基于孕婦外周血漿游離胎兒DNA的地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷研究進(jìn)展

王逾男　綜述　尹愛(ài)華　審校

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州　511442)

基于孕婦外周血漿游離胎兒DNA的地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷研究進(jìn)展

王逾男綜述尹愛(ài)華*審校

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州511442)

【摘要】地中海貧血是我國(guó)長(zhǎng)江以南各省發(fā)病率最高、影響最大的單基因遺傳病，目前尚無(wú)有效的治療方法。在地貧高發(fā)地區(qū)有效開(kāi)展婚前、孕前篩查以及對(duì)夫妻雙方攜帶同種地貧基因的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷是預(yù)防重度患兒出生的首選方法。目前胎兒地貧基因檢測(cè)基于有創(chuàng)性手術(shù)獲得胎兒DNA進(jìn)一步基因診斷，有一定的流產(chǎn)和宮內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)。我們迫切需要找到安全、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、早期診斷的方法，cffDNA的發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新篇章，且基于二代測(cè)序平臺(tái)的NIPT技術(shù)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒唐氏綜合征已廣泛應(yīng)用于臨床，其準(zhǔn)確性可達(dá)99%，這為地貧無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究提供了新的思路。本文旨在綜述基于孕婦外周血漿胎兒游離DNA的地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)研究進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】地中海貧血；無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷；游離胎兒DNA

地中海貧血(簡(jiǎn)稱(chēng)“地貧”)是一種因珠蛋白合成障礙所致的遺傳性溶血性疾病，分α地中海貧血 (簡(jiǎn)稱(chēng)“α地貧”)和β地中海貧血(簡(jiǎn)稱(chēng)“β地貧”)兩種。我國(guó)以南方地區(qū)多見(jiàn)，尤以廣東、廣西和海南為甚，是長(zhǎng)江以南各省發(fā)病率最高、影響最大的單基因遺傳病[1]。目前地貧尚無(wú)有效的治療方法，重度α地貧兒一般在出生的24～48小時(shí)之內(nèi)死亡，重度β地貧兒和部分中間型α地貧兒在出生后3～6個(gè)月開(kāi)始出現(xiàn)貧血癥狀并進(jìn)行性加重，嚴(yán)重者必須依靠輸血和聯(lián)合鐵螯合劑的長(zhǎng)期治療，但治療價(jià)格昂貴，而骨髓移植又需要嚴(yán)格的供體，因此目前并沒(méi)有理想的治療方法。故在地貧高發(fā)地區(qū)對(duì)夫妻雙方攜帶同種地貧基因的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷是預(yù)防重度患兒出生的首選方法。目前胎兒地貧基因檢測(cè)基于有創(chuàng)性手術(shù)獲得胎兒DNA進(jìn)一步基因診斷，有一定的流產(chǎn)和宮內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)。我們迫切需要找到安全、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、早期診斷的方法，cffDNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新篇章，而基于二代測(cè)序平臺(tái)的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)(next-generation sequencing-based non-invasive prenatal testing，NIPT)診斷胎兒唐氏綜合征已廣泛應(yīng)用于臨床，其準(zhǔn)確性可達(dá)99%[2]。這些為地貧無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究提供了新的思路。本文旨在綜述基于孕婦外周血漿胎兒游離DNA的地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)研究進(jìn)展。

1cffDNA的發(fā)現(xiàn)與特點(diǎn)

1997年，Lo等[3]選用染色體上特定的SRY基因作為胎兒源性DNA的研究標(biāo)記物，首次用常規(guī)PCR在孕婦血漿中檢測(cè)到cffDNA的存在，為基于孕婦外周血漿中cffDNA的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷走向臨床開(kāi)辟了道路。

與母親外周血中的胎兒細(xì)胞相比，cffDNA相對(duì)豐富，較胎兒細(xì)胞大約多出20倍[3]，于妊娠5周就能從母體血液中檢測(cè)到，妊娠11周即占母體血漿總DNA的0.39%，并隨孕周增長(zhǎng)而增加，于妊娠晚期可達(dá)母體血漿總DNA的6.2%。而胎盤(pán)娩出后，胎兒DNA以16分鐘左右的半衰期從孕婦血漿中清除，產(chǎn)后2小時(shí)即可從母親外周血中完全消失。孕婦血漿DNA由孕婦自身DNA和cffDNA混合組成，其中孕婦自身的DNA占90%以上。cffDNA主要來(lái)源于滋養(yǎng)層細(xì)胞或胎盤(pán)細(xì)胞的凋亡，少量來(lái)源于胎兒血循環(huán)或胎兒細(xì)胞。約85%的胎兒DNA分子片段長(zhǎng)度在100～300 bp之間，而大部分孕婦自身DNA分子片段長(zhǎng)度大于1000 bp，這為利用分子片段大小分離法分離母血漿中胎兒DNA提供了可能性[4]。2010年，Lo團(tuán)隊(duì)借助高通量測(cè)序技術(shù)完成了母血中胎兒的全部組基因組圖譜的繪制，證實(shí)了利用cffDNA進(jìn)行胎兒基因檢測(cè)是完全可行的[5]?；谝陨咸攸c(diǎn)，cffDNA一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便成為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷最理想的靶標(biāo)物質(zhì)。

