單胃動物仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料酶水解物能值可加性的研究

趙 峰 李 輝 張宏福（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

單胃動物仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料酶水解物能值可加性的研究

趙 峰 李 輝 張宏福
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

摘 要：本試驗(yàn)旨在通過探討單胃動物仿生消化系統(tǒng)測定鴨飼料酶水解物能值（EHGE）的可加性，進(jìn)一步檢驗(yàn)仿生消化方法的可行性。采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計，共12個處理，其中處理1～4分別為玉米、大豆粕、棉籽粕、小麥麩飼糧，處理5～12為以上2種或2種以上的飼料原料按不同比例組合制備的8種飼糧。每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。通過仿生消化系統(tǒng)測定各處理的干物質(zhì)消化率（DMD）和EHGE，并根據(jù)飼糧中飼料原料的比例及其DMD和EHGE分別計算飼糧的DMD和EHGE。結(jié)果表明，8個飼糧DMD實(shí)測值的平均值顯著高于計算值的平均值（分別為70．15%和69．48%，P＝0．000 9），但從DMD的計算值對實(shí)測值的線性回歸看，模型的決定系數(shù)為0．993 3（P＜0．05），截距與0無顯著性差異（截距＝1．77，P＝0．468 3），斜率與1無顯著性差異（截距＝0．98，P＝0．647 4）。DMD實(shí)測值的方差和變異系數(shù)分別顯著低于計算值的方差和變異系數(shù)（P＝0．000 2和P＝0．001 0）。在計算值的方差對實(shí)測值方差的線性回歸，計算值變異系數(shù)對實(shí)測值變異系數(shù)的線性回歸上，模型的決定系數(shù)分別為0．020 8（P＞0．05）和0．115 7（P＞0．05）。8個飼糧EHGE實(shí)測值的平均值與計算值的平均值無顯著性差異（分別為13．21和13．21 MJ／kg，P＝0．965 3）。從EHGE的計算值對實(shí)測值的線性回歸看，模型的決定系數(shù)為0．991 0（P＜0．05），截距與0無顯著性差異（截距＝0．04，P＝0．941 9），斜率與1無顯著性差異（截距＝1．00，P＝0．940 0）。EHGE實(shí)測值的方差平均值與計算值的方差平均值無顯著差異（P＝0．681 1），而實(shí)測值變異系數(shù)的平均值與計算值的變異系數(shù)平均值有顯著性差異（P＝0．003 6）。在計算值的方差對實(shí)測值方差的線性回歸，計算值變異系數(shù)對實(shí)測值變異系數(shù)的線性回歸上，模型的決定系數(shù)分別為0．200 0（P＞0．05）和0．080 5（P＞0．05）。綜合上述結(jié)果，仿生消化法測定玉米、大豆粕、棉籽粕、小麥麩的DMD和EHGE在飼糧中具有可加性，然而測試數(shù)據(jù)的方差與變異系數(shù)不具有可加性。

關(guān)鍵詞：仿生消化系統(tǒng)；酶水解物能值；干物質(zhì)消化率；可加性

在家禽代謝能值的測定中，飼料原料間測值的可加性是檢驗(yàn)測定方法是否成立的基本原則之一［1］。近年來，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在基于單胃動物仿生消化系統(tǒng)（SDS?1）和模擬消化液測定飼料有效能值的方法學(xué)研究上，已對測試結(jié)果的重演性、影響因素進(jìn)行了一系列研究［2－4］。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢驗(yàn)該方法系統(tǒng)的可加性，是確立仿生消化法能否用于估測飼料能量生物學(xué)效價的決策依據(jù)之一。目前，在生物學(xué)試驗(yàn)中，測定方法的可加性檢驗(yàn)一般采用配對或兩樣本t檢驗(yàn)的統(tǒng)計方法對組合后樣品中待測物濃度（劑量）的實(shí)測值與計算值進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)［5－7］。近年來，在醫(yī)學(xué)上采用SAS的ANCOV分析2個或多個因素間所引起的生物學(xué)效應(yīng)是否具有可加性［8］。該方法的思路是通過分析因素組合后生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)測值與根據(jù)單一因素的效應(yīng)與因素間組合的比例獲得的計算值之間的回歸直線與y（實(shí)測值）＝x（計算值）是否有顯著性差異來判別其是否具有可加性。本試驗(yàn)中，仿生消化法的測試結(jié)果及數(shù)據(jù)變異的可加性也適合用SAS REG模塊的TEST選項(xiàng)分析計算值對實(shí)測值的線性回歸來判別。因此，本試驗(yàn)采用該統(tǒng)計方法，通過分析仿生消化法測試數(shù)據(jù)的平均值、方差、變異系數(shù)的可加性，為仿生消化法能否用于飼料酶水解物能值（enzyme hy?drolysate gross energy，EHGE）的測定提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1 飼料原料

