免疫增強劑黨參對仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

樊 英 李 樂 于曉清 劉恩孚 李天保許 拉 葉海斌（山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島266002）

免疫增強劑黨參對仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

樊 英 李 樂 于曉清 劉恩孚 李天保?許 拉 葉海斌
（山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島266002）

摘 要：采用平板計數(shù)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）－變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)分析免疫增強劑黨參對仿刺參（Apostichopus japonicas）腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。將初始體重為（18．00± 2．00）g的仿刺參隨機分為2組（對照組、試驗組），每組6個重復(fù)，每個重復(fù)12只。對照組投喂海泥、鼠尾藻粉按照1∶1的質(zhì)量比配制的餌料，試驗組餌料中以鼠尾藻粉質(zhì)量的2%添加黨參，連續(xù)投喂28 d。結(jié)果表明：應(yīng)用免疫增強劑黨參不僅能夠顯著提高仿刺參的特定生長率（P＜0．05），降低其餌料系數(shù)（P＜0．05），而且能夠顯著增加仿刺參腸道內(nèi)容物中異養(yǎng)菌的數(shù)量（P＜0．05）；序列統(tǒng)計分析顯示投喂黨參后仿刺參腸道細(xì)菌優(yōu)質(zhì)序列比例顯著增加（P＜0．05），試驗組達(dá)97．57%，對照組僅為80．22%；Beta多樣性分析反映投喂黨參后仿刺參腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生了變化，其多樣性系數(shù)范圍在14．91%～15．47%、15．47%～16．21%、14．91%～16．21%；豐度分析顯示投喂黨參后仿刺參腸道內(nèi)容物中變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度提高，疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmiaites）豐度降低；聚類分析顯示試驗組與對照組腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)為0．97。由此可見，免疫增強劑黨參可提高仿刺參的特定生長率，降低餌料系數(shù)，增加腸道異養(yǎng)菌數(shù)量和優(yōu)勢菌群豐度，優(yōu)化腸道微生態(tài)環(huán)境。

關(guān)鍵詞：免疫增強劑；黨參；仿刺參；腸道；菌群；DGGE

腸道是病原微生物入侵機體的最主要部位，許多疾病的發(fā)生都始于腸道［1－2］。然而，腸道菌群是腸道微生態(tài)的主導(dǎo)者，這些細(xì)菌間以及細(xì)菌與動物機體之間都形成了一個相互依賴、協(xié)作共進(jìn)的整體，在機體免疫、營養(yǎng)、吸收等方面都起到非常重要的作用［3］。細(xì)菌群落研究一直都是基于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，操作費時費力，且不能反映它們在自然界的群落結(jié)構(gòu)以及詳細(xì)的豐度狀況和多樣性［4］。目前，自然環(huán)境中尚有高達(dá)85%～99%的微生物未能進(jìn)行人工培養(yǎng)［5］，現(xiàn)有研究對復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的了解更是十分有限［4］。仿刺參（Apostichopus japonicas）屬無脊椎棘皮動物，非特異性免疫防御系統(tǒng)在機體中具有較為重要的作用，而腸道系統(tǒng)在整個機體防御中又具有舉足輕重的作用。然而，目前對仿刺參腸道微生態(tài)環(huán)境內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)多樣性的了解很少，免疫增強劑影響仿刺參腸道菌群方面的研究也未見報道。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）－變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是基于相同長度但不同堿基組成的DNA序列片段電泳分析的技術(shù)［6］。1993年Muyzer等［7］首次將其用于細(xì)菌群落分析；2007年Hovda等［8］利用該技術(shù)分析了大西洋鮭（Salmo salar L．）前腸、中腸和后腸的細(xì)菌群落組成及優(yōu)勢菌群；此外，Zhou等［9］利用該技術(shù)研究了網(wǎng)箱養(yǎng)殖的青石斑魚（Epinephelus awoara）胃、幽門盲囊、前腸、中腸和后腸的細(xì)菌群落組成；羅鵬等［10］利用該技術(shù)對比研究了凡納濱對蝦（Litope?naeus vannamei）養(yǎng)殖環(huán)境以及消化道內(nèi)細(xì)菌群落組成的多樣性和相似性；高菲等［11］利用該技術(shù)研究了仿刺參前腸、中腸和后腸內(nèi)含物的細(xì)菌群落組成，證實仿刺參消化道的細(xì)菌群落直接或間接來源于仿刺參的棲息地環(huán)境，有助于進(jìn)一步揭示細(xì)菌群落在仿刺參免疫等生理生化過程中的作用。然而，在免疫增強劑作用的情況下通過PCR?DGGE技術(shù)對仿刺參消化道內(nèi)容物細(xì)菌群落組成的研究還未見報道。本試驗擬采用傳統(tǒng)平板統(tǒng)計方法和PCR?DGGE技術(shù)比較分析仿刺參應(yīng)用免疫增強劑黨參后腸道細(xì)菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)變化，以揭示仿刺參在應(yīng)用免疫增強劑后腸道細(xì)菌群落的動態(tài)變化，體現(xiàn)細(xì)菌群落在仿刺參消化吸收免疫增強劑過程中的作用和重要性，為進(jìn)一步了解和應(yīng)用免疫增強劑提供參考。

