移居高原不同時間健康人群血液HIF-1α、VEGF、EPO水平的變化及意義※

趙　振，多　杰

(青海省人民醫(yī)院呼吸科，西寧 810007)

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移居高原不同時間健康人群血液HIF-1α、VEGF、EPO水平的變化及意義※

趙振，多杰*

(青海省人民醫(yī)院呼吸科，西寧 810007)

摘要目的檢測移居高原不同時間健康人血液HIF-1α、VEGF 、EPO水平的情況，并探討其意義。方法選取移居高原(平均海拔4，200m)健康漢族120例及平原(平均海拔400m)健康漢族30例。分為移居高原1周組、1月組、1年組、5年組及平原組五組，每組各30例。采用ELISA 法及real-time PCR法分別檢測各組血液中HIF-1α、VEGF、EPO的蛋白及mRNA表達(dá)水平，并行相關(guān)意義分析。結(jié)果移居漢族不同時間組HIF-1α、VEGF及EPO的表達(dá)均高于平原組(P<0.05)，隨高原低氧暴露時間的逐漸延長移居漢族HIF-1α水平逐漸下降(P<0.05)，VEGF、EPO水平則隨時間延長呈進(jìn)行性升高(P<0.05)；HIF-1α、VEGF、EPO的mRNA表達(dá)水平與其血清蛋白表達(dá)水平的變化趨勢一致。結(jié)論移居高原不同時間健康人群血液VEGF及EPO水平與HIF-1α的表達(dá)變化并不完全一致。

關(guān)鍵詞高原時間HIF-1αVEGFEPO

EXPRESSIOINS AND SIGNIFICANTS OF BLOOD HIF-1α，

VEGF AND EPO IN HEALTHY PEOPLE IMMIGRATING TO HIGH

ALTITUDE AT DIFFERENT TIME※

Zhao Zhen，Duo Jie*

(Respiratory Department of Qinghai Provincial People′s Hospital，Xining，810007)

Abstract ObjectiveTo investigate the expressions of blood hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)，vascular endothelial growth factor(VEGF)and Erythropoietin(EPO)in healthy people who immigrating to high altitude at different time，and discusses their clinical significance.Methods 120 Han people immigrating to high altitude and 30 Han people in low altitude area were selected and divided into five groups，immigrating 1 week group，1 month group，1 year group，5 year group and low altitude group，with 30 persons in each group.HIF-1α，VEGF and EPO protein and mRNA levels were measured using ELISA and real-time PCR methods，and analyzed the related significance.Results The levels of HIF-1α，VEGF and EPO in people who immigrating to high altitude at different time were all higher than those in low altitude group.The levels of HIF-1α in Han populations immigrating to high altitude were decreased gradually with the exposure time(P<0.05).Levels of VEGF and EPO in immigrating Han populations were increased gradually with exposure time(P<0.05).HIF-1α，VEGF and EPO mRNA expression changed in a similar manner as their protein expressions.Conclusions The levels of blood VEGF and EPO in healthy people immigrating to high altitude at different time were not changed in a similar manner as the HIF-1α expression.

KeywordsHigh AltitudesDifferent TimeHIF-1αVEGFEPO

在機(jī)體的低氧調(diào)節(jié)適應(yīng)過程中，低氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)扮演著十分重要的角色。目前，關(guān)于HIF-1α、VEGF及EPO的研究主要集中在急慢性高原病及腫瘤等方面，而對于移居高原不同時間下健康習(xí)服和適應(yīng)人群HIF-1α、VEGF及EPO表達(dá)變化規(guī)律的研究角度不一。本研究通過檢測移居高原不同時間下健康漢族HIF-1α、VEGF及EPO的mRNA及蛋白表達(dá)水平，并與平原健康漢族做對照，初步明確其表達(dá)意義。

1材料與方法

1.1研究對象

選取移居青海省果洛藏族自治州(平均海拔4，200m)健康漢族120例及平原(西安地區(qū)，平均海拔400m)健康漢族30例。分為五組：移居高原1周組、1月組、 1年組、5年組及平原組，每組各30例。以上各組人群年齡、性別比例無統(tǒng)計學(xué)差異，無吸煙、飲酒史，無心、肺、腦、肝、腎等基礎(chǔ)病史，經(jīng)常規(guī)體檢(行血常規(guī)、肝功、腎功、胸片、心電圖、肺功能等檢查)證實身體健康，所有實驗參與者均知情同意并簽字。

