冠突散囊菌液體發(fā)酵工藝的研究

李文娟， 呂嘉櫪， 閆亞梅， 王霄鵬

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安　710021)

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冠突散囊菌液體發(fā)酵工藝的研究

李文娟， 呂嘉櫪*， 閆亞梅， 王霄鵬

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安710021)

摘要：以陜西茯磚茶中優(yōu)勢菌群冠突散囊菌為實驗菌株，采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，研究了不同培養(yǎng)基成分、不同培養(yǎng)條件對菌絲球生長的影響.實驗結(jié)果表明優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：土豆20%、蔗糖4%、硝酸銨0.3%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.03%；最適合菌絲球生長發(fā)育的理化因素為：培養(yǎng)溫度28 ℃、搖瓶轉(zhuǎn)速為120 r/min、pH5.0、搖瓶裝液量25%、發(fā)酵時間7 d、種子培養(yǎng)時間為5 d.

關(guān)鍵詞：冠突散囊菌； 液體發(fā)酵； 菌絲體

0引言

某些絲狀真菌在液體搖床培養(yǎng)條件下能自動聚集成球狀，所得菌體生長代謝活躍，有利于有效成分的積累.菌絲球的形成受自身條件和外界條件

的影響[1]，菌種的性質(zhì)和培養(yǎng)條件都會影響菌絲球的大小和致密程度，從而影響發(fā)酵生產(chǎn)的效率，實踐證明小而致密的菌絲球比表面積大，能充分利用營養(yǎng)且易于過濾.因此，從理論和實踐上解決如何形成小而致密的菌絲球，對工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)有指導(dǎo)意義.

冠突散囊菌[2-5]是茯磚茶中的優(yōu)勢菌群，在茯磚茶“發(fā)花”過程中通過控制外界的條件可以促使其生長繁殖，產(chǎn)生金黃色素的閉囊殼，俗稱“金花”，邊區(qū)消費者歷來根據(jù)“金花”的質(zhì)量和數(shù)量來判斷茯磚茶品質(zhì)，邊區(qū)有“茶好金花開，花多茶質(zhì)好”之說.

由于冠突散囊菌的存在，賦予了茯磚茶特有的色、香、味[5,6]，并且具有促消化、降脂減肥、抑制腫瘤細(xì)胞和治療心血管疾病[7-10]等保健功效.冠突散囊菌在固體培養(yǎng)時，呈現(xiàn)大片的金黃色菌落，長勢旺盛，但是不適合大規(guī)模的生產(chǎn)；利用現(xiàn)代液體發(fā)酵技術(shù)對冠突散囊菌進(jìn)行培養(yǎng)，周期短、成本低、產(chǎn)量大，可以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，而且發(fā)酵液和菌絲體中含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸[11-13]等人體益生成分，營養(yǎng)價值高，其中多糖時具有營養(yǎng)保健價值的內(nèi)含成分.

鄧放明等[14]利用冠突散囊菌發(fā)酵液分離出胞外多糖，選用PPARs、K526、HepG2模型初步研究其降脂和抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)胞外多糖對PPARα、PPARγ、PPARδ3中模型均有活性.呂嘉櫪等[15]對冠突散囊菌發(fā)酵液進(jìn)行了研究，證明冠突散囊菌液體發(fā)酵液提取液中含有降脂成分洛伐他汀，分別為酸式洛伐他汀和酯式洛伐他汀.

本文以陜西茯磚茶中優(yōu)勢菌群冠突散囊菌為試驗菌株，研究不同培養(yǎng)基成分、不同培養(yǎng)條件冠突散囊菌菌絲球形成的影響，為冠突散囊菌菌絲體及其發(fā)酵液的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論參考，同時對其實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)生積極的指導(dǎo)作用.

1材料與方法

1.1　菌株和培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基：CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基(蔗糖4 g、NH4NO30.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NaCl 5 g、瓊脂2 g、水100 mL，121 ℃滅菌20 min).