1　材料與方法

1．1 試驗材料

黨參購自西安寶雞生物技術(shù)有限公司，其純度達(dá)到85%以上。實驗室內(nèi)通過銳孔凝固浴方式制備微膠囊制劑，其包埋率達(dá)到85%。其他試劑均為化學(xué)分析純。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑均購自TaKaRa公司；腸道內(nèi)容物基因組提取采用的QUAGEN試劑盒購自青島博康生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌16S rDNA通用引物27f 和1492r、V3區(qū)擴(kuò)增引物F357和R518均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．2 試驗方法

1．2．1 仿刺參飼養(yǎng)試驗

挑選個體均勻、外觀無疾病癥狀的健康仿刺參［體重（18．00±2．00）g］隨機分配到6個試驗水槽（長70 cm×寬30 cm×高40 cm）內(nèi)，溫度控制在（15．0±1．0）℃。仿刺參隨機分為2組（對照組、試驗組），每組6個重復(fù)（水槽），每個重復(fù)12只。試驗期間按照體重的2%飽食投喂，對照組投喂海泥、鼠尾藻粉按照1∶1的質(zhì)量比配制的餌料，試驗組餌料中以基礎(chǔ)飼料（鼠尾藻粉）質(zhì)量的2%添加黨參，連續(xù)投喂28 d，每天15：00投喂，吸除殘餌和糞便，同時補充新鮮海水。試驗期間連續(xù)充氣，鹽度32，pH 7．8～8．2，溶解氧濃度＞5 mg／L。

1．2．2 腸道樣品處理

投喂免疫增強劑黨參后第28天分別從每個水槽中隨機抽取3只仿刺參，在冰盤中取出腸道，稱取0．5 g，加入10倍體積（質(zhì)量體積比）的無菌預(yù)冷重蒸水，在冰浴中（0～4℃）用滅菌勻漿器充分研磨勻漿后，一部分樣品以10倍遞增稀釋法進(jìn)行稀釋，取3個合適的稀釋度涂布于2216e和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂培養(yǎng)基，分別用于培養(yǎng)腸道異養(yǎng)菌和弧菌。每個稀釋度做3個平行，25℃培養(yǎng)1～2 d。另一部分樣品于－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 生長性能測定

攝食量是指仿刺參一次投喂攝食的餌料數(shù)量。在生產(chǎn)實際應(yīng)用中，通常采用日攝食量（daily feed intake，DFI）來衡量水產(chǎn)動物的攝食情況。

餌料系數(shù)即餌料用量與養(yǎng)殖仿刺參增重量的比值。計算公式：

餌料系數(shù)（feed conversion ratio，F(xiàn)CR）＝總投餌量／增重量。

28 d的飼喂試驗結(jié)束后，對仿刺參進(jìn)行稱重（濾紙上靜置30 s后進(jìn)行稱量），計算仿刺參的特定生長率。計算公式：

特定生長率（specific growth rate，SGR，%／d）＝100×（ln終末體重－ln初始體重）／試驗天數(shù)。

1．4 腸道細(xì)菌總DNA提取及16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增

在無菌條件下利用QUAGEN試劑盒提取腸道細(xì)菌基因組總DNA作為模板，采用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)特異引物F357（5’－CCTACGGGAG?GCAGCAG－3’）和R518（5’－ATTACCGCG?GCTG CTGG－3’）分別進(jìn)行擴(kuò)增。

