氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠血清代謝組學(xué)研究

王　凱，夏德萌，郝曉偉，高松燕，李　娜，許　旭，婁子洋*

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，上海 200433；3. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測試中心，上海 200433)

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氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠血清代謝組學(xué)研究

王凱1，夏德萌2，郝曉偉2，高松燕3，李娜3，許旭1，婁子洋3*

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，上海 200433；3. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測試中心，上海 200433)

[摘要]目的：利用代謝組學(xué)方法對高尿酸血癥小鼠模型進(jìn)行代謝輪廓分析，以期尋找疾病生物標(biāo)志物，為發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制及其與其他疾病的關(guān)系提供線索。方法：使用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀構(gòu)建高尿酸血癥小鼠模型，使用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)對小鼠血清進(jìn)行分析，利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法篩選差異代謝物，并使用二級(jí)質(zhì)譜分析或?qū)φ掌穼ζ溥M(jìn)行確證。結(jié)果：共篩選出21個(gè)差異代謝物，涉及氨基酸、脂質(zhì)、能量代謝物等。結(jié)論：本研究建立了基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的高尿酸血癥小鼠模型的代謝組學(xué)分析方法，有助于從分子水平理解高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制及其與其他疾病的關(guān)系。篩選出的部分代謝物具有成為高尿酸血癥相關(guān)腎損傷早期診斷標(biāo)志物的可能。

[關(guān)鍵詞]高尿酸血癥；代謝組學(xué)；氧嗪酸鉀；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜

[Pharm Care Res，2015，15(6): 416-421]

隨著生活水平的提高，我國代謝性疾病的發(fā)病率不斷攀升。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國成年人高尿酸血癥(hyperuricemia)患病率為8.4%，南方略高于北方，在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)省市，這一數(shù)據(jù)高達(dá)14.9%[1]。高尿酸血癥不僅是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，大量研究還表明其與腎功能障礙、心血管疾病、高血壓、高脂血癥、胰島素抵抗、糖尿病、代謝綜合征密切相關(guān)[2-4]?！礁吣蛩嵫Y已成為影響我國尤其是經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)地區(qū)的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后興起的一種新的系統(tǒng)生物學(xué)方法，它通過考察生物系統(tǒng)受外界刺激后，體內(nèi)新陳代謝紊亂導(dǎo)致內(nèi)源性小分子物質(zhì)含量的變化,來反映機(jī)體的狀態(tài)。因此，在研究代謝性疾病、篩選疾病標(biāo)志物、從分子水平理解疾病的發(fā)病機(jī)制上代謝組學(xué)方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢[5]。作者應(yīng)用基于超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)的代謝組學(xué)方法，對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠模型進(jìn)行了研究。

1材料

1.1儀器和試藥UHPLC-Q-TOF/MS采用安捷倫1290 Infinity 液相系統(tǒng)和安捷倫6538四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；XSELECT HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,2.5 μm,美國Waters公司)；METTLER AE240型十萬分之一電子天平，METTLER TOLEDO 酸度計(jì)(德國梅特勒公司)；低溫離心機(jī)(美國Thermo公司);氧嗪酸鉀(上海阿達(dá)瑪斯公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；L-2氯苯丙氨酸(美國Sigma-Aldrich公司)；甲酸(色譜純，瑞士Fluka公司)。尿酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明小鼠18只，雄性，體重(20±2) g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2012-0002。

2方法

參考文獻(xiàn)2.1氧嗪酸鉀溶液的配制[6]，準(zhǔn)確稱取氧嗪酸鉀600、1200 mg,分別加入到36 ml生理鹽水中，使用極少量3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4～7.6，即得給藥濃度為250、500 mg/kg的氧嗪酸鉀溶液。

2.2實(shí)驗(yàn)分組和高尿酸血癥模型的建立小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中自由飲水和取食。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、低劑量模型組、高劑量模型組，每組6只。采用腹腔注射尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀誘導(dǎo)產(chǎn)生高尿酸血癥[6]。給藥前1 h禁食，不禁水。對照組腹腔注射生理鹽水；低、高劑量模型組分別腹腔注射250、500 mg/kg氧嗪酸鉀溶液，給藥體積15 ml/kg，連續(xù)給藥7 d。

2.3生物樣本的采集與檢測在第6天給藥后，禁食24 h，不禁水。第7天給藥2 h后，小鼠摘眼球取血，血樣室溫自然凝結(jié)1 h后，4 ℃, 1.5×103×g離心5 min，取血清，-80 ℃保存直到分析。

2.4代謝組學(xué)樣品前處理準(zhǔn)確稱取L-2氯苯丙氨酸適量，配成2.5 mg/ml的水溶液，用純甲醇稀釋成濃度為12.5 μg/ml的L-2氯苯丙氨酸溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