2基于孕婦外周血漿游離胎兒DNA的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查應(yīng)用研究

cffDNA最先應(yīng)用是檢測(cè)cffDNA中的性別決定基因以排除X連鎖遺傳病和Rhesus D基因?yàn)镽h陰性妊娠婦女的胎兒處置提供診斷依據(jù)，其檢測(cè)準(zhǔn)確性均可達(dá)99%。另外還有胎兒染色體21、18、13-三體、染色體微重復(fù)微缺失綜合征、父源關(guān)系鑒定等檢測(cè)，而雙胎合子類(lèi)型鑒別[6]、囊性纖維化、軟骨發(fā)育不良、亨廷頓式舞蹈病、地中海貧血等單基因遺傳病的產(chǎn)前診斷也迅速成為研究熱點(diǎn)。

2.1染色體非整倍體的檢測(cè)2008年第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)首次應(yīng)用于胎兒非整倍體產(chǎn)前基因檢測(cè)的研究[7]，此后多個(gè)團(tuán)隊(duì)研究表明，NGS可分辨孕有唐氏綜合征患兒的母血中21-三體的總量與孕有正常核型胎兒母血中21-三體的總量的微小差異[8]，以Z值為3作為截?cái)嘀?，可獲得特異性100%，敏感性99%的檢測(cè)結(jié)果[9]。經(jīng)過(guò)相同方法以及標(biāo)準(zhǔn)化Z值分析后，18-三體檢測(cè)敏感性提高至91.9%、13-三體檢測(cè)敏感性100%，特異性98%[9]。目前該方法已廣泛應(yīng)用于臨床。本中心從2012年開(kāi)始研究基于半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)的胎兒21、18、13-三體的產(chǎn)前基因篩查方法[10]，檢測(cè)了1760例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，發(fā)現(xiàn)9例21-三體，3例18-三體、3例13單體，以及1例XO綜合征胎兒，經(jīng)核型分析驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)99%，2015年獲得國(guó)家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)的開(kāi)展高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查和臨床應(yīng)用試點(diǎn)單位，至今已完成數(shù)千例無(wú)創(chuàng)21、18、13-三體產(chǎn)前基因篩查，準(zhǔn)確率達(dá)99%。

2.2染色體微重復(fù)微缺失綜合征的檢測(cè)2011年新英格蘭雜志報(bào)道了1例通過(guò)測(cè)序檢測(cè)胎兒12號(hào)染色體上4.2M的缺失案例[11]，首次報(bào)道了cffDNA在微缺失綜合征中的應(yīng)用研究，此后也有多為學(xué)者針對(duì)染色體微小結(jié)構(gòu)異常的研究。2012年Jensen等[12]利用2例已經(jīng)確診胎兒為22q11.2綜合征孕婦的外周血，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)患者在22q11.2區(qū)域的cffDNA片段含量少于正常孕婦。Srinivasan等[13]隨后選取11位胎兒異常核型的孕婦，測(cè)序結(jié)果提示可檢測(cè)出所有的21-三體綜合征以及微重復(fù)微缺失，不適用嵌合體檢測(cè)，易位樣本可通過(guò)斷裂點(diǎn)附近的小片段缺失判斷斷裂位置，無(wú)法提示平衡易位。通過(guò)提高測(cè)序深度，發(fā)現(xiàn)了諸多染色體核型分析不能分辨的微小病變。本中心從2013年也開(kāi)始研究無(wú)創(chuàng)染色體結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)，利用母胎游離DNA片段比例建立了估算孕婦游離DNA中胎兒的比例的方法，為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了質(zhì)控。并已完成1476例無(wú)創(chuàng)染色體結(jié)構(gòu)異常樣本的檢測(cè)，在測(cè)序量為3M reads時(shí)，對(duì)于大于5M的異常，靈敏度為98.3%，特異度為98.1%。