1．5 腸道細(xì)菌DGGE圖譜分析

1．5．1 序列數(shù)目統(tǒng)計

本試驗采用雙端（pair?end）測序。首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列（50個連續(xù)堿基平均質(zhì)量＞0，不允許有模糊堿基）。舍棄無法連接的序列，對連接上的序列進(jìn)行過濾（連續(xù)相同堿基數(shù)＜6；模糊堿基數(shù)＜1），獲得最終用于分析的序列。

1．5．2 基于群落結(jié)構(gòu)對物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計分析

在樣品相似度為0．97的情況下進(jìn)行多樣品物種豐度的統(tǒng)計，可反映樣品中物種分布的均勻度。

1．5．3 基于群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行Beta多樣性統(tǒng)計分析

Beta多樣性是基于群落結(jié)構(gòu)來比較多組樣本之間的差別度量，是物種組成沿環(huán)境梯度或者在群落間的變化率，用來表示生物種類對環(huán)境異質(zhì)性的反應(yīng)，通過主坐標(biāo)分析（principal coordinates a?nalysis，PCoA）來表現(xiàn)。

1．5．4 基于群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類分析

將屬水平上的分類信息分別按照樣品和分類進(jìn)行聚類分析后作出heatmap圖，反映出各樣品的相似性。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 17．0軟件中的單因素方差分析（one?way ANO?VA）進(jìn)行統(tǒng)計，P＜0．05為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2．1 生長性能

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后對仿刺參的生長性能進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果（表1）顯示，試驗組仿刺參的餌料系數(shù)顯著低于對照組（P＜0．05），特定生長率顯著高于對照組（P＜0．05），表明黨參提高了仿刺參的生長性能。

表1　免疫增強劑黨參對仿刺參生長性能的影響Table 1 Effect of Codonopsis pilosula as an immunopotentiator on growth performance of Apostichopus japonicus

2．2 腸道內(nèi)容物中異養(yǎng)菌及弧菌數(shù)量

如表2所示，投喂黨參的試驗組仿刺參腸道內(nèi)容物中異養(yǎng)菌的數(shù)量達(dá)2．13×107CFU／mL，而對照組僅為1．61×107CFU／mL，試驗組較對照組顯著增加（P＜0．05）；試驗組仿刺參腸道內(nèi)容物中弧菌數(shù)量為2．06×107CFU／mL，與對照組無顯著差異（P＞0．05）。

表2　免疫增強劑黨參對仿刺參腸道內(nèi)容物異養(yǎng)菌及弧菌數(shù)量的影響Table 2 Effect of Codonopsis pilosula as an immunopotentiator on the counts of heterotroph and Vibrio in intestinal content of Apostichopus japonicas

2．3 腸道細(xì)菌16S rDNA及16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

按照試劑盒方法提取對照組和試驗組中仿刺參腸道內(nèi)容物細(xì)菌總DNA，細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后，試驗組與對照組分別得到單一明顯的擴(kuò)增片斷，大小在230 bp左右，而陰性對照組則無條帶（圖1）。

2．4 腸道細(xì)菌DGGE圖譜分析

2．4．1 序列統(tǒng)計分析

從表3中可以看出，投喂黨參后仿刺參腸道內(nèi)容物細(xì)菌有效序列數(shù)變化不顯著（P＞0．05），基本保持在45 000～50 000；而優(yōu)質(zhì)序列數(shù)之間差異顯著（P＜0．05），優(yōu)質(zhì)序列比例顯著增加（P＜0．05），試驗組優(yōu)質(zhì)序列比例達(dá)97．57%，而對照組僅為80．22%。

2．4．2 在門的層次下對物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計分析

投喂黨參后仿刺參腸道內(nèi)容物中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，優(yōu)勢菌群歸屬于變形菌門（Proteobacte?ria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verru?comicrobia）；其中擬桿菌門（21．4%）和變形菌門（28．1%）的豐度提高較多，而對照組僅有8．8%和25．1%；放線菌門（Actinobacteria）（1．2%）和疣微菌門（Verrucomicrobia）（39．1%）豐度降低，對照組為1．8%和57．4%（表4）。