血清樣品4 ℃解凍，每份樣品吸取100 μl血清于1.5 ml EP管內(nèi)，加入300 μl內(nèi)標(biāo)溶液除蛋白質(zhì)，渦旋5 min后在4 ℃冰箱靜置10 min,隨后在4 ℃下16.2×103×g離心15 min，吸取200 μl上清液進(jìn)樣分析。

2.5色譜和質(zhì)譜條件色譜分離在XSELECT HSS T3柱上進(jìn)行,柱溫40 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫：0～2 min 5%B；2～13 min5%～95%B；13～15 min 95% B。流速0.4 ml/min，進(jìn)樣量4 μl。

質(zhì)譜配置電噴霧離子源(ESI)，質(zhì)譜條件為：正模式下毛細(xì)管電壓為4 kV,負(fù)模式下3.5 kV。氣體溫度350 ℃，流速11 L/min。噴霧電壓310.3 kPa(45 psi，1 psi=6.895 kPa)，Skimmer電壓45 V,碎裂電壓120 V。

UHPLC-Q-TOF/MS采集得到的原始數(shù)據(jù)利用安捷倫定性分析軟件轉(zhuǎn)化為通用格式(.mzdate)。隨后在R軟件上使用XCMS程序包進(jìn)行峰的識(shí)別、校正和積分。80%篩選后保留一張不同樣品關(guān)于不同變量的三維數(shù)據(jù)矩陣表，隨后同一樣品不同變量的峰面積除以該樣品里加入的內(nèi)標(biāo)的峰面積進(jìn)行面積歸一化。隨后導(dǎo)入SIMCA-P 11.0 (Umetrics, Umea, Sweden)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。使用有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，進(jìn)行差異物質(zhì)的篩選，把VIP>1的變量作為顯著差異物的候選變量。其次，利用面積歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS進(jìn)行單因素方差分析和兩兩比較。把VIP>1、P<0.05的變量作為可能的差異代謝物。把這些可能的差異代謝物，在在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫metlin(http://metlin.scripps.edu)和HMDB(http://www.hmdb.ca)上進(jìn)行初步鑒別。最后，對差異代謝物進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，利用其碎片信息進(jìn)一步確認(rèn)。

3結(jié)果

3.1小鼠血清的尿酸檢測結(jié)果結(jié)果表明，低劑量模型組與對照組相比，尿酸雖有升高，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；高劑量模型組與對照組相比，尿酸值顯著升高(P<0.05)，具體見表1。結(jié)果顯示，氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型構(gòu)建成功，高劑量組誘導(dǎo)的效果明顯優(yōu)于低劑量組。

表1　小鼠血清尿酸檢測結(jié)果

*P<0.05，與對照組比較

3.2血清代謝組學(xué)分析圖1為典型的正、負(fù)離子模式下血清樣品的質(zhì)譜基峰圖(BPC)。為了判斷模型組和對照組的代謝輪廓是否有差異，使用PLS-DA法進(jìn)行差異物質(zhì)的篩選。圖2為正、負(fù)離子模式下3組間的PLS-DA得分圖。由圖2可見，3組間均有較為顯著的分離趨勢，提示高、低劑量模型組與對照組相比，在內(nèi)源性代謝物層面都發(fā)生了較明顯的變化。為了進(jìn)一步篩選高尿酸血癥的潛在生物標(biāo)志物，并明確其含量變化趨勢，對對照組與高、低劑量模型組及兩個(gè)模型組間分別進(jìn)行兩兩比較。圖3為兩兩比較的PLS-DA得分圖，分離趨勢良好。

圖1　正離子模式(A)和負(fù)離子模式(B)下典型的血清質(zhì)譜基峰圖Figure 1　Typical mass spectrum base peak chromatograms of the serum samples obtained in ESI positive ion mode(A) and negative ion mode(B)

圖2　正負(fù)離子模式下對照組和模型組的PLS-DA得分圖Figure 2　PLS-DA scores plots of the control group and the model group in positive ion mode and negative ion modeA:正離子模式；B：負(fù)離子模式；○:對照組；●：低劑量模型組；△：高劑量模型組

圖3　對照組、低劑量模型組、高劑量模型組兩兩比較的PLS-DA得分圖Figure 3　PLS-DA scores plots of the control group，the low dose model group andthe high dose model group by pairwise comparisonA1、B1、C1：正離子模式；A2、B2、C2：負(fù)離子模式；○：對照組；●：低劑量模型組；△：高劑量模型組