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(將馬鈴薯清洗干凈、去皮切成小塊，稱取200 g馬鈴薯小塊加入蒸餾水煮沸20 min，用四層紗布過濾，在濾液中添加40 g葡萄糖，繼續(xù)加熱攪拌均勻，冷卻后添加水分到1 000 mL，在121 ℃滅菌20 min).

1.2　試劑和儀器

(1)試劑：葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、β-環(huán)狀糊精、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母浸粉、牛肉膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、 KCl、NaCl、硫酸亞鐵，均為分析純.

(2)儀器：超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；DHP9080電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海佳勝實驗設(shè)備有限公司)；LS-C50L型立式高壓蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠)；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；震蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子有限公司).

1.3　發(fā)酵及測定流程

采購新鮮馬鈴薯→馬鈴薯洗凈去皮→稱重切塊0.5～1.0 cm3→蒸餾水加熱煮沸20 min過濾→添加不同的成分→攪拌均勻→分裝到規(guī)格的錐形瓶→高壓滅菌(121 ℃，20 min)→平板接種→搖床發(fā)酵培養(yǎng)(28 ℃，120 r/min)→定量濾紙過濾→收集菌絲體→測定干重.

1.4　營養(yǎng)成分對菌絲球形成的影響

1.4.1不同種類碳源對菌絲球干重影響

以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，菌絲球干重為指標(biāo)，分別加入不同種類的碳源(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、β-環(huán)狀糊精)取代培養(yǎng)基中的碳源，在28 ℃，120 r/min培養(yǎng)7天.將搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.4.2不同含量的蔗糖對菌絲球干重影響

以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,菌絲球干重為指標(biāo)，分別加入2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖，在28 ℃，120 r/min培養(yǎng)7天.將搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.4.3不同氮源對菌絲球干重影響

以添加4%蔗糖的PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,菌絲球干重為指標(biāo)，分別加入1.0%不同氮源(蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏、酵母浸粉)，在28 ℃，120 r/min培養(yǎng)7天.將搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.4.4不同含量的硝酸銨對菌絲球干重影響

以添加4%蔗糖的PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，菌絲球干重為指標(biāo)，分別加入0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%硝酸銨，在28 ℃，120 r/min培養(yǎng)7天.將搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.4.5不同種類無機(jī)鹽對菌絲球干重影響

以添加4%蔗糖、0.3%硝酸銨的PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，菌絲球干重為指標(biāo)，分別添加不同種類和含量的無機(jī)鹽(0.05% MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、0.05%KCl、0.05%NaCl、0.001%FeSO4)，在28 ℃，120 r/min培養(yǎng)7天.將搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.4.6優(yōu)化培養(yǎng)基配方的確定

綜合上述實驗，考慮到原料及成本價格，選擇蔗糖為碳源，硝酸銨為氮源，MgSO4·7H2O和KH2PO4為無機(jī)鹽，以菌絲球干重為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗,如表1所示.根據(jù)試驗結(jié)果確定冠突散囊菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化配方.

表1　L9(34)試驗因素及水平

1.5　培養(yǎng)條件對菌絲球形成的影響

1.5.1pH對菌絲球干重影響

以優(yōu)化后PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用NaOH或HCl調(diào)培養(yǎng)基pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在500 mL三角錐形瓶中裝液125 mL，在28 ℃，120 r/min條件下恒溫震蕩培養(yǎng)7天.將三角搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.5.2裝液量對菌絲球干重影響

以優(yōu)化后PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在三角錐形瓶中分別加入15%、20%、25%、30%、35%的培養(yǎng)基，接入菌種，在28 ℃，120 r/min培養(yǎng)7天.將三角搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.5.3培養(yǎng)溫度對菌絲球干重影響

以優(yōu)化后PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別在26 ℃，28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，120 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)7天.將三角搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.5.4搖瓶轉(zhuǎn)速對菌絲球干重影響

以優(yōu)化后PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在28 ℃，100 r/min、 110 r/min、120 r/min、130 r/min、140 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)7天.將三角搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液用定量濾紙過濾，用蒸餾水洗滌多次，收集其菌絲球，放置在30 ℃～40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中烘干，至恒重后取出，每個因素做三個平行實驗.