2．4．3 Beta多樣性統(tǒng)計分析

投喂黨參后仿刺參腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生了改變，群落間物種變化不同。通過主坐標(biāo)PCoA分析獲知，物種在群落間的變化情況及變化率如圖2所示，多樣性系數(shù)范圍在14．91%～15．47%、15．47%～16．21%、14．91%～16．21%。

2．4．4 聚類分析

電泳圖譜經(jīng)聚類分析后如圖3所示，不同位置的條帶表示不同的細(xì)菌菌屬。從圖中可看出，仿刺參腸道內(nèi)存在豐富的物種菌群，與對照組樣品相比較，試驗組樣品中嗜血桿菌屬（Haemophi?lus）、厭氧細(xì)桿菌屬（Anaerofilum）條帶顏色發(fā)生明顯變化，而放線菌屬（Actinomyces）、肉桿菌屬（Atopostipes）等的條帶僅亮度加深，說明含量增多，衣原體屬（Chlamydia）、微單胞菌屬（Parvi?monas）等的條帶則變化不明顯，故認(rèn)為黨參可改變仿刺參腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)。聚類分析顯示試驗組與對照組樣品腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)為0．97。

圖1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig．1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products

表3　序列數(shù)統(tǒng)計Table 3 Statistics of sequence No．

表4　豐度統(tǒng)計Table 4 Statistics of abundance　%

圖2　PCoA分析中2D PCoA圖（多樣性百分比）Fig．2 2D PcoA graph in PCoA anlysis（percentage of diversity）

圖3　聚類分析heatmap圖（左：對照組；右：試驗組）Fig．3 Heatmap graph of cluster analysis （left：control group；right：experimental group）

3　討 論

3．1 免疫增強劑黨參對仿刺參腸道細(xì)菌數(shù)量的影響

機體各個部分、各個器官都是一個整體，腸道在這個整體中占有重要位置，不但是營養(yǎng)吸收的主要部位，還是抵御病原微生物的主要屏障。許多疾病的發(fā)生都是腸道功能紊亂所致，故將腸道功能維持在最佳水平是提高機體機能、降低動物疾病等的重要手段之一［12］。維持腸道功能涉及眾多方面，如腸道相關(guān)淋巴樣組織、腸道黏膜物質(zhì)的分泌或表達(dá)、腸道抗氧化能力以及腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化等［2，12－13］。腸道菌群是腸道黏膜屏障的重要組成部分，在腸道免疫系統(tǒng)中發(fā)揮雙重作用［14］。張紅梅等［15］研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡聚糖可顯著抑制鯉魚（Cyprinus carpio L．）腸道大腸桿菌的增殖，促進(jìn)乳酸菌和雙歧桿菌（Bifidobacterium）的增殖。楊世平等［16］發(fā)現(xiàn)，干酵母與活酵母均能顯著減少對蝦腸道內(nèi)細(xì)菌總數(shù)、弧菌數(shù)量。Hoseinifar等［17］發(fā)現(xiàn)，啤酒酵母使得歐鰉（Huso huso）幼魚腸道異養(yǎng)菌數(shù)量與空白組差異不顯著，而乳酸菌數(shù)量則顯著增加。宮魁等［18］投喂仿刺參全營養(yǎng)破壁酵母后發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)菌群數(shù)量與對照組相較減少，并可顯著抑制弧菌菌群的增殖，同時也對乳酸菌的增殖也表現(xiàn)出一定的抑制作用。這說明腸道內(nèi)不同菌群對外源物質(zhì)的應(yīng)用表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，體現(xiàn)了研究的意義。本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)殖期間黨參免疫增強劑有效地增強了仿刺參機體的免疫力，仿刺參成活率達(dá)到100%，并在提高特定生長率的同時降低了餌料系數(shù)，與對照組比較差異顯著；而且，黨參免疫增強劑能夠顯著增加仿刺參腸道內(nèi)異養(yǎng)菌數(shù)量，而弧菌數(shù)量相對減少，呈現(xiàn)了抑制弧菌菌群繁殖的現(xiàn)象，這可能與黨參的組成成分相關(guān)。黨參中含有豐富的多糖、酚等營養(yǎng)成分和某些未知的促生長因子，為腸道內(nèi)微生物提供了豐富的營養(yǎng)生存環(huán)境，參與機體菌群代謝，在有益菌有效增殖的同時增強了與有害菌的競爭力，主要控制了有害弧菌的繁殖，從而調(diào)控了機體菌群結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)了有益的效果，促進(jìn)了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。鑒于腸道有益菌和有害菌的平衡對維護(hù)機體健康的重要性，黨參免疫增強劑的投喂時間及投喂量還需進(jìn)一步深入研究，以獲得相關(guān)性及其周期變化規(guī)律。