選用玉米、大豆粕、棉籽粕、小麥麩4種常用飼料原料。采用四分法取樣后用萬能粉碎機(jī)粉碎并過40目篩。充分混合均勻，貯存于樣品瓶中－20℃保存?zhèn)溆谩ｏ暳显霞捌錉I養(yǎng)成分見表1。

表1　飼料原料及其營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Feedstuffs and their nutrient contents（DM basis）　%

1．2 試驗(yàn)設(shè)計

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計，共12個處理（表2），其中處理1～4分別為4種單一飼料原料飼糧，處理5～12為2種或2種以上的飼料原料按不同比例組合制備的8種飼糧。每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。在仿生消化系統(tǒng)中以鴨模擬消化液及流程分別測定各處理的干物質(zhì)消化率（dry matter digestibility，DMD）和EHGE。

1．3 基于SDS?1的仿生消化操作規(guī)程

鴨的仿生消化過程參照趙峰等［9］關(guān)于SDS?1測定鴨飼料EHGE的操作過程進(jìn)行。透析袋的型號與前處理、胃緩沖液、小腸前段緩沖液、小腸后段緩沖液按照《鴨飼料酶水解物能值測定技術(shù)規(guī)程》［10］進(jìn)行制備。模擬消化液的制備如下：

模擬鴨胃液：稱取387．5 kU的胃蛋白酶（Sig?ma，P7000）溶解于250 mL pH 2．0的鹽酸溶液中（42℃下標(biāo)定pH），緩慢攪拌直至溶解。臨用前配制。

模擬鴨小腸液：稱（量）取淀粉酶（Sigma，A3306）110．43 kU，胰蛋白酶（Amersco，0785） 29．92 kU，糜蛋白酶（Amersco，0164）10．73 kU溶解于25 mL去離子水中，并緩慢攪拌直至溶解。臨用前配制。

SDS?1模擬鴨消化過程的主要步驟列于表3。

按GB／T 6435—2006［11］測定水分并計算其干物質(zhì)含量，并根據(jù)ISO 9831∶1998［12］的規(guī)定測定待測飼料和未水解殘渣的總能。

酶空白對照值參照嚴(yán)峰等［13］的數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，其中干物質(zhì)的殘留量為0．044 5 g／樣，能量殘留量為442 J／樣。

1．4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

根據(jù)單因素完全隨機(jī)設(shè)計，以SAS 9．0［14］的MEANS模塊對基本統(tǒng)計量進(jìn)行分析。通過TTEST模塊的Paired選項(xiàng)對飼糧DMD、EHGE及其方差和變異系數(shù)的實(shí)測值與計算值間的差異進(jìn)行配對t檢驗(yàn)。以REG模塊通過TEST選項(xiàng)分析飼糧DMD、EHGE及其方差和變異系數(shù)計算值對實(shí)測值的回歸斜率與截距分別與1和0的顯著性差異來判斷實(shí)測值與計算值是否相等而檢驗(yàn)是否具有可加性。其中數(shù)據(jù)計算公式如下：