S圖表示各個(gè)原始變量與第一主成分的相關(guān)性以及在第一主成分中的重要性。圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)原始變量，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)被認(rèn)為與第一主成分的相關(guān)性越大，在組間貢獻(xiàn)率也越大。VIP值常用來描述變量在組間的貢獻(xiàn)率，貢獻(xiàn)率越大則VIP值越大，該變量在組間比較中區(qū)分組間差異起到的作用就更顯著。 圖4為對照組和高劑量模型組的S圖。

圖4　正負(fù)離子模式下對照組和高劑量模型組的S圖Figure 4　S-plot of the control group and the high dose model group in positive and negative ion modeA:正離子模式；B：負(fù)離子模式

把通過PLS-DA找到的VIP>1的變量，與經(jīng)過SPSS處理找到的P<0.05的變量取交集，再根據(jù)質(zhì)荷比在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫上檢索這些共有的變量，以此來鑒別差異代謝物。隨后使用二級(jí)質(zhì)譜分析對鑒別到的差異代謝物進(jìn)行確證，并根據(jù)峰面積比較它們的含量在組間的變化趨勢。表2顯示了鑒別到的差異代謝物及其含量在組間的變化趨勢。共鑒別出21個(gè)差異代謝物，其中14個(gè)利用二級(jí)質(zhì)譜分析得到了確證。其中脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸進(jìn)一步利用對照品進(jìn)行了確證。以m/z166.086([M+H]+)為例說明差異代謝物的二級(jí)質(zhì)譜確證過程。在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中檢索166.086并結(jié)合Masshunter軟件的分子式推測，檢索可能的差異代謝物，隨后樣品進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,對鑒別到的差異代謝物進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,得到關(guān)于該差異代謝物在不同能量下二級(jí)質(zhì)譜碎片圖譜(見圖5B2，10 eV),通過與在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(如metlin)里該物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行比對，來確證該差異代謝物。圖5為苯丙氨酸樣品與對照品的比對示例。

與對照組相比，模型組中氨基酸和左旋肉堿代謝均下調(diào)，但左旋肉堿的酯類化合物大多是上調(diào)的。圖6利用熱圖形象化地顯示了鑒別到的21個(gè)差異代謝物在對照組，低、高劑量模型組中相對含量及變化趨勢。由圖6可見，與對照組相比，模型組差異代謝物顏色顯著不同，說明模型組和對照組差異代謝物含量不同。

表2　潛在的生物標(biāo)志物及其含量變化趨勢

↑：差異代謝物含量的上調(diào)；↓：差異代謝物含量的下調(diào)；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,與對照組比較;△△P<0.01，△△△P<0.001，與低劑量模型組比較

圖5　樣品和對照品中苯丙氨酸的提取離子色譜圖(A)和二級(jí)質(zhì)譜圖(B,碰撞電壓10 eV)Figure 5　Extracted ion chromatograms(A) and MS/MS spectrums(B) of phenylalanine in sample and standard solution(the collision voltage was 10 eV)A1、B1：對照品；A2、B2：樣品

3討論

尿酸是人體嘌呤代謝的終產(chǎn)物。與其他哺乳動(dòng)物不同，人和猿類在進(jìn)化過程中由于編碼尿酸酶基因的缺失，不能合成有活性的尿酸酶把尿酸代謝為溶解度好的尿囊素通過腎臟排出體外[7]，從而使高尿酸血癥的發(fā)生成為可能。氧嗪酸鉀結(jié)構(gòu)與尿酸的嘌呤環(huán)相似,可部分抑制尿酸酶的活性,減少尿酸的分解，常被用來誘導(dǎo)產(chǎn)生高尿酸血癥模型[6]。本研究表明，當(dāng)氧嗪酸鉀給藥劑量為500 mg/kg時(shí)，成功誘導(dǎo)出小鼠高尿酸血癥模型。而當(dāng)給藥劑量為250 mg/kg時(shí)，血清尿酸值升高但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從代謝物變化的層面上看，低劑量模型組鑒別到的差異代謝物和它們的變化趨勢與高劑量模型組基本一致。發(fā)生這種情況的原因是氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥只能短期升高尿酸[8]，當(dāng)劑量為250 mg/kg時(shí)，小鼠血清尿酸在2 h后已基本恢復(fù)正常，但尿酸升高對機(jī)體代謝造成的紊亂已經(jīng)發(fā)生。代謝組學(xué)作為一種靈敏的關(guān)注內(nèi)源性代謝物變化的系統(tǒng)生物學(xué)方法,能夠較為準(zhǔn)確地反映機(jī)體代謝狀態(tài)的變化。