3．2 用DGGE圖譜分析免疫增強劑黨參對仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

從腸道系統(tǒng)研究病害防治技術(shù)是解決實際應(yīng)用問題的重要途徑之一。仿刺參腸道系統(tǒng)除營養(yǎng)、免疫方面的重要性之外，夏眠期后的復(fù)蘇也隨著腸道系統(tǒng)的恢復(fù)而正常工作［19］。早期研究報道，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法和16S rDNA技術(shù)獲得了海參消化道內(nèi)容物的細(xì)菌多樣性和細(xì)菌群落組成［20－21］，然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法詳細(xì)獲取仿刺參消化道細(xì)菌群落的全面信息。PCR?DGGE技術(shù)是近年來國內(nèi)外研究動物胃腸道微生物組成及結(jié)構(gòu)變化最常用的方法［22－24］。本研究采用該技術(shù)，更加全面地揭示免疫增強劑對仿刺參消化道內(nèi)容物的細(xì)菌群落組成的影響。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，免疫增強劑黨參能夠在有效序列數(shù)未發(fā)生顯著變化的情況下顯著增加其中優(yōu)質(zhì)序列的比例，可能是因為黨參的多營養(yǎng)成分能夠有效促進(jìn)仿刺參腸道內(nèi)優(yōu)勢菌的繁殖，抑制有害菌的增長，對微生物序列的增殖表達(dá)呈現(xiàn)了一種積極的作用。

有關(guān)黑海參（Halodeima atra）腸道內(nèi)容物菌群的16S rDNA序列分析表明，主要菌群包括α－變形菌、β－變形菌、γ－變形菌、噬纖維菌－黃桿菌－擬桿菌群（Cytophaga?Flavobacterium?Bacteriodes）以及放線菌［21］。變形菌門是表型和種系發(fā)生最為豐富多樣的一個門。高菲等［11］研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參前腸、中腸、后腸內(nèi)容物的優(yōu)勢菌群均為γ－變形菌，且仿刺參消化道中可培養(yǎng)細(xì)菌中的92．7%也屬于γ－變形菌［20］。有關(guān)的研究表明，凡納濱對蝦、日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicas）和中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）的腸道優(yōu)勢菌群也屬于γ－變形菌［25－26］。一些海水養(yǎng)殖魚類如青石斑魚、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鮭以及暗紋東方鲀（Takifugu obscures）消化道的優(yōu)勢菌屬于變形菌門［12－13，22，27］。與這些報道結(jié)果相似，本研究中仿刺參腸道內(nèi)容物優(yōu)勢菌群也包含有變形菌門（其中包括α－變形菌、γ－變形菌、δ－變形菌），這可能是黨參的多重營養(yǎng)成分適合變形菌的繁殖代謝，為變形菌的加速生長提供了更好的生存環(huán)境。應(yīng)用免疫增強劑黨參對仿刺參腸道內(nèi)容物中優(yōu)勢菌群種類的影響不顯著，差異性主要體現(xiàn)在菌群的豐度變化上。與對照組比較，試驗組仿刺參腸道內(nèi)容物中變形菌門和擬桿菌門的豐度增高，而疣微菌門、放線菌門和厚壁菌門的豐度降低。對DGGE豐度信息的分析更能全面地獲得仿刺參腸道細(xì)菌群落的組成，反映出應(yīng)用黨參后發(fā)生的有益影響。在仿刺參腸道系統(tǒng)菌群組成的研究中，共有菌種（尤其是豐度存在明顯差異的菌種以及各自的特異菌種）可能是了解仿刺參養(yǎng)殖營養(yǎng)攝食、揭示仿刺參與環(huán)境菌群組成之間相互聯(lián)系的關(guān)鍵點。本研究結(jié)果正是體現(xiàn)了免疫增強劑黨參對仿刺參營養(yǎng)攝食的影響，從腸道菌群上尋找切入點，其深入探討仍在進(jìn)行中。