1.2研究方法

1.2.1主要儀器及試劑

450 nm 分光光度計 ( 北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司 )，ABI7500 熒光實時定量儀( 美國 ABI 公司 )，DU800核酸蛋白儀(BECKMAN德國)，冷凍離心機(jī)(BECKMAN德國)，人HIF-1α、VEGF 、EPO ELISA檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)，血液RNA 提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生物制劑有限公司)，2×SYBR Premix Ex Taq(美國ABI公司)。

1.2.2檢測標(biāo)本

所有受試者于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取肘前靜脈血5 mL，離心(4℃，3000r/min)15 min，分離血清，將血清和血細(xì)胞分別編號置于液氮罐保存。

1.2.3引物濃度及序列(表1)

表1人血液HIF-1α、VEGF、EPO及內(nèi)參基因β-actin引物濃度及序列

Table 1 Primers sequences of HIF-1α，VEGF，EPO and β-actin

1.2.4血清HIF-1α、VEGF及EPO蛋白水平檢測方法

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。

1.2.5血液HIF-1α、VEGF及EPO mRNA水平檢測方法

首先采用離心柱法提取血液總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。Real-time PCR反應(yīng)體系(20μL體系)為：2×SYBR Select Master Mix 10 μL，第一鏈cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，滅菌雙蒸水7.2 μL。實驗在ABI7500熒光實時定量PCR儀中進(jìn)行，每個樣品設(shè)3個重復(fù)孔，目的基因與內(nèi)參基因的PCR反應(yīng)條件一致， 50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，ABI Prism7500軟件采集數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法分別計算HIF-1α、VEGF及EPO mRNA表達(dá)水平。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1血清HIF-1α、VEGF及EPO蛋白表達(dá)水平(表2)

Table 2±s)

注：*與平原組比較P<0.05；△與移居1周組比較P< 0.05；☆與移居1月組比較P< 0.05；★與移居1年組比較P< 0.05.

表2顯示，移居漢族不同時間組血清HIF-1α、VEGF及EPO的表達(dá)水平均高于平原組；隨高原低氧暴露時間的逐漸延長移居漢族血清HIF-1α水平逐漸下降(P<0.05)；血清VEGF、EPO水平則呈進(jìn)行性升高(P<0.05)。

2.2血液HIF-1α、VEGF及EPO mRNA表達(dá)水平(表3)

Table 3±s)

注：*與平原組比較P<0.05；△與移居1周組比較P<0.05；☆與移居1月組比較P<0.05；★與移居1年組比較P<0.05.

表3顯示，各組血液HIF-1α、VEGF及EPO的mRNA表達(dá)水平與其血清蛋白表達(dá)水平的變化趨勢基本一致。

3討論

已知HIF-1參與了機(jī)體眾多與氧平衡調(diào)節(jié)有關(guān)的生理過程，低氧條件下，HIF-1α降解途徑阻遏，并與HIF-1β結(jié)合，從而引起機(jī)體一系列的生理反應(yīng)，維持機(jī)體的氧代謝平衡[1]。由HIF-1α調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的下游基因有EPO、VEGF基因等，它可通過調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，引起組織細(xì)胞對低氧產(chǎn)生一系列適應(yīng)性反應(yīng)，包括促進(jìn)血管生成、紅細(xì)胞生成、調(diào)節(jié)血管舒縮功能等[2-3]。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)人急進(jìn)高原時，由于空氣中氧含量的急劇下降，組織細(xì)胞內(nèi)的氧分壓明顯降低，從而刺激機(jī)體HIF-1α的表達(dá)升高，以維持機(jī)體的氧平衡，隨著移居高原時間的逐漸延長，HIF-1α的表達(dá)水平逐漸降低，在1月即刻起即會出現(xiàn)明顯下降，并且隨時間推移越來越低。其原因是由于隨著低氧暴露時間的逐漸延長，即慢性低氧可下調(diào)HIF-1α的基因表達(dá)水平[4-5]，從而使機(jī)體耐受低氧的能力逐漸下降。

