弱精子癥患者精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)及DNA碎片化指數(shù)的檢測(cè)與分析

焦瑞寶，　姚余有，　唐吉斌，　馮恒孝，　鳳俊蓉

弱精子癥患者精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)及DNA碎片化指數(shù)的檢測(cè)與分析

焦瑞寶1，姚余有1，唐吉斌2，馮恒孝2，鳳俊蓉2

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 合肥 230032; 2. 銅陵市人民醫(yī)院，安徽 銅陵 244009)

摘要：目的了解弱精子癥患者精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)和DNA碎片化指數(shù)(DFI)的變化情況。方法通過對(duì)41例弱精子癥患者(弱精子癥組)和48例活力正常不育患者(活力正常組)精液的常規(guī)檢測(cè)、精液分析儀檢測(cè)和熒光顯微鏡檢查，比較弱精子癥組和活力正常組精液常規(guī)參數(shù)(包括精子濃度、精子總數(shù)、活動(dòng)率)、精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)[包括前向運(yùn)動(dòng)率(PR)、平均路徑速率(VAP)、曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、直線性(LIN)、擺動(dòng)性(WOB)、前向性(STR)、頭側(cè)擺幅度(ALH)、鞭打頻率(BCF)和平均角位移(MAD)]及DFI。結(jié)果弱精子癥組精子濃度、精子總數(shù)、活動(dòng)率、PR、VAP、VCL、VSL、LIN、WOB、STR、ALH、BCF及MAD分別為(69.0±49.1)×106/mL、(203±159)×106、60.8%±15.7%、21.1%±8.0%、(10.7±2.8)μm/s、(20.6±4.9)μm/s、(6.3±2.2)μm/s、29.9%±8.1%、51.4%±5.8%、57.2%±10.4%、(0.53±0.12)μm、(3.20±0.85)Hz和(14.2±3.2)°，均明顯低于活力正常組[(98.8±38.2)×106/mL(P<0.05)、(281±171)×106(P<0.05)、82.0%±7.9%(P<0.01)、45.1%±8.5%(P<0.01)、(18.5±3.0)μm/s(P<0.01)、(30.7±5.3)μm/s(P<0.01)、(12.0±2.3)μm/s(P<0.01)、39.6%±7.0%(P<0.01)、60.5%±5.0%(P<0.01)、65.1%±7.2%(P<0.01)、(0.72±0.13)μm(P<0.01)、(5.07±0.81)Hz(P<0.01)和(17.8±2.5)°(P<0.01)]；而DFI(17.9%±12.5%)明顯高于活力正常組(8.5%±6.4%，P<0.01)。結(jié)論弱精子癥患者除了表現(xiàn)為常規(guī)檢查中的精子活力低下外，還伴有精子濃度和總數(shù)下降、精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)下降以及精子DFI的增高，這些參數(shù)的改變可能是弱精子癥引起男性不育的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)；DNA碎片化指數(shù)；精液常規(guī)參數(shù)；弱精子癥

The detection and analysis of sperm motion parameters and DNA fragmentation index in asthenozoospermia patientsJIAORuibao1，YAOYuyou1，TANGJibin2，F(xiàn)ENGHengxiao2，F(xiàn)ENGJunrong2

.(1.SchoolofPublicHealth，AnhuiMedicalUniversity，AnhuiHefei230032,China; 2.TonglingPeople′sHospitalofAnhuiProvince，AnhuiTongling244009，China)