投喂免疫增強劑黨參后，仿刺參腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生了改變，細(xì)菌種類和數(shù)量發(fā)生了變化，有益菌數(shù)量的增加提高了腸道內(nèi)的有益環(huán)境，有益于細(xì)菌的繁殖代謝。Beta多樣性是基于群落結(jié)構(gòu)比較多樣本之間的差別，腸道中物種的組成沿腸道環(huán)境梯度在群落間發(fā)生變化，反映了物種對環(huán)境的異質(zhì)性。本試驗中采用的PCoA是一種對多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)的方法。在本試驗中對照組和試驗組的不同條件即是黨參免疫增強劑的給予，通過圖2中橫縱坐標(biāo)的百分比即可以看出環(huán)境影響因素和樣品之間的區(qū)別及相似性，從而反映免疫增強劑黨參在改變腸道環(huán)境的情況下對仿刺參腸道菌群多樣性的作用效力。免疫增強劑黨參對仿刺參腸道微生態(tài)環(huán)境的改變體現(xiàn)了物種的異質(zhì)性及多樣性，多樣性變化系數(shù)范圍在14．91%～15．47%、15．47%～16．21%、14．91%～16．21%。多樣性變化系數(shù)范圍說明了樣品中物種對環(huán)境產(chǎn)生的差異性，來自同一類環(huán)境樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也可能存在差距。PCoA分析結(jié)果說明，免疫增強劑黨參未顯著影響物種對環(huán)境變化產(chǎn)生的異質(zhì)性，但是對物種群落結(jié)構(gòu)豐度具有顯著影響。本研究中DGGE電泳圖譜在屬水平上聚類后形成26個族（heatmap圖），反映出試驗組與對照組樣品之間的相似性。如圖3所示，對照組與試驗組樣品的相似性系數(shù)很高，達(dá)到0．97。此外，與本試驗獲得序列親緣關(guān)系較近的細(xì)菌還有未培養(yǎng)細(xì)菌，如Aphingobium、Subdoligranulum等，尚難以分析其功能，這與高菲等［11］的結(jié)果相似。在今后的研究中應(yīng)對優(yōu)勢菌群的單一序列需進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)免疫增強劑對仿刺參腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在時間或空間上的動態(tài)變化，結(jié)合大片段基因組文庫等信息發(fā)現(xiàn)新的序列或功能基因，進(jìn)而獲得仿刺參腸道細(xì)菌群落在營養(yǎng)免疫方面的生理生化作用。

4　結(jié) 論

①免疫增強劑黨參可增加仿刺參腸道內(nèi)容物異養(yǎng)菌數(shù)量，降低弧菌數(shù)量，產(chǎn)生促進(jìn)有益菌繁殖的效果。

②免疫增強劑黨參可改變仿刺參腸道內(nèi)容物細(xì)菌菌群豐度，增加優(yōu)質(zhì)序列比例，影響腸道菌群對環(huán)境改變產(chǎn)生的異質(zhì)性。

③免疫增強劑黨參未改變仿刺參腸道細(xì)菌親緣關(guān)系，相似性仍達(dá)0．97。

致謝：

感謝山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室的刁菁博士對文稿提出的寶貴意見！

參考文獻(xiàn)：

［1］ 楊希山．腸道免疫學(xué)［J］．國外醫(yī)學(xué)：消化系疾病分冊，1995，15（1）：25－27．

［2］ 武慶斌．腸道菌群與腸上皮細(xì)胞和腸道免疫系統(tǒng)的相互作用機制［C］／／第六屆全國兒科微生態(tài)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨兒科微生態(tài)學(xué)新進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編．北京：中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會，2008：15－18．

［3］ 陽鋼．幾種微生態(tài)制劑對刺參（Apostichopus japoni?cus）養(yǎng)殖水體及刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響［D］．碩士學(xué)位論文．青島：中國海洋大學(xué)，2012．

［4］ SIMPSON J，MCCRACKEN V J，WHITE B A，et al．Application of denaturant gradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbi?ota［J］．Journal of Microbiological Methods，1999，36 （3）：167－169．

［5］ AMANN R I，LUDWIG W，SCHLEIFER K H．Phylo? genetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］．Microbiological Reviews，1995，59（1）：143－169．