1.5.5冠突散囊菌液體發(fā)酵最佳發(fā)酵條件的確定

通過對冠突散囊菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，可以確定冠突散囊菌最佳液體培養(yǎng)基，即為：土豆20%、蔗糖4%、硝酸銨0.3%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.03%.為進(jìn)一步確定搖床最佳培養(yǎng)條件，參照前人研究成果并結(jié)合試驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗，對因素及水平進(jìn)行選擇,如表2所示.

2結(jié)果與討論

2.1　培養(yǎng)基成分菌絲球形成的影響

2.1.1碳源及其含量的確定

碳是真菌最重要的營養(yǎng)元素，它不僅是碳水化合物和蛋白質(zhì)的基本組成元素，又是重要的能量來源.選擇幾種常見的原料作為碳源比較，其濃度為4%.

由表2可知，冠突散囊菌對碳源的利用比較廣泛，對單糖、雙糖、多糖均可利用.其中，蔗糖為最適合的碳源，其次為葡萄糖，麥芽糖、乳糖對菌絲球產(chǎn)量影響相當(dāng)，β-環(huán)狀糊精產(chǎn)量最低.所以本試驗選擇蔗糖做為碳源.

表2　碳源對菌絲產(chǎn)量的影響

以蔗糖為最佳碳源，分別按照2%、4%、6%、8%、10%的量加入培養(yǎng)基，確定較佳蔗糖含量.

由表3可知，蔗糖含量對菌絲球的產(chǎn)量影響不顯著，均在0.20%左右，推其原因可能是土豆汁里浸出的淀粉做為部分碳源被冠突散囊菌所利用，因此，選擇添加蔗糖含量為4%.

表3　蔗糖含量對菌絲產(chǎn)量的影響

2.1.2氮源及其含量的確定

氮素是真菌合成的蛋白質(zhì)、核酸的必要原料，對菌絲生物生長發(fā)育至關(guān)重要.選擇幾種常見原料作為氮源進(jìn)行比較，其濃度為1.0%.

由表4可知，不同的氮源對菌絲球產(chǎn)量影響較大，添加硝酸銨和硫酸銨的培養(yǎng)基中菌絲球生長良好，發(fā)酵液澄清黃亮，而加入有機(jī)氮源菌絲球呈現(xiàn)褐色，發(fā)酵液渾濁.說明無機(jī)氮源比有機(jī)氮源更有利于菌絲球生長，其中加入硫酸銨菌絲球直徑大，組織不緊密，因此選擇硝酸銨為較佳氮源.

表4　氮源對菌絲產(chǎn)量的影響

以硝酸銨為較佳氮源，分別按照0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的量加入培養(yǎng)基，確定較佳氮源含量.

由表5可知，硝酸銨含量在0.3%～2.0%范圍內(nèi)菌絲球都可以很好地生長，形成的菌絲球大小均一，組織緊密，但是硝酸銨含量超過1.0%時，發(fā)酵液散發(fā)出刺鼻的氣味，濃郁的菌花香被破壞.因此，選擇0.3%為硝酸銨的較佳含量.

表5　硝酸銨含量對菌絲產(chǎn)量的影響

2.1.3無機(jī)鹽的確定

據(jù)資料報道，液體培養(yǎng)基中缺乏P、S、K、Mg，菌絲體生長發(fā)育不良，菌絲體產(chǎn)量低，選擇常用的5種無機(jī)鹽進(jìn)行試驗，確定較佳的無機(jī)鹽.

由表6可知，5種無機(jī)鹽對菌絲體生長作用差異不顯著，其中加入KH2PO4和MgSO4·7H2O時菌絲球長勢好，發(fā)酵液顏色黃亮.因此本試驗選取常用的KH2PO4和MgSO4·7H2O作為較佳的無機(jī)鹽.

