新疆核桃分心木總皂苷和總黃酮的體外抗氧化活性

令狐晨， 謝姆西努爾·阿卜來提， 阿依吐倫·斯馬義

(新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 新疆 烏魯木齊　830011)

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新疆核桃分心木總皂苷和總黃酮的體外抗氧化活性

令狐晨， 謝姆西努爾·阿卜來提， 阿依吐倫·斯馬義*

(新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 新疆 烏魯木齊830011)

摘要：為了研究新疆核桃分心木中總皂苷和總黃酮的抗氧化活性，以VC作為陽性對(duì)照，檢測了核桃分心木中總皂苷和總黃酮對(duì)超氧陰離子(-O2)、羥基自由基(-OH)、DPPH等的清除作用，并對(duì)總皂苷和總黃酮的還原能力進(jìn)行了測定.結(jié)果表明：總皂苷和總黃酮均具有較好的對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基等的清除能力和鐵還原能力，并在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)成量效關(guān)系.核桃分心木總皂苷和總黃酮均具有較強(qiáng)的抗氧化活性.

關(guān)鍵詞：核桃分心木; 總皂苷; 總黃酮; 抗氧化

0引言

新疆核桃分心木(DiaphragmaJuglandisFructus)是胡桃科核桃屬植物——核桃的果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜，其多彎曲、破碎而不整齊；表面呈淡棕色至棕褐色，或棕黑色，略有光澤；質(zhì)脆，易折斷，氣微，味微苦.核桃分心木主要用于治療腎虛、遺精、滑精、遺尿、尿血、帶下、瀉痢等癥[1-3].

抗氧化劑主要是通過終止自由基鏈反應(yīng)從而清除自由基，起到保護(hù)機(jī)體的作用.因此，尋找適當(dāng)?shù)耐庠葱钥寡趸瘎┣宄w內(nèi)自由基，對(duì)治療疾病和保護(hù)人體健康很有益處.

植物中存在眾多消除活性氧自由基的抗氧化劑.已有文獻(xiàn)報(bào)道，植物中的黃酮[4]、皂苷[5]等活性物質(zhì)具有一定的抗氧化活性，但有關(guān)核桃分心木總皂苷和總黃酮的體外抗氧化活性研究在國內(nèi)外卻尚未見相關(guān)報(bào)道，導(dǎo)致人們對(duì)分心木的藥用價(jià)值沒有充分地認(rèn)識(shí)，嚴(yán)重浪費(fèi)了該藥用資源.

為合理利用該植物資源并確定其主要的抗氧化活性成分，本實(shí)驗(yàn)通過提取核桃分心木總皂苷及總黃酮成分，研究了其體外抗氧化活性，從而為探索核桃分心木這種維藥的藥理作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)，并為核桃分心木的綜合開發(fā)提供了理論依據(jù).

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　材料與試劑

齊墩果酸對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)YY20110428)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)YA0709SA14)；核桃分心木(購于新疆和田地區(qū)，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿布利孜教授鑒定為胡桃科植物胡桃果核的干燥木質(zhì)隔膜)；高氯酸、冰醋酸、甲醇、濃硫酸、乙醇、石油醚、正丁醇、DPPH溶液、水楊酸、硫酸亞鐵溶液、雙氧水、磷酸鹽緩沖溶液(pH=8.2)、鄰苯三酚、乙酸乙酯、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸等均為分析純?cè)噭?，均購于天津富宇精?xì)化工有限公司.

1.2　儀器與設(shè)備

UV2250型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；EYELAN-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SK3200H型超聲清洗儀(上海漢克科學(xué)儀器有限公司)； ABl04-N型多功能電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；FW135型粉碎機(jī)(北京永光明醫(yī)療儀器廠).

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1核桃分心木總黃酮的提取

稱取核桃分心木50 g，加入400 mL 50%的乙醇溶液，同時(shí)放入到超聲清洗機(jī)中進(jìn)行超聲20 min，對(duì)溶液進(jìn)行過濾，棄濾渣，濃縮濾液得浸膏，浸膏加入200 mL水溶解，用200 mL的石油醚萃取3次，石油醚層棄去，再用乙酸乙酯200 mL萃取，萃取3次，將乙酸乙酯萃取液合并濃縮，得總黃酮樣品，加50%乙醇定容至100 mL[6].

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系吸光光度法測定總黃酮的含量[7].以蘆丁為對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=12.369C-0.015 8(r=0.999 9)，其中,吸光度(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，檢測波長為506 nm，測定其提取率及質(zhì)量濃度.

1.3.2核桃分心木總皂苷的提取

稱取核桃分心木25 g，加入80%乙醇625 mL，80 ℃水浴回流提取2 h，回流2次，過濾，水浴揮干，加蒸餾水適量超聲使其溶解，用等體積的正丁醇萃取3次，將正丁醇萃取液合并并濃縮，得總皂苷的樣品，加80%乙醇定容至100 mL.