表2　試驗(yàn)飼糧組成Table 2 Composition of experimental diets

表3　鴨體外仿生消化操作過程Table 3 Procedure of in vitro simulated digestion for ducks

式中：M1為飼料樣品干物質(zhì)重量（g）；M2為殘渣干物質(zhì)重量（g）；R為消化酶空白的殘留量（g）；ai為飼糧中該飼料原料所占比例（%）；DMDi為飼糧中第i個飼料原料的DMD值（%）；GE1為飼料樣品總能值（MJ／kg）；GE2為殘渣總能值（MJ／kg）；RE為消化酶空白殘留的總能（MJ／kg）；EHGEi為飼糧中第i個飼料原料的EHGE值（MJ／kg）；Xi為第i個測定值；V（Xi）為重復(fù)測定該飼料原料DMD或EHGE的方差；S為標(biāo)準(zhǔn)差；?X為計算的飼糧DMD或EHGE的平均值。

2　結(jié)果與分析

2．1 仿生消化系統(tǒng)測定飼料間DMD的可加性

由表4可見，由玉米、大豆粕、棉籽粕和小麥麩按不同比例配合成8個飼糧后，通過SDS?1仿生消化獲得的8個飼糧DMD實(shí)測值的平均值顯著高于計算值的平均值（分別為70．15%和69．48%，P＝0．000 9）。但從DMD的計算值對實(shí)測值的線性回歸看，模型的決定系數(shù)為0．993 3 （P＜0．05），截距與0無顯著性差異（截距＝1．77，P＝0．468 3），斜率與1無顯著性差異（截距＝0．98，P＝0．647 4）。這表明8個飼糧的DMD實(shí)測值對計算值的一元線性回歸模型與y＝x這一直線相重合。DMD實(shí)測值的方差和變異系數(shù)分別顯著低于計算值的方差和變異系數(shù)（分別為0．05%2和0．09%2，P＝0．000 2；0．29%和0．44%，P＝0．001 0）。在計算值的方差對實(shí)測值方差的線性回歸，計算值變異系數(shù)對實(shí)測值變異系數(shù)的線性回歸上，模型的決定系數(shù)分別為0．020 8（P＞0．05）和0．115 7（P＞0．05），這表明它們之間沒有線性關(guān)系，因此，DMD實(shí)測值的方差、變異系數(shù)與計算值相應(yīng)變量的一元線性回歸模型同y＝x這一直線不重合。

2．2 仿生消化系統(tǒng)測定飼料間EHGE的可加性

由表5可見，通過SDS?1仿生消化獲得的8個飼糧EHGE實(shí)測值的平均值與計算值的平均值無顯著性差異（分別為13．21和13．21 MJ／kg，P＝0．965 3）。從EHGE的計算值對實(shí)測值的線性回歸看，模型的決定系數(shù)為0．991 0（P＜0．05），截距與0無顯著性差異（截距＝0．04，P＝0．941 9），斜率與1無顯著性差異（截距＝1．00，P＝0．940 0）。這表明8個飼糧的EHGE實(shí)測值與計算值的一元線性回歸模型與y＝x這一直線相重合。EHGE實(shí)測值的方差平均值與計算值的方差平均值無顯著差異［分別為0．01和0．01（MJ／kg）2，P＝0．681 1］，而實(shí)測值變異系數(shù)的平均值與計算值的變異系數(shù)平均值有顯著性差異（分別為0．50%和1．00%，P＝0．003 6）。在計算值的方差對實(shí)測值方差的線性回歸，計算值變異系數(shù)對實(shí)測值變異系數(shù)的線性回歸上，模型的決定系數(shù)分別為0．200 0（P＞0．05）和0．080 5（P＞0．05），這表明它們之間沒有線性關(guān)系，因此，EHGE實(shí)測值的方差、變異系數(shù)與計算值相應(yīng)變量的一元線性回歸模型同y＝x這一直線不重合。

3　討 論

3．1 測定方法可加性的適宜統(tǒng)計學(xué)判別依據(jù)