表6　不同無機(jī)鹽對菌絲產(chǎn)量的影響

2.1.4優(yōu)化培養(yǎng)基配方的確定

綜合上述試驗結(jié)果，又考慮原料來源及成本價格，選用蔗糖為碳源，硝酸銨為氮源，MgSO4·7H2O和KH2PO4作無機(jī)鹽，進(jìn)行L9(34)正交試驗.

根據(jù)表7,采用直觀分析法分析正交試驗結(jié)果，從9組試驗菌絲球干重來看，第五組試驗的菌絲球產(chǎn)量最高為0.43 g/100 mL，較優(yōu)組合是A2B2C3D1，而經(jīng)方差分析計算得到的較優(yōu)組合是A2B1C3D1.將未做過試驗的A2B1C3D1組合和已做過試驗的A2B2C3D1組合進(jìn)行對比試驗，3次重復(fù)，測定菌絲干重，試驗結(jié)果表明A2B1C3D1組合的菌絲產(chǎn)量最高，達(dá)到0.48 g/100 mL.所以確定了冠突散囊菌液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為：土豆20%、蔗糖4%、硝酸銨0.3%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.03%.

表7　各組分正交試驗結(jié)果

2.2　發(fā)酵條件對菌絲球形成的影響

2.2.1種子培養(yǎng)時間對菌絲干重的影響

用平板對冠突散囊菌進(jìn)行培養(yǎng)，分別選取經(jīng)過4、5、6、7、8天培養(yǎng)的菌接種，發(fā)酵6天，測定其菌絲干重.

圖1　菌種培養(yǎng)時間對菌絲干重的影響

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)6天，測定菌絲干重可以看出，平板培養(yǎng)5天的種子最適宜接種.沒有成熟的冠突散囊菌孢子數(shù)量少且顏色淺，成熟后變?yōu)樯铧S色，接入的孢子數(shù)量多，產(chǎn)生的菌絲則多，菌絲球之間競爭生長空間，因而形成小而致密、機(jī)械強度高的菌絲球；接入的孢子數(shù)量少，菌絲球變大而數(shù)量減少，其機(jī)械強度也差，說明成熟的孢子更容易形成均一、緊密的菌絲球.

2.2.2培養(yǎng)溫度對菌絲干重的影響

溫度是影響菌絲生長發(fā)育很重要的一個因素，本試驗設(shè)計5個溫度梯度進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng).

由圖2可看出，30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)菌絲產(chǎn)量最高.在26 ℃以下，菌體生長相對緩慢，28 ℃為最適生長溫度，在32 ℃～34 ℃范圍也可以生長，周期較28 ℃～30 ℃長，溫度過高，容易染菌，因此培養(yǎng)溫度不能過高.

圖2　菌種培養(yǎng)溫度對菌絲干重的影響

2.2.3培養(yǎng)基起始pH值對菌絲產(chǎn)量的影響

液體培養(yǎng)基提供菌絲體正常生長的外部環(huán)境，其酸堿度直接影響菌絲體的新陳代謝，研究表明真菌適宜在酸性環(huán)境中生長.本試驗設(shè)計5個pH梯度進(jìn)行液體培養(yǎng).

由圖3可知，pH在4.5～6.5之間適宜菌絲的生長，而在pH5的環(huán)境下菌絲體產(chǎn)量最高.

圖3　起始pH對菌絲干重的影響

2.2.4搖瓶裝液量對菌絲干重的影響

冠突散囊菌屬于好氧型的真菌，搖瓶裝樣量對氧氣的溶解有很大的影響.本試驗設(shè)計5個梯度進(jìn)行液體培養(yǎng).

由圖4可知，500 mL三角瓶裝液量125～175 mL時，菌絲產(chǎn)量較理想，而裝液量175 mL最高.裝液量過多影響菌絲體的好氧需求，菌絲的產(chǎn)量減??；裝液量過少營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，菌絲球形成慢且菌絲產(chǎn)量低.