采用5%香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色體系吸光光度法測定總皂苷的含量[8].以齊墩果酸為對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=39.221C-0.026 4(r=0.999 2)，其中,吸光度(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，檢測波長為563 nm,測定其提取率及質(zhì)量濃度.

1.3.3DPPH自由基清除能力測定[9]

用制備的總黃酮和總皂苷分別配成濃度合適的樣品溶液1 mL，加入4 mL濃度為0.004%的DPPH溶液，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測其吸光度Ai;取4 mL不同濃度的樣品液，加入1 mL甲醇測定吸光度值為Aj;取4 mL 0.004% DPPH溶液,加入1 mL甲醇測定吸光度值為A0.重復(fù)三次，分別計(jì)算樣品對(duì)DPPH的清除率.計(jì)算公式為：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]*100% .

1.3.4羥基自由基清除能力測定[10]

取1 mL濃度為4.5 mmol·L-1的硫酸亞鐵，加入1 mL濃度為4.5 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液，再加不同濃度的樣品液1 mL，最后加1 mL 4.4 mmol·L-1的H2O2反應(yīng)，于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在510 nm處測吸光值.用1 mL蒸餾水代替1 mL不同濃度的樣品液所測得樣品的吸光值為A0；用1 mL樣品液代替1 mL蒸餾水所測得樣品的吸光值為Ax；用1 mL蒸餾水代替1 mL雙氧水所測得的吸光值為Axo.重復(fù)三次，清除率按下式計(jì)算：

清除率(%)=[1-(Ax-Axo)/A0]*100%.

1.3.5超氧陰離子自由基清除能力測定[11]

采用鄰苯三酚自氧化法[12,13]，取5 mL 0.15 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH=8.2)與1 mL樣品液混合，于25 ℃恒溫水浴15 min，加入0.2 mL濃度為45 mmol·L-1的鄰苯三酚，搖勻，在第四分鐘時(shí)加入10 mol·L-1鹽酸1滴終止反應(yīng)，于325 nm處測定樣品吸光值為A1；用0.2 mL蒸餾水代替0.2 mL的45 mmoL·L-1鄰苯三酚所測定的吸光值為A2；用1 mL溶劑代替1 mL樣品液所測定的吸光值為A3.重復(fù)三次，清除率按下式計(jì)算：

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]*100%.

1.3.6Fe3+還原能力測定

將0.25 mL不同濃度的樣品液、0.25 mL pH 6.6的磷酸緩沖溶液和0.25 mL1%的鐵氰化鉀混合，于50 ℃水浴20 min后加入10%三氯乙酸溶液0.25 mL，500 r·min-1離心10 min,取上清液0.5 mL加蒸餾水2.5 mL和0.2%三氯化鐵溶液0.1 mL，搖勻,室溫下靜置10 min，在700 nm 處測吸光值.

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算IC50.

2結(jié)果與討論

2.1　總皂苷和總黃酮的含量

經(jīng)計(jì)算，核桃分心木總皂苷的提取率為2.7%，在實(shí)驗(yàn)中定容至100 mL的總皂苷提取液中，總皂苷的質(zhì)量濃度為6.78 mg·mL-1.

核桃分心木總黃酮的提取率為4.2%，在實(shí)驗(yàn)中定容至100 mL的總黃酮提取液中，總黃酮的質(zhì)量濃度為21.02 mg·mL-1.

2.2　對(duì)DPPH自由基的清除能力

如圖1所示，核桃分心木總皂苷和總黃酮對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力.總皂苷和總黃酮在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)量效關(guān)系.當(dāng)總皂苷的濃度為5 ug·mL-1時(shí)，其清除率為32.74%.隨著總皂苷質(zhì)量濃度的增大，其清除能力增加；當(dāng)總黃酮濃度為16 ug·mL-1時(shí)，其清除率為28%.隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增大，其清除能力增加.當(dāng)總黃酮的質(zhì)量濃度為64 ug·mL-1時(shí)，清除率基本達(dá)到最大值70.3%，此后再增加總黃酮的質(zhì)量濃度，清除率基本無明顯變化.

VC、總皂苷、總黃酮的IC50分別為9.428 ug·mL-1、8.296 ug·mL-1、44.291 ug·mL-1.從IC50數(shù)據(jù)可知，總皂苷在清除DPPH自由基的能力方面基本和VC相當(dāng)，而總黃酮的效果不如VC.

圖1　VC、分心木總皂苷和總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.3　對(duì)羥基自由基的清除能力

核桃分心木對(duì)羥基自由基的清除能力結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，總皂苷和總黃酮對(duì)羥基自由基都表現(xiàn)出了一定的清除能力，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系.總皂苷和總黃酮在質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1時(shí)，其清除率分別為36%、23.7%.隨著質(zhì)量濃度的增大，兩者清除能力增加.當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1.6 mg·mL-1時(shí)，兩者的清除率基本達(dá)到最大值.此后，繼續(xù)增加質(zhì)量濃度，兩者的清除率均基本無明顯變化.

