數(shù)字PCR在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究

耿娟　綜述　尹愛華　審校

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州　511442)

數(shù)字PCR在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究

耿娟綜述尹愛華*審校

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州511442)

【摘要】數(shù)字PCR是20世紀(jì)初發(fā)展起來的新型核酸定量技術(shù)，可對微量模板進行絕對定量分析，與傳統(tǒng)定量PCR相比具有更高的準(zhǔn)確性和敏感性。目前數(shù)字PCR已廣泛應(yīng)用于臨床各個領(lǐng)域。而在產(chǎn)前診斷中，因數(shù)字PCR可從高背景母體DNA中識別少量胎兒DNA分子，故其在介入性產(chǎn)前診斷及無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷胎兒非整倍體疾病、單基因病等方面具有重要作用。本文就數(shù)字PCR發(fā)展、原理及其在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用進行綜述。

【關(guān)鍵詞】數(shù)字PCR；產(chǎn)前診斷；絕對定量

1前言

數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)是20世紀(jì)初發(fā)展起來的新型核酸分子定量技術(shù)，通過將微量DNA分子有限稀釋并分液，使每個反應(yīng)室平均含有一個或零個目標(biāo)分子，所有反應(yīng)室進行單分子擴增后通過分析熒光信號進行定量。由于其不依賴于擴增曲線的循環(huán)閾值(CT)，也不必采用內(nèi)參基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，與常規(guī)定量PCR技術(shù)相比，具有更高的準(zhǔn)確性、靈敏性及重復(fù)性[1-3]，在腫瘤標(biāo)記物早期檢測[4-6]、病毒載量檢測[7-9]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。產(chǎn)前胎兒遺傳學(xué)檢測是預(yù)防出生缺陷的重要組成部分，傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷如絨毛穿刺、羊膜腔穿刺及臍靜脈穿刺存在1%～3%的流產(chǎn)風(fēng)險[10]，且產(chǎn)前胎兒組織取材時不可避免混入母體組織，影響了胎兒遺傳物質(zhì)診斷的準(zhǔn)確性；無創(chuàng)產(chǎn)前診斷雖可避免流產(chǎn)風(fēng)險，但孕早期胎兒游離DNA(cell free fetal DNA,cffDNA) 含量低，大量母體DNA的存在對核酸提取技術(shù)及檢驗技術(shù)提出較高要求，而數(shù)字PCR具有在大量背景分子中辨識少量目標(biāo)分子的特點，可望成為胎兒產(chǎn)前基因診斷的重要研究工具。本文將對數(shù)字PCR原理、發(fā)展及其在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用進行綜述。

2數(shù)字PCR概述

2.1數(shù)字PCR發(fā)展1992年Sykes等[11]檢測IgH重鏈突變基因時，采用了有限稀釋和以終點信號的有無進行定量的策略，形成了數(shù)字PCR的雛形。1999年Kenneth Kinzler和Bert Vogelstein[12]在檢測大腸癌患者K-RAS突變時，對樣品采用有限稀釋并增加了反應(yīng)室的數(shù)目，這種方法有效排除了體細(xì)胞干擾，成功檢出微量K-RAS突變，進一步提出了數(shù)字PCR的概念。但是該方法需要人工稀釋DNA樣本，操作步驟繁雜且實驗誤差較大。2003年Liu等[13]在此基礎(chǔ)上提出微流體概念，通過微泵微閥對DNA模板進行自動分液，提高了樣本稀釋精確度，降低了操作誤差，但由于芯片需要定制，成本高昂。直到2011年，QuantaLife公司基于油包水微滴生成技術(shù)研發(fā)出微滴式數(shù)字PCR，其具有高通量、自動化、低成本等優(yōu)點，促進了數(shù)字化PCR走向臨床應(yīng)用。