［6］ VAN DER GAST C J，KNOWLES C J，WRIGHT M A，et al．Identification and characterisation of bacterial populations of an in?use metal?working fluid by phe?notypic and genotypic methodology［J］．International Biodeterioration＆Biodegradation，2001，47（2）：113－123．

［7］ MUYZER G，DE WAAL E C，UITTERLINDEN A G．Profiling of complex microbial populations by dena?turing gradient gel electrophoresis analysis of polymer?ase chain reaction?amplified genes coding for 16S rRNA［J］．Applied and Environmental Microbiology，1993，59（3）：695－700．

［8］ HOVDA M B，LUNESTAD B T，F(xiàn)ONTANILLAS R，et al．Molecular characterisation of the intestinal micro?biota of farmed Atlantic salmon（Salmo salar L．）［J］．Aquaculture，2007，272（1／2／3／4）：581－588．

［9］ ZHOU Z G，LIU Y C，SHI P J，et al．Molecular char?acterization of the autochthonous microbiota in the gastrointestinal tract of adult yellow grouper（Epi?nephelus awoara）cultured in cages［J］．Aquaculture，2009，286（3／4）：184－189．

［10］ 羅鵬，胡超群，張呂平，等．凡納濱對蝦海水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌群落的PCR?DGGE分析［J］．中國水產(chǎn)科學(xué)，2009，16（1）：32－38．

［11］ 高菲，孫慧玲，許強，等．刺參消化道內(nèi)含物細(xì)菌群落組成的PCR?DGGE分析［J］．中國水產(chǎn)科學(xué)，2010，17（4）：671－680．

［12］ 韓立麗，王建發(fā)，王鳳龍，等．黃芪多糖對腸道免疫功能影響的研究進(jìn)展［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2009，36 （8）：133－135．

［13］ 黃玉章，林旋，王全溪，等．黃芪多糖對羅非魚腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道免疫細(xì)胞的影響［J］．動物營養(yǎng)學(xué)報，2010，22（1）：108－116．

［14］ 汪婷婷，孫永欣，徐永平，等．多糖類免疫增強劑對海參腸道菌群的影響［J］．飼料工業(yè)，2008，9（4）：19－20．

［15］ 張紅梅，張磊，姜會民．甘露寡聚糖對生長期鯉魚生長性能及腸道菌群的影響［J］．中國飼料，2003（9）：22－23．

［16］ 楊世平，吳灶和，簡紀(jì)常．飼料中添加沼澤生紅冬孢酵母對凡納濱對蝦消化酶及腸道微生物的影響［J］．水產(chǎn)科學(xué)，2011，30（7）：391－394．

［17］ HOSEINIFAR S H，MIRVAGHEFI A，MERRIFIELD D L．The effects of dietary inactive brewer’s yeastSaccharomyces cerevisiae var．ellipsoideus on the growth，physiological responses and gut microbiota of juvenile beluga（Huso huso）［J］．Aquaculture，2011，318（1／2）：90－94．

［18］ 宮魁，王寶杰，劉梅，等．全營養(yǎng)破壁酵母對仿刺參非特異性免疫及腸道菌群的影響［J］．中國水產(chǎn)科學(xué)，2012，19（4）：641－646．

［19］ 王天明．刺參Apostichopus japonicus（Selenka）夏眠分子機理的基礎(chǔ)研究［D］．博士學(xué)位論文．青島：中國科學(xué)院研究生院，2011．

［20］ 孫奕，陳騳．刺參體內(nèi)外微生物組成及其生理特性的研究［J］．海洋與湖沼，1989，20（4）：300－307．

［21］ WARD?RAINEY N，RAINEY F A，STACKE?BRANDT E．A study of the bacterial flora associated with Holothuria atra［J］．Journal of Experimental Ma?rine Biology and Ecology，1996，203（1）：11－26．

［22］ KIM D H，BRUNT J，AUSTIN B．Microbial diversity of intestinal contents and mucus in rainbow trout（On?corhynchus mykiss）［J］．Journal of Applied Microbiol?ogy，2007，102（6）：1654－1664．

［23］ KNAPP B A，SEEBER J，PODMIRSEG S M，et al．Molecular fingerprinting analysis of the gut microbiota of Cylindroiulus fulviceps（Diplopoda）［J］．Pedobio?logia，2009，52（5）：325－336．