圖4　搖瓶裝液量對菌絲干重的影響

2.2.5搖瓶轉(zhuǎn)速對菌絲干重的影響

搖瓶轉(zhuǎn)速對菌絲球的形成有很重要的作用.本試驗設(shè)計5個梯度進(jìn)行液體培養(yǎng).

由圖5可知，在轉(zhuǎn)速為120 r/min時，菌絲產(chǎn)量最高.轉(zhuǎn)速慢，培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧少，形成的菌絲球大而松散，菌絲球中間的菌絲處于饑餓狀態(tài)，影響菌絲的生長；轉(zhuǎn)速過快搖瓶內(nèi)的機(jī)械刺激強烈，也影響菌絲的生長，而且轉(zhuǎn)速過高，容易引起培養(yǎng)液的飛濺，弄濕紗布，引起污染.

圖5　搖瓶轉(zhuǎn)速對菌絲干重的影響

2.2.6發(fā)酵時間對菌絲干重的影響

由表8可以看出，冠突散囊菌液體發(fā)酵5 d，菌絲體長勢最好，產(chǎn)量最高.在初期生長比較緩慢，隨著發(fā)酵進(jìn)程的不斷深入，菌絲體生長越來越旺盛，到第5 d菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高峰，之后生長趨于穩(wěn)定.到第7 d菌絲體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，生物量有所下降.

表8　發(fā)酵時間對菌絲干重的影響

3結(jié)論

液體發(fā)酵技術(shù)，不僅能在短期內(nèi)能獲得大量的目標(biāo)產(chǎn)物，而且周期短，不受季節(jié)和環(huán)境的限制.但是在培養(yǎng)過程中容易發(fā)生雜菌污染，滅菌溫度、壓力、時間不達(dá)標(biāo)均會引起污染，因此培養(yǎng)基在滅菌時一定要徹底，嚴(yán)格掌握滅菌程序，另外要保證實驗過程中的無菌操作.

本試驗利用液體發(fā)酵技術(shù)結(jié)合正交試驗方法篩選出了菌絲球生長發(fā)育的液體培養(yǎng)基配方：土豆

20%、蔗糖4%、硝酸銨0.3%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.03%；最適合菌絲球生長發(fā)育的理化因素為：培養(yǎng)溫度28 ℃、搖瓶轉(zhuǎn)速為120 r/min、pH5.0、搖瓶裝液量25%、發(fā)酵時間7 d、種子培養(yǎng)時間為5 d.

本試驗為冠突散囊菌工業(yè)化生產(chǎn)菌絲球提供了依據(jù)，為進(jìn)一步研究其發(fā)酵液的生物活性奠定了基礎(chǔ)，同時可以大幅度地降低冠突散囊菌開發(fā)的成本.所以采用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)菌絲球是一種實用的方法，具有廣闊的發(fā)展前景.

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Study on liquid fermentation technology ofEurotiumcristatum

LI Wen-juan， LV Jia-li*， YAN Ya-mei, WANG Xiao-peng

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:Taking Eurotium cristatum,the superiority strains in Fuzhuan brick tea of Shaanxi,as test subjects,using liquid fermentation culture and L9(34) orthogonal test to study the effects on mycelia by various media and conditions.The result showed that the optimal culture medium was:potato 20%，sucrose 4%，ammonium nitrate 0.3%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.03%.The optimal fermented condition was:culture temperature 28 ℃,rotation speed 120 r/min,pH5.0,the amount of liquid 125 mL(500 mL canonicalflask),incubation time for seed liquid 5 days,and fermentation time 7 days.

Key words:Eurotium cristatum; liquid fermentation; mycelium

中圖分類號：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-5811(2016)01-0128-06

通訊作者:

作者簡介:李文娟(1989-)，女，甘肅天水人，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)呂嘉櫪(1964-)，女，陜西三原人，教授，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)，Lujl@sust.edu.cn

基金項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目(2010JK446)； 咸陽市科技計劃項目 (2013K06-09)

收稿日期:*2015-12-11 *2015-11-23