Physical examination of the potential tissue donor，what do European tissue banks do?［J］.Clin Transplant，2010，24（2）：259-264.

［3］孫榮國，賈曉蓉.對我國臨床標(biāo)本庫建設(shè)的建議［J］.衛(wèi)生軟科學(xué)，2012，26（9）：772-773.

［4］陸怡.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與生物樣本庫現(xiàn)狀［J］.生命的化學(xué)，2012，32（3）：287-293.

［5］Knox K，Kerr DJ.Establishing a national tissue bank for surgically harvested cancer tissue［J］.Br J Surg，2004，91（2）：134-136.

［6］宋國慧，陳志峰，孟凡書，等.河北省磁縣食管癌高發(fā)現(xiàn)場生物樣本庫建立與管理［J］.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2013，8（2）：154-156.

［7］Qualman SJ，F(xiàn)rance M，Grizzle WE，et al.Establishing a tumour bank：banking，informatics and ethics［J］.Br J Cancer，2004，90（6）：1115-1119.

［8］張慶，郝昱文，岳揚(yáng)，等.科研型肝癌肝移植臨床標(biāo)本庫的建立及意義［J］.中國組織工程研究，2014，18（49）：7985-7989.

［9］高潔，姚英民，丁飛虎，等.建立規(guī)范化肝癌標(biāo)本庫的經(jīng)驗(yàn)及體會［J］.中國實(shí)用外科雜志，2012，32（9）：781-784.

［10］盧文華，彭麗霞，張穎，等.建立鼻咽癌資源庫的經(jīng)驗(yàn)與挑戰(zhàn)［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（13）：1555-1558.

［11］賀明，楊春，葛蓮英，等.腫瘤標(biāo)本庫管理系統(tǒng)的建立與應(yīng)用［J］.中國數(shù)字醫(yī)學(xué)，2010，5（6）：63-74.

［12］劉海洲，崔英，岳慧芬，等.鼻咽癌核心家系成員VCA-IgA抗體檢測結(jié)果分析及家系標(biāo)本庫的建立［J］.微創(chuàng)醫(yī)學(xué)，2011，6（3）：188-190.

［13］葛蓮英，楊春，賀海平，等.腫瘤組織庫的創(chuàng)建和管理方法探索［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（11）：2097-2099.

［14］焦保華，梁朝輝，王苑宇，等.人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本庫的初步建立與管理［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（4）：388-390.

［15］黃東海，章華，范松青，等.鼻咽癌組織庫及其信息管理系統(tǒng)的建立［J］.中華病理學(xué)雜志，2010，39（8）：574-575.