［24］ LIU H D，LIU M，WANG B J，et al．PCR?DGGE anal?ysis of intestinal bacteria and effect of Bacillus spp．on intestinal microbial diversity in kuruma shrimp（Mar?supenaeus japonicus）［J］．Chinese Journal of Ocean?ology and Limnology，2010，28（4）：808－814．

［25］ 楊鶯鶯，李卓佳，林亮，等．人工飼料飼養(yǎng)的對蝦腸道菌群和水體細(xì)菌區(qū)系的研究［J］．熱帶海洋學(xué)報，2006，25（3）：53－56．

［26］ 李可．對蝦養(yǎng)殖環(huán)境微生物多樣性分析和微生態(tài)制劑的研究與應(yīng)用［D］．博士學(xué)位論文．廈門：廈門大學(xué)，2007：21－49．

（責(zé)任編輯 菅景穎）

［27］ YANG G M，BAO B L，PEATMAN E，et al．Analysis of the composition of the bacterial community in puff?er fish Takifugu obscurus［J］．Aquaculture，2007，262 （2／3／4）：183－191．

Effect of Codonopsis pilosula as an Immunopotentiator on Intestinal Bacterial Community Composition of Apostichopus japonicus

FAN Ying LI Le YU Xiaoqing LIU Enfu LI Tianbao?XU La YE Haibin
（Marine Biology Institute of Shandong Province，Key Laboratory for Disease Control in Mariculture of Shandong Province，Qingdao 266002，China）

?Corresponding author，professor，E?mail：ltb1601＠126．com

Abstract：By plate counting method and polymerase chain reaction（PCR）?denaturing gradient gel electropho?resis（DGGE）technology，the effect of Codonopsis pilosula as an immunopotentiator on intestinal bacterial community composition of Apostichopus japonicas was investigated．Apostichopus japonicas with the initial body weight of（18．00±2．00）g were randomly divided into 2 groups（control group and experimental group）with 6 replicates per group and 12 Apostichopus japonicas per replicate．Apostichopus japonicas in the control group were fed a diet which were formulated using sea mud and Sargassum thunbergii powder with the mass ra?tio of sea mud to Sargassum thunbergii ratio was 1∶1，while those in the experimental group were fed the diet adding Codonopsis pilosula with the quantity of 2%Sargassum thunbergii powder weight．The feeding trial las?ted for 28 days．The results showed that immunopotentiator?Codonopsis pilosula could significantly promote the special growth rate（P＜0．05），reduce the feed conversion ratio（P＜0．05），and increase the count of hetero?trophic in intestinal content of Apostichopus japonicas（P＜0．05）．Sequence statistics showed that the propor?tion of superior sequence was significantly increased after feeding Codonopsis pilosula（P＜0．05），which in ex?perimental group was 97．57%and that in control group was only 80．22%．Beta?diversity analysis reported that the intestinal microenvironment of Apostichopus japonicas was changed after feeding Codonopsis pilosula，and the rages of coefficient variation were 14．91%to 15．47%，15．47%to 16．21%，and 14．91%to 16．21%．A?bundance analysis showed that the abundances of Proteobacteria and Bacteroidetes were increased，but the a?bundances of Verrucomicrobia，Actinobacteria and Firmiaites were decreased after feeding Codonopsis pilosula．The similarity coefficient of intestinal bacterial community composition between control group and experimental group was 0．97 by cluster analysis．It is concluded that Codonopsis pilosula as an immunopotentiator can im?prove the specific growth rate，reduce the feed conversion ratio，increase the count of heterotroph and the a?bundance of dominant bacteria in intestine，and optimize the intestinal microenvironment of Apostichopus ja?ponicus．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（2）：638?646］

Key words：immunopotentiator；Codonopsis pilosula；Apostichopus japonicus；intestine；bacterial communi?ty；DGGE

通信作者：?李天保，研究員，E?mail：ltb1601＠126．com

作者簡介：樊 英（1980—），女，山東榮成人，助理研究員，碩士，研究方向為水產(chǎn)病害防治。E?mail：fy＿fy123＠126．com

基金項目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系刺參產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目（SDAIT?08）；山東省科技發(fā)展計劃項目（2012YD10016）；海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（201305005）；“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAD13B03）

收稿日期：2014－09－16

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．02．037

文章編號：1006?267X（2015）02?0638?09

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：S917．1