2.3妊娠相關(guān)疾病母血漿中cffDNA的增加還可作為多種妊娠相關(guān)疾病的臨床診斷指標(biāo)，許多研究定量檢測(cè)母血中cffDNA的含量，發(fā)現(xiàn)在子癇前期、胎盤(pán)源性胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受限、胎盤(pán)植入、早產(chǎn)、以及妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合征的孕婦中，母血中cffDNA的含量異常增高[14]，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此cffDNA可作為諸多病理妊娠的診斷指標(biāo)并可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展變化。但由于其含量個(gè)體差異較大，尚不能確定一個(gè)最優(yōu)閾值來(lái)指導(dǎo)臨床。

2.4單基因病的檢測(cè)單基因遺傳病是由一對(duì)等位基因控制的遺傳性疾病，它的遺傳方式遵循孟德?tīng)柗蛛x定律。位于不同染色體上的致病基因，其遺傳方式也不同，可分為常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、伴X染色體顯性遺傳病、伴X染色體隱性遺傳病、伴Y染色體遺傳病5種。目前，利用cffDNA檢測(cè)胎兒?jiǎn)位蚣膊〉难芯恐饕性诔Ｈ旧w遺傳疾病以及X-連鎖疾病的診斷中，研究疾病包括軟骨發(fā)育不良[15]、多發(fā)性?xún)?nèi)分泌瘤2A型[16]、阿佩爾綜合征[17]、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良[18]、亨廷頓舞蹈癥[19]等共14種，其中，地中海貧血的研究最為熱烈，其他疾病由于人群發(fā)病率較低，僅有少量小樣本的研究報(bào)道。

3地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的研究進(jìn)展

3.1地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷應(yīng)用概述地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究至今大致分為3個(gè)階段：第一階段檢測(cè)父源性致病位點(diǎn)，適用于檢測(cè)父母雙方攜帶不同的地貧致病位點(diǎn)時(shí)此方法僅能通過(guò)陰性結(jié)果排除胎兒致病純合子的可能。針對(duì)不同疾病，突變位點(diǎn)可能為點(diǎn)突變，也可能是幾個(gè)堿基的缺失和重復(fù)，各研究者根據(jù)突變類(lèi)型不同選擇不同的擴(kuò)增方法以及分析方法進(jìn)行研究。第二階段檢測(cè)父源性遺傳序列中雜合度高的STR位點(diǎn)或SNP位點(diǎn)，此方法改進(jìn)了單純檢測(cè)父源性致病基因的方法，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，即夫妻雙方擁有相同的突變位點(diǎn)，也可通過(guò)可提供信息的SNP位點(diǎn)排除胎兒的純合突變，陰性的結(jié)果可避免進(jìn)一步的檢測(cè)，亦因無(wú)需分離cffDNA，減低了技術(shù)難度。但此方法仍局限于檢測(cè)來(lái)自父親的基因突變位點(diǎn)，且需建立與各突變連鎖的有診斷價(jià)值的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，限制了其發(fā)展。第三階段的檢測(cè)借助數(shù)字PCR，高通量測(cè)序技術(shù)等結(jié)合單倍型的相對(duì)定量診斷策略，此方法采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲或者數(shù)字PCR技術(shù)針對(duì)含突變位點(diǎn)區(qū)域分別進(jìn)行正常和突變等位基因的短片段擴(kuò)增，對(duì)母血漿總的游離DNA中的含SNP位點(diǎn)的序列進(jìn)行定量檢測(cè)，分析目標(biāo)區(qū)域中的一組由SNP構(gòu)成的單倍體劑量，確定雙親單倍體型及cffDNA的單倍體信息，從而推斷胎兒的基因型。