在飼糧的配制中，人們假設(shè)某一可消化養(yǎng)分的含量等于各原料分別提供的相應(yīng)可消化養(yǎng)分的累計。因此，在飼料能量與氨基酸生物學(xué)效價測定方法的探討中，可加性的檢驗(yàn)顯得非常重要。同時，它也是反映方法是否靈敏的依據(jù)之一［15］。目前，在檢驗(yàn)測試結(jié)果可加性的統(tǒng)計方法上，分為3類：1）以單個飼糧實(shí)測值為樣本均值，以計算值為總體均值，通過t檢驗(yàn)統(tǒng)計計算值與實(shí)測值差異的顯著性［5－7，16］；2）評估計算值與實(shí)測值的差異是否在測定方法的誤差范圍內(nèi)［1］；3）設(shè)置一系列不同待測物含量水平的處理，通過線性回歸分析計算值對實(shí)測值的線性模型是否符合斜率等于1，截距等于0，從而得出在該測試范圍內(nèi)方法是否具有可加性［8］。從這3類判別方法的依據(jù)看，第1類t檢驗(yàn)是根據(jù)樣本均值與整體平均值（或兩樣本均值）的差是否處于μ＝0的t分布函數(shù)95%的分布區(qū)間內(nèi)來判斷實(shí)測值與計算值是否相等，而不考慮方法對樣本間測值的內(nèi)在聯(lián)系；第2類是根據(jù)方法的測試誤差判斷實(shí)測值與計算值是否相等，在理論上與t檢驗(yàn)類似，只是將這一差異的判斷尺度相對固定，而不考慮樣本測試值的變異；第3類通過計算值對實(shí)測值的回歸直線的斜率是否等于1與截距是否等于0，而判斷一系列實(shí)測值與計算值的關(guān)系是否符合y＝x這一通過原點(diǎn)的直線，既考慮了不同處理水平樣本平均值與整體的差異，也考慮了方法對樣本間測值的內(nèi)在聯(lián)系。因此，該統(tǒng)計方法在判斷可加性上更為客觀、科學(xué)［8］。

表4　飼糧干物質(zhì)消化率的平均值、方差、變異系數(shù)的實(shí)測值與計算值Table 4 The determined and calculated values for mean，variance and CV of DMD of diets

表5　飼糧酶水解物能值的平均值、方差、變異系數(shù)的實(shí)測值與計算值Table 5 The determined and calculated values for mean，variance and CV of enzymeal hydrolysate gross energy of diets

3．2 仿生消化系統(tǒng)測試結(jié)果可加性的檢驗(yàn)

在排空強(qiáng)飼法測定雞飼料的代謝能值上，Sib?bald［5］得出了玉米、小麥、大豆粕、魚粉、苜蓿、牛油的真代謝能（TME）值在10個雞飼糧中具有可加性。Hong等［6］得出大麥與菜籽粕的TME值在鴨飼糧中具有可加性。在仿生消化法測定雞飼料EHGE的可加性上，Zhao等［7］得出玉米、大豆粕、棉籽粕的EHGE在3個飼糧中均具有可加性。由此可見，現(xiàn)有的飼料能量的生物學(xué)效價測定方法在一定范圍內(nèi)均具有滿意的可加性。本研究中，由4個飼料原料配制成8個飼糧后，每個飼糧的DMD實(shí)測值均稍高于計算值，由此使得配對t檢驗(yàn)差異顯著。然而，DMD實(shí)測值與計算值的平均差異為0．67%（7個飼糧兩者的差異均不超過1%），且這一差異在單胃動物仿生消化系統(tǒng)測試允許的誤差范圍內(nèi)［2］。與此同時，通過回歸分析表明，飼糧DMD的實(shí)測值與計算值分布在y＝x這一直線上。由此表明，4種飼料原料的DMD在8個飼糧中是可加的。同樣，在EHGE上，t檢驗(yàn)的結(jié)果與線性回歸均表明4種飼料原料的EHGE在8個飼糧中也是可加的。這主要是由于在仿生消化中，模擬消化液內(nèi)消化酶的濃度是根據(jù)體內(nèi)消化酶的活性制備，而這一消化酶的活性相對于飼料底物是過量的［17］，因此，飼料中底物的量與化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了測試結(jié)果，從而使得其具有可加性。然而，在DMD與EHGE的方差與變異系數(shù)上，原料的測試結(jié)果的方差與變異系數(shù)在飼糧中都不具有可加性。這是由于飼糧在實(shí)測值中重復(fù)的變異與單一飼料原料的變異相似，甚至低于單一飼料的變異，因此，實(shí)測值的方差或變異系數(shù)低于計算值的相應(yīng)值。