2.2數(shù)字PCR原理.數(shù)字PCR由有限稀釋、PCR擴增和熒光信號分析3部分組成。有限稀釋是通過人工稀釋、微反應(yīng)閥或微滴發(fā)生器等分液技術(shù)，將DNA分子混合物分散到大量的反應(yīng)室中，每個反應(yīng)室平均含有一個或零個目標(biāo)分子，隨后每個反應(yīng)室分別對目標(biāo)分子進行PCR擴增，在擴增完成后對每個反應(yīng)室的熒光信號進行分析，有熒光信號判讀為1，沒有熒光信號的則判讀為0。由于數(shù)字PCR是一種終端分析法，若目標(biāo)分子沒有很好地離散化，如一些反應(yīng)室包含多個目標(biāo)核酸分子，那么理論上得到的結(jié)果將不準(zhǔn)確，因此引入泊松概率分布函數(shù)(poisson distribution)用以分析數(shù)據(jù)，根據(jù)反應(yīng)室總數(shù)、含有熒光信號的單元數(shù)及樣本的稀釋系數(shù)，可得到樣本的初始濃度[14]。

2.3數(shù)字PCR的分類數(shù)字PCR自20世紀(jì)提出后發(fā)展十分迅速，按照分液技術(shù)的不同，主要分為微孔板、微流體芯片、微滴式3類。

2.3.1微孔板數(shù)字PCR檢測基因突變對疾病診斷具有重要意義，然而常規(guī)的方法只能檢測高于20%的突變，為了提高檢測的靈敏性，Vogelstein等發(fā)明了數(shù)字PCR方法。早期的數(shù)字PCR技術(shù)通過手工稀釋將基因組DNA等分至96/384孔板中，其靈敏度取決于反應(yīng)單元總數(shù)，反應(yīng)單元越多靈敏度和準(zhǔn)確度越高。隨著檢測要求不斷提高，96/384 孔板漸漸無法滿足檢測需要，必須提高反應(yīng)單元總數(shù)，然而傳統(tǒng)的人工加樣步驟繁雜，耗時長，已無法滿足快速精確取樣及高通量的要求，只有高通量自動化加樣設(shè)備才能解決問題。

2.3.2微流體芯片數(shù)字PCR微流體技術(shù)、微電子技術(shù)及納米制造技術(shù)的發(fā)展促進了微流體芯片的產(chǎn)生，微流體芯片進樣和加樣由計算機控制，流路和閥門系統(tǒng)自動操作，通過微流體裝置快速準(zhǔn)確地把流體分散成若干個獨立反應(yīng)室，一次PCR反應(yīng)可進行多步平行反應(yīng)，與微孔板相比大大減少了移液操作，有效地防止了污染發(fā)生，從根本上提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，但微流體芯片價格昂貴限制了其大規(guī)模應(yīng)用。

2.3.3微滴式數(shù)字PCR微滴式數(shù)字PCR來源于乳液PCR技術(shù)，微滴發(fā)生器可一次性生成數(shù)萬至數(shù)百萬個納升甚至皮升級的油包水微滴作為PCR的樣品分散載體，PCR反應(yīng)結(jié)束后檢測每個油包水微滴的熒光信號。2011年Bio-Rad公司基于此方法研發(fā)出的微滴式數(shù)字PCR，可將樣品分成20000個納升級微滴。 2013年Rain Dance公司研發(fā)的Rain Drop 數(shù)字PCR系統(tǒng)可產(chǎn)生100～1000萬個皮升級液滴，該系統(tǒng)除具有超高靈敏度外，還可進行多重 PCR分析。以微滴為單位的PCR反應(yīng)體系更容易實現(xiàn)小容積和高通量,其操作系統(tǒng)簡單,成本低廉,是理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺。