3.2α地貧無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的應(yīng)用從2002年開(kāi)始國(guó)內(nèi)外研究者就開(kāi)始了無(wú)創(chuàng)地貧的探索，迄今為止國(guó)內(nèi)外共有10篇文獻(xiàn)進(jìn)行了相關(guān)研究。其研究方向有：①排除性診斷：因雙親攜帶相同類(lèi)型致病基因，無(wú)法通過(guò)檢測(cè)父源性致病位點(diǎn)來(lái)排除父源性遺傳，借助檢測(cè)父源性致病基因連鎖的與母體不同的STR及SNP位點(diǎn)可達(dá)到排除診斷目的。此方法需要在檢測(cè)前篩選父母雙方STR/SNP位點(diǎn)，若夫婦雙方候選位點(diǎn)相同，則不能通過(guò)這種方法檢測(cè)。Ho等[20]2006年發(fā)表了利用SEA斷裂范圍內(nèi)兩個(gè)STR位點(diǎn)排除父源性水腫胎的文章，可排除1/3水腫胎患兒；Yan等[21]于2011年利用SEA缺失范圍內(nèi)9個(gè)SNPs排除父源性水腫胎，診斷率49.3%。②確定性診斷：通過(guò)檢測(cè)缺失后重新拼接的片段，或選擇斷裂范圍內(nèi)的marker，定量檢測(cè)拷貝數(shù)。Chen[22]、Tungwiwat[23]、Pornprasert[24, 25]優(yōu)化了gap-PCR方法，將PCR引物設(shè)置于SEA缺失斷裂點(diǎn)兩端，半巢氏PCR擴(kuò)增，探針或染料熒光定量，發(fā)現(xiàn)孕有重度α地貧兒的孕母外周血中擴(kuò)增拷貝數(shù)高于孕有其他基因型胎兒的孕婦，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Long等[26]選擇α1和α2基因之間、無(wú)其他同源性的一段基因作為目的基因．共管擴(kuò)增α珠蛋白鏈上部分基因，毛細(xì)管電泳分析胎兒兩種產(chǎn)物峰面積來(lái)檢測(cè)Bart’s水腫胎，cffDNA富集依靠瓊脂糖凝膠電泳回收，39例水腫胎中檢出30例。Chen[27]、Pornprasert和Srichotiyakul[28]等針對(duì)野生型以及SEA缺失片段設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別用多重PCR、雙等位基因特異性PCR、QF-PCR擴(kuò)增，應(yīng)用毛細(xì)管電泳或定量ROC曲線(xiàn)分析不同胎兒基因型孕母外周血中兩種產(chǎn)物的比例，統(tǒng)計(jì)推算重度地貧兒△CT值；在Pornprasert試驗(yàn)中，他們僅從7例水腫胎的樣本中檢測(cè)出3例；Sirichotiyakul則可區(qū)分79.2%的重度地貧兒與非重度地貧兒。Ge等[29]應(yīng)用探針捕獲SEA缺失范圍內(nèi)SNPs位點(diǎn)，借助二代測(cè)序，選擇父母雙方純合的SNP位點(diǎn)為靶位點(diǎn)，利用拷貝數(shù)變異，排除水腫胎，但是因?yàn)榇朔椒▽?duì)胎兒濃度要求較高，仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，缺失型α地中海貧血的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷技術(shù)較為單一，分為排除性診斷與確定性診斷兩種，排除性診斷需篩選與確定一組人群特異性標(biāo)簽SNP/STR位點(diǎn)，應(yīng)用時(shí)將標(biāo)簽SNP/STR在夫妻間進(jìn)行分析，檢測(cè)兩者間不同的靶點(diǎn)，此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不具有普適性，難以走向臨床。確定性診斷無(wú)論是通過(guò)Gap-PCR檢測(cè)缺失后重新拼接的片段，或選擇斷裂范圍內(nèi)的marker，定量檢測(cè)拷貝數(shù)，均對(duì)胎兒DNA濃度要求較高，且方法均不穩(wěn)定，檢出率都較低，亦難以達(dá)到臨床檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。

3.3β地貧無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的應(yīng)用自2002年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)對(duì)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)β地貧進(jìn)行了多種方法學(xué)的探討，包括數(shù)字PCR，單個(gè)位點(diǎn)堿基延伸反應(yīng)，位點(diǎn)特異性實(shí)時(shí)PCR，以及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF)等。

與α地貧類(lèi)似，排除性診斷方法研究者們將研究重心聚焦于檢測(cè)父親致病性SNP/STR上，Papasavva等[30]選用β珠蛋白基因中4個(gè)塞浦路斯人高度雜合的11個(gè)SNP位點(diǎn)，并結(jié)合單體型分析的方法，成功地對(duì)10個(gè)家系中8個(gè)樣本進(jìn)行了父源遺傳分析。Li等[31]則利用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)，達(dá)到了100%的敏感度和92.1%的特異度，但該方法僅用于東南亞人群中最常見(jiàn)的5種父源突變，也未對(duì)母親來(lái)源的致病位點(diǎn)進(jìn)行分析。此類(lèi)研究受引物中SNP位置及數(shù)量影響較大，需要建立有效地突變連鎖有診斷價(jià)值的SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)，而且沒(méi)有從數(shù)據(jù)中獲得母親的遺傳給胎兒的位點(diǎn)信息。故排除性診斷的臨床應(yīng)用受到了限制。