4　結(jié) 論

仿生消化法測定玉米、大豆粕、棉籽粕、小麥麩的DMD和EHGE在飼糧中具有可加性，然而測試數(shù)據(jù)的方差與變異系數(shù)不具有可加性。

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（責(zé)任編輯 武海龍）

Additivity of Enzyme Hydrolysate Gross Energy of Feedstuffs Determined Using Computer?Controlled Simulated Digestion System for Ducks

ZHAO Feng LI Hui ZHANG Hongfu
（State Key Laboratory of Animal Nutrition，Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agriculture Science，Beijing 100193，China）

Author，ZHAO Feng，associate professor，E?mail：zsummit＠iascaas．net．cn

Abstract：Additivity of enzyme hydrolysate gross energy（EHGE）of feedstuffs determined using computer?controlled simulated digestion system was investigated to validate the method for in vitro digestion．Twelve treatments consisted of 4 feedstuffs and 8 diets were used in a single factorial completely randomized arrange?ment．Treatments 1 to 4 were corn，soybean meal，cottonseed meal and wheat bran diets，respectively．Treat?ments 5 to 12 were 8 diets formulated with 2，3 or 4 feedstuffs at different concentration．Each treatment con?tained 5 replicates with 1 digestion tube per replicate．The dry matter digestibility（DMD）and EHGE of each treatment were determined using computer?controlled simulated digestion system．The calculated DMD and EH?GE of treatments 5 to 12 were estimated according to the determined DMD and EHGE of individual ingredients and their concentrations in the diets，respectively．The results showed as follows：the mean of determined DMD was greater than that of calculated values of 8 diets（70．15%and 69．48%for determined and calculated val?ues，respectively；P＝0．000 9）．However，the regression of determined values on calculated values for DMD revealed that the coefficient of determination was 0．993 3（P＜0．05），and the intercept did not differ from 0 （intercept＝1．77，P＝0．468 3）and slope did not differ from 1（slope＝0．98，P＝0．647 4）．The variance and coefficient of variation（CV）of determined values were less than those of calculated values for DMD（P＝0．000 2 and P＝0．001 0 for variance and CV，respectively）．The regression of observed values on calculated values for variance and CV of DMD showed that the coefficients of determination were 0．020 8（P＞0．05）and 0．115 7（P＞0．05），respectively．No significant difference was observed between the determined values and calculated values for EHGE（13．21 and 13．21 MJ／kg for determined and calculated values，respectively；P＝0．965 3）．The regression of determined values on calculated values for EHGE revealed that the coefficient of determination was 0．991 0（P＜0．05），and the intercept did not differ from 0（intercept＝0．04，P＝0．941 9）and slope did not differ from 1（slope＝1．00，P＝0．940 0）．The differences between observed values and cal?culated values were not significant for variance（P＝0．681 1），however，significant for CV（P＝0．003 6）．The regression of observed values on calculated values for variance and CV of DMD showed that the coeffi?cients of determination were 0．020 0（P＞0．05）and 0．080 5（P＞0．05），respectively．In conclusion，the val?ues in corn，soybean meal，cottonseed meal and wheat bran are additive for DMD and EHGE in a complete di?et，respectively．However，the values for variance and CV are not additive，respectively．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（2）：495?502］

Key words：simulated digestion system；enzyme hydrolysate gross energy；dry matter digestibility；additivity

作者簡介：趙 峰（1977—），男，湖南雙峰人，副研究員，博士，主要從事飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價評定的研究。E?mail：zsummit＠iascaas．net．cn

基金項(xiàng)目：基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2011yq?1）；科技部創(chuàng)新方法工作專項(xiàng)（2009IM033100）

收稿日期：2014－08－28

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．02．020

文章編號：1006?267X（2015）02?0495?08

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：S831