Abstract:ObjectiveTo study the changes of sperm motion parameters and DNA fragmentation index (DFI) in patients with asthenozoospermia. MethodsThe routine analysis， semen analyzer activity detection and fluorescence microzooscopy of 41 cases of asthenozoospermia patients(asthenozoospermia group) and 48 cases of normal vitality patients(normal vitality group) were performed. Semen routine parameters(sperm concentration， total number of sperm and sperm activity rate)， sperm motion parameters [progressive motility(PR)， average path velocity(VAP)， curvilinear velocity(VCL)， straight line velocity(VSL)， linearity(LIN)， wobble(WOB)， straightness(STR)， amplitude of lateral head displacement(ALH)， beat-cross frequency(BCF) and mean angular displacement(MAD)] and DFI in patients with asthenozoospermia and normal vitality group were compared. ResultsThe sperm concentration， total number of sperm， sperm activity rate， PR， VAP, VCL， VSL， LIN， WOB， STR， ALH， BCF and MAD of asthenozoospermia group were (69.0±49.1)×106/mL， (203±159)×106， 60.8%±15.7%， 21.1%±8.0%，(10.7±2.8)μm/s， (20.6±4.9)μm/s， (6.3±2.2)μm/s， 29.9%±8.1%，51.4%±5.8%， 57.2%±10.4%， (0.53±0.12)μm， (3.20±0.85)Hz and (14.2±3.2)°， respectively. These parameters were significantly lower than those of normal vitality group[(98.8±38.2)×106/mL(P<0.05)，(281±171)×106(P<0.05)， 82.0%±7.9%(P<0.01)， 45.1%±8.5%(P<0.01)， (18.5±3.0)μm/s(P<0.01)， (30.7±5.3)μm/s(P<0.01)， (12.0±2.3)μm/s (P<0.01)， 39.6%±7.0%(P<0.01)， 60.5%±5.0%(P<0.01)， 65.1%±7.2%(P<0.01)， (0.72±0.13)μm (P<0.01)， (5.07±0.81)Hz(P<0.01) and (17.8±2.5)°(P<0.01)]. The DFI in asthenozoospermia group(17.9%±12.5%) was significantly higher than that in normal vitality group(8.5±6.4%，P<0.01). ConclusionsBesides the performance of low sperm motility， asthenozoospermia is still accompanied by decreasing sperm concentration, total number of sperm and sperm motion parameters and increasing sperm DFI. The change of these parameters may be one of the mechanisms of male infertility caused by asthenozoospermia.

Key words:Sperm motion parameter; DNA fragmentation index; Semen routine parameter; Asthenozoospermia

據(jù)2011年出版的第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》規(guī)定[1]，弱精子癥是指前向運(yùn)動(dòng)(progressive motility，PR)精子百分率低于參考區(qū)間下限(32%)的一類男性不育癥，是引起男性不育最為常見的疾病之一。我們對(duì)弱精子癥患者的精液進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)、精液分析儀檢測(cè)和熒光顯微鏡檢查，旨在了解弱精子癥患者的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)和DNA碎片化指數(shù)(DNA fragmentation index, DFI)的變化情況。

材料和方法

一、材料

1. 研究對(duì)象選取2011年9月至2014年3月銅陵市人民醫(yī)院男科、不孕不育門診以及泌尿外科的男性不育患者89例，其中弱精子癥患者41例，活力正常的男性不育患者48例，兩者的診斷標(biāo)準(zhǔn)均參見《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)[1]，排除嚴(yán)重少精子癥、無精子癥病例。

2. 儀器設(shè)備及試劑計(jì)算機(jī)輔助精子動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)由南京捷達(dá)科技有限公司提供；OLYMPUX BX41熒光顯微鏡由日本奧林帕斯公司提供；精子核染色試劑盒由深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供。

3. 室內(nèi)質(zhì)量控制每周采用測(cè)微尺對(duì)計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)進(jìn)行定標(biāo)，確保檢測(cè)系統(tǒng)準(zhǔn)確；另當(dāng)精子濃度過高(>50×106/mL)時(shí)，可能會(huì)因高頻度精子碰撞而產(chǎn)生誤差，故應(yīng)對(duì)高濃度標(biāo)本進(jìn)行稀釋，即取出一定量的精液樣本16 000×g離心6 min，獲取無精子的精漿，用無精子精漿稀釋最初的精液標(biāo)本，使?jié)舛鹊陀?0×106/mL，然后再采用計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

二、 方法

1．標(biāo)本收集所有研究對(duì)象按文獻(xiàn)[1]要求在取精前禁欲3～5d，手淫法采集精液于干燥無菌取精杯中，30 min內(nèi)保溫送檢，記錄留取時(shí)間，60 min內(nèi)完成檢驗(yàn)。

2．精液動(dòng)態(tài)分析按文獻(xiàn)[1]要求操作，將送來的精液標(biāo)本置37℃水浴箱中，觀察液化狀態(tài)及液化時(shí)間，并記錄精液體積。取充分混勻的精液5～10 μL置于精子計(jì)數(shù)盤中，采用計(jì)算機(jī)輔助精子動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，包括精子濃度、精子活動(dòng)率、精子運(yùn)動(dòng)速度參數(shù)[平均路徑速率(average path velocity, VAP)、曲線速度(curvilinear velocity, VCL)、直線速度(straight line velocity, VSL)]以及精子運(yùn)動(dòng)軌跡特征參數(shù)[包括直線性(linearity, LIN)、擺動(dòng)性(wobble, WOB)、前向性(straightness, STR)、頭側(cè)擺幅度(amplitude of lateral head displacement, ALH)、鞭打頻率(beat-cross frequency, BCF)和平均角位移(mean angular displacement, MAD)]。