圖6　在對照組，低、高劑量模型組血清中差異代謝物相對含量的熱圖分析Figure 6　Heatmap based on the relative levels of different metabolites in serum samples of the control group, the low model group and the high model group

人體中的尿酸鹽主要通過腎臟排泄(占排泄總量的60%～70%)，少量經(jīng)過腸道內(nèi)的微生物菌群分解排泄[7]。尿酸鹽的腎臟排泄需要多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與[7,9]。研究表明,高尿酸血癥在腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[9]，高尿酸血癥導(dǎo)致腎轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常和腎損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，多種氨基酸在高尿酸血癥模型組中有下調(diào)趨勢，脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、別異亮氨酸、苯丙氨酸等的代謝異常提示與腎轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異常表達(dá)相關(guān)。L-2-哌啶酸是賴氨酸的降解產(chǎn)物，L-2-哌啶酸的下調(diào)可能也暗示賴氨酸的降低。色氨酸及其代謝物的變化與腎臟功能的異常密切相關(guān)[11,12]。在本研究中，模型組的色氨酸代謝也表現(xiàn)出明顯的異常，這也提示了尿酸水平升高對腎臟功能的影響。目前，臨床用于評價(jià)腎功能的指標(biāo)，如肌酐、尿素氮等存在靈敏度低、前瞻性差的問題，如何早期發(fā)現(xiàn)腎臟功能的異常并給予干預(yù)已經(jīng)成為一個(gè)重要課題。通過代謝組學(xué)方法篩選到的內(nèi)源性代謝物具有較高的靈敏度，具備成為早期診斷腎臟功能的生物標(biāo)志物的潛力。但這些內(nèi)源性代謝物還需要不斷地驗(yàn)證和確認(rèn)才能逐漸被應(yīng)用于臨床。

高尿酸血癥與心血管疾病密切相關(guān)。馬文峰等[13]利用代謝組學(xué)技術(shù)研究了高尿酸血癥病人與健康人血漿的代謝差異情況，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常是與高尿酸血癥相關(guān)的代謝特征之一。本研究結(jié)果也顯示了多種甘油磷脂類物質(zhì)的異常，提示尿酸升高導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝的紊亂與心血管疾病的關(guān)聯(lián)。左旋肉堿具有多種生理作用,通過轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸到線粒體基質(zhì),在長鏈脂肪酸的線粒體氧化中保持輔酶A的內(nèi)平衡,在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用。腎臟在左旋肉堿合成和維持左旋肉堿的平衡方面具有重要作用,同時(shí)也需要大量能量進(jìn)行正常的代謝[14]。左旋肉堿的下調(diào)和肉堿酯類的變化可能暗示線粒體功能的紊亂和腎臟的異常，為從分子層面理解疾病的機(jī)制提供了重要線索[15]。

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[修回日期]2015-11-19

[本文編輯]陽凌燕

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·論著·

Serum metabonomics of hyperuricemia induced by potassium oxonate in mice

WANG Kai1,XIA DeMeng2,HAO XiaoWei2,GAO SongYan3,LI Na3,XU Xu1,LOU ZiYang3*(1.School of Chemical and Environmental Engineering,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China;2.Graduate Management Unit, Second Military Medical University,Shanghai 200433,China; 3.Pharmaceutical Analysis Center,School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

[ABSTRACT]Objective: To analyze the metabolic profile of the mouse model of hyperuricemia by using metabonomics approach, so as to find out the biomarkers of the disease and provide evidence for the pathogenesis of hyperuricemia and the relationship with other diseases. Methods: The hyperuricemia mouse model was developed by using potassium oxonate, a uricase inhibitor. Serum was analyzed by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF/MS). Then, multivariate statistical analysis was made to identify different metabolites, which were determined by MS/MS or reference substances. Results: Twenty-one metabolites were identified as potential biomarkers, involving amino acid, lipids and energy metabolites, etc. Conclusion: The study successfully established the method for metabolomics in the hyperuricemia mouse model by using LC-MS technique, which would facilitate to understand the pathogenesis of hyperruricemia and the relationship with other diseases. Certain screened-out metabolites might be potential biomarkers for early diagnosis of kidney injury related with hyperruricemia.

[KEY WORDS]hyperruricemia; metabonomics; potassium oxonate; UHPLC-Q-TOF/MS

[收稿日期]2015-07-30

通信作者*(Corresponding author)：婁子洋，E-mail: ziyanglou@163.com

作者簡介王凱(男)，碩士生.E-mail:chemwanderer@163.com;夏德萌(男).E-mail:demengxia@163.com；兩人為共同第一作者

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金(81373377)

DOI：10.5428/pcar20150606

[中圖分類號(hào)]Q591，R589.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-2838(2015)06-0416-06