3數(shù)字PCR的臨床應(yīng)用研究

數(shù)字PCR本質(zhì)上是通過單分子擴增把低豐度的基因信號從復(fù)雜背景中分辨出來，因此可用于疾病或病毒的早期診斷或療效監(jiān)測[15]。在腫瘤學(xué)方面[16, 17]，通過檢測患者血漿中特異的腫瘤相關(guān)基因以便早期發(fā)現(xiàn)、早期治療或用于腫瘤術(shù)后監(jiān)測復(fù)發(fā)，使患者預(yù)后監(jiān)測更為可靠，或者檢測腫瘤特異性靶向治療基因，尋求最佳治療方案。Li等[18]通過數(shù)字PCR檢測到早期肺癌患者痰液中MicroRNA表達。在病原微生物的早期檢測中，Ruth HS等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR較定量PCR更早發(fā)現(xiàn)患者外周血中的巨細(xì)胞病毒RNA，為接受細(xì)胞移植或器官移植患者早期抗感染治療提供依據(jù)，降低移植失敗及死亡率。Deborah Persaud等[20]利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)確認(rèn)全球首例HIV感染患兒功能性治愈。而產(chǎn)前診斷中胎兒組織取材通過介入性產(chǎn)前診斷，或無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查中，母血漿DNA都有不同程度的母體污染，可在復(fù)雜背景中辨別微量DNA分子的數(shù)字化PCR也具有廣泛的應(yīng)用前景。

4數(shù)字PCR在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用研究

4.1數(shù)字PCR在有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的應(yīng)用研究研究發(fā)現(xiàn)，通過介入性操作獲得的羊水樣本，未培養(yǎng)時母系污染高達20%[21]，部分還存在胎兒嵌合體核型，如羊膜腔穿刺標(biāo)本存在0.25%的嵌合[22]，絨毛約有1%的嵌合發(fā)生[23]，這些DNA污染和嵌合體會影響胎兒非整倍體診斷的準(zhǔn)確性。數(shù)字PCR技術(shù)在單分子擴增后對樣品DNA精確定量，具有比其他PCR更高的測量精度。2007年，Christina F等[24]使用數(shù)字PCR對正常細(xì)胞DNA、21-三體胎兒細(xì)胞DNA以及二者混合的細(xì)胞DNA進行了研究，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR不僅可準(zhǔn)確區(qū)分正常細(xì)胞和異常細(xì)胞，而且在存在母系污染、嵌合體的情況下數(shù)字PCR仍可保持較高的靈敏性。2009年，Christina F等[25]在絨毛取樣和羊水取樣后的6小時內(nèi)準(zhǔn)確檢測出3例21-三體，3例18-三體和2例13-三體，但由于數(shù)字PCR對X染色體不敏感，漏診1例X染色體嵌合體及1例X-三體。

4.2數(shù)字PCR在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的應(yīng)用研究

4.2.1數(shù)字PCR在染色體非整倍體中的應(yīng)用研究無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷胎兒非整倍體疾病時，由于胎兒游離DNA含量低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性受到大量母體背景DNA影響，而數(shù)字PCR直接計數(shù)目標(biāo)分子數(shù)，因此具有更佳的穩(wěn)定性和定量準(zhǔn)確性。Fan等[26]應(yīng)用微流控芯片檢測21-三體胎兒，通過對比 21號染色體上淀粉樣蛋白基因序列與12號染色體上磷酸甘油醛脫氫酶基因序列拷貝數(shù)的差異，準(zhǔn)確辨別出21-三體胎兒，甚至在胎兒DNA僅占血漿游離DNA總濃度10%時也可檢出，檢測敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于實時PCR和熒光定量PCR。Tong等[27]利用母胎甲基化表達差異與數(shù)字PCR結(jié)合的方法，采用表觀遺傳物-染色體劑量法檢測男性胎兒21-三體，以Y染色體上ZFY基因表達量為內(nèi)參，準(zhǔn)確檢測了5例孕21-三體的孕婦血漿。Lo等[28]以穩(wěn)定表達的1號染色體做參照，采用染色體相對定量方法檢測非整倍體。但實驗中要求胎兒DNA濃度占血漿游離DNA總濃度的25%以上，由于孕婦外周血中胎兒游離DNA濃度平均占6%～10%[29]，目前尚無有效富集胎兒DNA方法，不適用于臨床推廣。Tsui等[30]使用數(shù)字PCR對單核苷酸多態(tài)性等位基因及胎兒游離DNA中PLAC4表達水平定量檢測，檢出4例21-三體胎兒，靈敏度達到100%，特異性為89%，而該方法只能用于檢測雜合子SNP位點。