VEGF是最為關(guān)鍵的血管生長促進(jìn)因子[6]，低氧是VEGF表達(dá)的最主要調(diào)節(jié)因素之一，VEGF表達(dá)增高可使血管擴(kuò)張、新生，組織血管密度增高，以增加局部組織血供，改善組織缺氧。本研究結(jié)果顯示，移居漢族的VEGF表達(dá)水平隨時間的延長呈進(jìn)行性增高，這是機(jī)體適應(yīng)高原低氧的結(jié)果，但VEGF的過度表達(dá)可導(dǎo)致組織長期淤血，血管新生使組織結(jié)構(gòu)變化，出現(xiàn)病理狀態(tài)，導(dǎo)致慢性高原病的發(fā)生，這在一定程度上為移居漢族隨高原居住時間的逐漸延長慢性高原病發(fā)病率較高提供了一定論據(jù)。

EPO與其受體結(jié)合作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使它發(fā)生增生和遷移，在人體組織抵抗缺氧、組織細(xì)胞抵抗凋亡等方面發(fā)揮作用[7]。還有研究發(fā)現(xiàn)，EPO參與了血管生成，并且EPO在其中發(fā)揮的作用與VEGF類似[8]，在新生血管的產(chǎn)生過程中，EPO發(fā)揮了重要作用，可以看作是一個促血管生成因子。當(dāng)機(jī)體暴露于高原環(huán)境時，低氧刺激腎臟及腎外低氧感受器，誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，從而調(diào)控EPO的合成，使其釋放增加，進(jìn)而引起紅系增殖，這也是機(jī)體自適應(yīng)低氧環(huán)境的重要因素。但若長期處于嚴(yán)重低氧環(huán)境，機(jī)體誘導(dǎo)EPO生成的因素會持續(xù)存在，使體內(nèi)的EPO持續(xù)高表達(dá)，導(dǎo)致紅細(xì)胞異常增殖、血液粘滯度增高，形成了“缺氧-紅系增生-血液淤滯-加重缺氧”的惡性循環(huán)，引起紅細(xì)胞增多癥及其他衍生疾病。本研究結(jié)果顯示，移居漢族的EPO水平隨時間的延長呈進(jìn)行性增高，說明移居漢族隨高原居住時間的逐漸延長，在適應(yīng)高原低氧環(huán)境的同時，紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生率也可能會逐漸升高。

已知HIF-1α是VEGF及EPO的上游調(diào)控基因，可誘導(dǎo)VEGF及EPO的表達(dá)。但本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF及EPO的表達(dá)并不完全與HIF-1α的水平變化一致。隨著移居高原時間的延長，HIF-1α的水平進(jìn)行性下降，而VEGF及EPO的表達(dá)則逐漸升高，其原因可能為[9-11]，VEGF及EPO表達(dá)除了受HIF-1α調(diào)控外，也受到HIF-2α的調(diào)控。HIF-2α在低氧條件下能穩(wěn)定表達(dá)，是血管生成[9]、調(diào)節(jié)EPO產(chǎn)生和紅細(xì)胞生成[10]的核心分子，在維持細(xì)胞氧平衡過程中可部分代替HIF-1α的作用[11]。低氧條件下VEGF及EPO的表達(dá)沒有隨著HIF-1α表達(dá)水平的降低而下降，可能是由于HIF-2α上調(diào)了VEGF及EPO的表達(dá)，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本課題通過對移居高原不同時間下健康習(xí)服和適應(yīng)漢族人群HIF-1α、VEGF及EPO表達(dá)水平的研究，在一定程度上為移居人群容易罹患各類慢性高原疾病提供了論據(jù)，也為高原低氧適應(yīng)機(jī)制的進(jìn)一步研究以及急慢性高原病的防治提供了思路。

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收稿日期2015-03-04

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.04.002

中圖分類號R363.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

※：青海省衛(wèi)計委醫(yī)藥衛(wèi)生科研指導(dǎo)性計劃項目(2012)

趙振(1981~)，男，漢族，山東籍，碩士，主治醫(yī)師.*：通訊作者，青海省人民醫(yī)院呼吸科