二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，極大地促進(jìn)了基于cffDNA進(jìn)行的分子檢測(cè)的靈敏度。Lo團(tuán)隊(duì)[32]對(duì)β地貧家系進(jìn)行全基因組水平的高通量測(cè)序，通過(guò)孕婦外周血血漿DNA獲得了胎兒和孕婦的全基因組圖譜，并成功地檢出1例β地貧攜帶者。該研究通過(guò)父親中的SNP位點(diǎn)推導(dǎo)父源胎兒基因組，利用父親純合但母親雜合的SNP位點(diǎn)推導(dǎo)母源胎兒基因組，然后用RHDO(relative haplotype dosage，RHDO)分析法對(duì)孕婦血漿中單體型的相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算。RHDO的基本原理為，母本染色體成對(duì)存在，來(lái)自母本父親的DNA與來(lái)自母本母親的DNA比例為1∶1，因胎兒會(huì)釋放一些母本DNA進(jìn)入到母親血漿中，導(dǎo)致1∶1失衡。通過(guò)此原理經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)算法，得到胎兒從母本遺傳的基因組。此方法存在測(cè)序成本高昂，操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，RHDO分析方法復(fù)雜等問(wèn)題，從而限制了其在臨床中的應(yīng)用。后續(xù)的研究使用目標(biāo)區(qū)域捕獲方法對(duì)特定區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)。Lam等報(bào)道液相雜交方法進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的捕獲測(cè)序，研究中對(duì)不同單基因的多個(gè)基因組區(qū)域同時(shí)進(jìn)行分析，捕獲覆蓋度達(dá)200次以上，以檢測(cè)HBB基因簇上數(shù)千個(gè)SNPs，然后用目標(biāo)區(qū)域同樣使用RHDO方法進(jìn)行分析。此方法的局限性在于人工定制捕獲探針，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，及捕獲效率低以及RHDO不是直接對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不同種的疾病，需要在待測(cè)基因上下游選擇足夠多的有效SNP及多個(gè)家系特異性SNP，且針對(duì)SNP信息不足的區(qū)域檢測(cè)效果不佳等問(wèn)題。

綜上所述，當(dāng)父母攜帶不同的β地貧致病位點(diǎn)時(shí)，排除性診斷是有診斷價(jià)值的；當(dāng)父母攜帶β地貧致病位點(diǎn)相同時(shí)，排除性診斷需要通過(guò)尋找父母不一致的SNP位點(diǎn)來(lái)解決，此類(lèi)研究受引物中SNP位置及數(shù)量影響較大。目前主流的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)方法均基于父母及胎兒?jiǎn)误w型。其存在的問(wèn)題包括：對(duì)胎兒及父母進(jìn)行全基因組SNP分析，成本昂貴；數(shù)字PCR的單體型鑒定，操作復(fù)雜煩瑣，實(shí)驗(yàn)的成功受GC含量和分析區(qū)域的SNP分布影響；且RHDO不是直接對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不同種的疾病，需要在待測(cè)基因上下游選擇足夠多的有效SNP及多個(gè)家系特異性SNP；由于cfDNA含量較低而導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，且無(wú)法解決特異性擴(kuò)增帶來(lái)的偏差；需要人工定制捕獲探針，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。故迄今，β地貧的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷還無(wú)法走向臨床。

4地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的展望

地貧無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷是產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用研究領(lǐng)域的重要發(fā)展方向，可對(duì)胎兒進(jìn)行早期的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)。迄今為止，由于全基因組SNP分析成本昂貴，數(shù)字PCR的單體型鑒定操作復(fù)雜煩瑣，捕獲探針效率低且人工定制導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，cfDNA含量較低而導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，且無(wú)法解決特異性擴(kuò)增帶來(lái)的偏差等原因地貧無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷還無(wú)法走向臨床。而針對(duì)無(wú)創(chuàng)單基因病循環(huán)單分子擴(kuò)增和重測(cè)序技術(shù)[33]的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)方法的發(fā)現(xiàn)，大大提高cffDNA在擴(kuò)增中的利用率，同時(shí)引入了barcode序列，消除了因擴(kuò)增特異性帶來(lái)的不同序列比例的影響，理論上有望應(yīng)用于地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)。我們寄希望于更多方法學(xué)的探索與發(fā)展，推動(dòng)地中海貧血無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)早日走向臨床。

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編輯：宋文穎

DOI:10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.012

*通訊作者：尹愛(ài)華，E-mail：yinaiwa@vip.126.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R714.55

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

(收稿日期：2015-09-15)