4.2.2數(shù)字PCR在單基因遺傳病中的應(yīng)用胎兒游離DNA發(fā)現(xiàn)至今，利用胎兒游離DNA檢測單基因遺傳病已成為研究熱點，然而大量的母體DNA背景以及微量的胎兒DNA濃度阻礙了研究進展， Chu[31]提出使用數(shù)字PCR進行單分子等位基因檢測，利用等位基因比值法推斷胎兒是否含有致病基因，首次將數(shù)字化PCR應(yīng)用于無創(chuàng)單基因病診斷。

4.2.2.1常染色體隱性遺傳病2008年Lo[32]采用相對突變劑量法和數(shù)字化核酸片段分選法相結(jié)合的策略，首次應(yīng)用數(shù)字PCR檢測β-地中海貧血，在雙親攜帶相同突變的情況下，通過定量母源性突變DNA和胎兒突變DNA，對胎兒是否遺傳致病基因型進行確診。2012年Lam等[33]對相對突變劑量法進行了改良，依據(jù)父源性的遺傳單倍型，設(shè)計了針對珠蛋白及其外部SNP位點的探針來篩選可提供信息位點，又根據(jù)母源性單倍型將SNP分為α和β兩組，借助數(shù)字PCR技術(shù)推斷胎兒基因型，成功分析了2個β地中海貧血家系。同年，Barrett等[34]通過數(shù)字PCR檢測胎兒Y染色體特異標(biāo)志物DYS14，檢出82%男性胎兒及75%女性胎兒患有鐮刀紅細(xì)胞貧血，說明其精確的定量及高分辨率可解決母體外周血中孕婦外周血胎兒游離DNA含量較低以及高背景母體DNA的問題。

Pornprasert等[35]設(shè)計了兩對引物分別擴增野生型α珠蛋白基因和SEA基因，通過微滴式數(shù)字PCR定量分析，檢出了15例SEA型地貧攜帶者和8例重度α地貧胎兒，證明了微滴式數(shù)字PCR在地貧基因診斷中的有效性。Winston Koh等[36]在診斷甲基丙二酸血癥時采用突變位點等位基因定量結(jié)合游離DNA中胎兒片段檢測法，在陰性對照中識別出11個陽性標(biāo)記，由此推斷胎兒是否遺傳有由父母攜帶的突變基因。該方法不受性別限制，無需大量樣本分析，可用于分析已知突變。

4.2.2.2X連鎖遺傳病Tsui等[37]通過使用數(shù)字PCR檢測X染色體上的基因位點，經(jīng)過相對誘變劑量法分析，在12個樣本中準(zhǔn)確地識別出7個含有血友病突變基因的男性胎兒。在此實驗中，胎兒的基因型最早可在孕11周測定，充分展示了該方法在早期診斷中的潛力。

4.2.2.3胎兒Rh血型鑒定Tsui等[38]采用SNP結(jié)合數(shù)字PCR的策略，在兩位孕婦都是RhD基因突變(IVS3+1 G>A)攜帶者的情況下檢測胎兒RhD基因。盡管胎兒DNA濃度只有4.15%、8.2%，但數(shù)字PCR仍在高濃度母體DNA干擾下成功檢測到胎兒RhD基因陽性。

5展望

數(shù)字PCR技術(shù)是通過單分子擴增降低了背景DNA的影響，極大提高了陽性反應(yīng)中的信噪比，具有超高靈敏度，可用于低濃度DNA的檢測[39]。但作為一項新興技術(shù)，數(shù)字PCR仍存在一些問題，如基于精密儀器和復(fù)雜芯片的微流體數(shù)字PCR成本高昂，通量低；微滴式數(shù)字PCR檢測極低拷貝數(shù)樣本時其檢測結(jié)果不穩(wěn)定，需要多次平行實驗，而且數(shù)字PCR檢測胎兒染色體異常及單基因病尚未建立成熟方法學(xué)，需要更多的病例進行驗證。我們期望未來幾年該技術(shù)不斷發(fā)展、完善，在產(chǎn)前診斷及其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

參 考 文 獻

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編輯：宋文穎

DOI:10.13470/j.cnki.cjpd.2016.01.013

*通訊作者：尹愛華，E-mail：yinaiwa@vip.126.com

【中圖分類號】R394.3

【文獻標(biāo)識碼】A

(收稿日期：2015-09-02)