VC、總皂苷、總黃酮的IC50分別為0.054 mg·mL-1、0.934 mg·mL-1、1.193 mg·mL-1.從IC50數(shù)據(jù)可知，總皂苷和總黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力不如VC，但總黃酮和總皂苷兩組在濃度梯度之間存在差異性(p<0.05)，在相同濃度下，總皂苷對(duì)羥基自由基的清除能力比總黃酮強(qiáng).

圖2　VC、分心木總皂苷和總黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力

2.4　對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

由圖3可知，總皂苷和總黃酮在清除超氧陰離子自由基方面有著較強(qiáng)的能力,且在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系.總皂苷質(zhì)量濃度在1~8 mg·mL-1之間時(shí)，對(duì)該自由基的清除率為38.65%～85.4%；總黃酮質(zhì)量濃度在1～8 mg·mL-1之間時(shí)，對(duì)該自由基的清除率為31.9%~75.4%.

VC、總皂苷、總黃酮的IC50分別為0.103 mg·mL-1、2.208 mg·mL-1、3.340 mg·mL-1.從IC50數(shù)據(jù)可知，總皂苷和總黃酮在對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力方面不如VC，但總黃酮和總皂苷兩組在濃度梯度之間存在差異性(p<0.05)，在相同濃度下，總皂苷對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力比總黃酮強(qiáng).

圖3　VC、分心木總皂苷和總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

2.5　Fe3+還原能力測定

由圖4可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，總皂苷和總黃酮的還原能力與其質(zhì)量濃度成明顯的量效關(guān)系.總皂苷和總黃酮的還原效果都不如VC，但是總黃酮和總皂苷具有一定的抗氧化性.

圖4　VC、分心木總皂苷和總黃酮的Fe3+還原能力測定

3結(jié)論

據(jù)報(bào)道，抗氧化劑能夠預(yù)防各種由自由基引起的與老化相關(guān)的疾病.例如，動(dòng)脈硬化、糖尿病、心血管病、老年性癡呆、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎等，這些疾病都被認(rèn)為與自由基相關(guān)[14,15].傳統(tǒng)合成的抗氧化劑具有副作用，不易長期使用.故從植物中尋找天然的抗氧化劑越來越受到研究者的關(guān)注.目前，有關(guān)核桃分心木的抗氧化活性方面鮮有報(bào)道，因此，對(duì)核桃分心木藥材的認(rèn)識(shí)不充分，造成了藥用資源的浪費(fèi).

本實(shí)驗(yàn)研究了核桃分心木總皂苷和總黃酮的體外抗氧化活性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：總皂苷和總黃酮都具有一定的體外抗氧化活性，均具有較好的DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力和鐵還原能力.但是,其抗氧化性方面都比VC弱，可能原因是總黃酮和總皂苷含有一定的雜質(zhì)，并不是單一的化合物.

本實(shí)驗(yàn)對(duì)核桃分心木抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步對(duì)核桃分心木分離純化所得單體的藥理活性的研究奠定了基礎(chǔ)，亦為開發(fā)利用核桃分心木藥用資源提供了一定的理論基礎(chǔ).

今后的研究將對(duì)總皂苷和總黃酮進(jìn)行進(jìn)一步分離、純化、鑒定，以得到單體成分，并探討抗氧化的單體成分，這可為更深入的生物活性研究及藥材開發(fā)提供理論參考.

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【責(zé)任編輯：晏如松】

In vitro antioxidant activity of saponins and flavonoids

from xinjiangDiaphragmaJuglandisFructus

LINGHU Chen, Xmnuer·Abulaiti, Aytulun·Simayil*

(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Abstract:To research antioxidant activity in vitro of total saponins and total flavonoid from Diaphragma Juglandis Fructus,Using VC as a positive control,the antioxidant activity in vitro of total saponins and total flavonoid from Diaphragma Juglandis Fructus were evaluated by scavening rates against DPPH,superoxide anion,hydroxyl radicals and ferric reduing antioxidant power.The results showed that both total saponins and total flavonoid had savening effects on DPPH,superoxide anion,hydroxyl radicals and ferric reduing antioxidant power.Over the studied concentration range,the radical scavening activity had a dose-effect relationship.Total saponins and total flavonoid from Diaphragma Juglandis Fructus have strong antioxidant activity.

Key words:Diaphragma Juglandis Fructus; total saponins; total flavonoids; antioxidant activity

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2016)01-0134-04

通訊作者:阿依吐倫·斯馬義(1959-),女，烏孜別克族，新疆烏魯木齊人，教授，碩士生導(dǎo)師,研究方向：藥物分析和天然藥物化學(xué)，aytulunss@126.com

作者簡介:令狐晨(1992-)，女，山西運(yùn)城人，在讀碩士研究生，研究方向：新疆地方藥用植物

基金項(xiàng)目：烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(Y121310009)