3．精子DFI的測(cè)定精液液化并計(jì)數(shù)，取液化精液1.0 mL加于離心管內(nèi)，1 000×g離心5 min，去除精漿；加1 mL稀釋洗滌液，充分混勻，500×g離心5 min，去上清液，如此洗滌3次；最后1次洗滌完畢，棄上清液，用稀釋洗滌液調(diào)整精子濃度為20×106/mL。取5～10 μL懸浮液于清潔載玻片上涂片，晾干，滴加數(shù)滴乙醛固定液固定10 min，后將玻片直立于吸水紙上以除去固定液；滴加數(shù)滴新鮮配制的吖啶橙工作液染色5 min，流水沖洗，晾干；熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)460～490 nm)，每個(gè)視野觀察時(shí)間不超過40 s。利用吖啶橙異染性，吖啶橙與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合發(fā)出紅色或黃色熒光，計(jì)數(shù)200條精子中綠色、紅色和橙黃色精子數(shù)。計(jì)算出紅色、橙黃色熒光精子的百分率，即為精子DFI[2]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

弱精子癥組和活力正常組之間年齡和精液量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。弱精子癥組精子濃度、精子總數(shù)、精子活動(dòng)率和PR均明顯低于活力正常組(P<0.05、P<0.01)，DFI (17.9%±12.5%)明顯高于活力正常組(8.5%±6.4%；t=4.33,P<0.01)。見表1。

弱精子癥組精子運(yùn)動(dòng)速度參數(shù)(包括VAP、VCL、VSL)、前向性運(yùn)動(dòng)參數(shù)(包括LIN、WOB、STR)及運(yùn)動(dòng)軌跡特征參數(shù)(包括ALH、BCF、MAD)均明顯低于活力正常組(P均<0.01)。見表1。

表1　弱精子癥組與活力正常組精液質(zhì)量參數(shù)、精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)及運(yùn)動(dòng)軌跡特征參數(shù)的比較　)

討論

引起男性不育癥的原因很多，包括無精子癥、弱精子癥、少精子癥和畸形精子癥等，弱精子癥是最為常見病因之一。引起弱精子癥的原因很多，常見有精索靜脈曲張、睪丸炎、隱睪、附屬性腺感染以及年齡、基因異常、環(huán)境污染物影響等。弱精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)近年來也在變化，2001年《世界衛(wèi)生組織人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》[3](第4版)規(guī)定：射精后60 min內(nèi)，前向運(yùn)動(dòng)精子少于50%或者快速前向運(yùn)動(dòng)精子少于25%則判斷為弱精子癥；而2011年第5版的《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》規(guī)定：前向運(yùn)動(dòng)精子低于32%為弱精子癥[1]。從兩者的診斷標(biāo)準(zhǔn)可以判斷，PR明顯下調(diào)，降低了標(biāo)準(zhǔn)。弱精子癥的診斷主要依賴于不育患者的精液實(shí)驗(yàn)室分析，早年精液分析由人工完成，主要進(jìn)行精液量、精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)力、精子活動(dòng)率和是否液化等方面的檢測(cè)，從而判斷正常與否。人工檢測(cè)的影響因素多，結(jié)果準(zhǔn)確性差。近20年來，伴隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、顯微鏡技術(shù)和圖像處理技術(shù)的發(fā)展，利用計(jì)算機(jī)輔助的精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)得到大力發(fā)展和推廣，目前已經(jīng)成為各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)用于精液分析的主要儀器設(shè)備。計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)(computer-aid sperm analysis，CASA)可進(jìn)行精子濃度計(jì)數(shù)、活力分級(jí)，特別是在精子微細(xì)運(yùn)動(dòng)的測(cè)算與評(píng)價(jià)方面具有傳統(tǒng)手工檢測(cè)無法比擬的優(yōu)勢(shì)，可得到十幾項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)[4]。

精子DFI是近些年受到廣泛關(guān)注的一項(xiàng)反映精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的參數(shù)，精子運(yùn)動(dòng)速度參數(shù)(VAP、VCL和VSL)是反映精子活力的重要參數(shù)，精子前向運(yùn)動(dòng)能力下降主要體現(xiàn)在精子運(yùn)動(dòng)速度的降低[5]。袁平慶等[6]在對(duì)體外受精的研究中發(fā)現(xiàn)，高受精率組VAP、VCL和ALH均高于低受精組。精子具有正常活動(dòng)力是保證到達(dá)輸卵管、使卵子受精的一項(xiàng)基本條件[7]。

本研究結(jié)果顯示，弱精子癥組年齡和精液量與活力正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而精子活動(dòng)率、濃度、總數(shù)、PR和運(yùn)動(dòng)參數(shù)(包括VAP、VCL、VSL、ALH、BCF、MAD、LIN、WOB和STR)均明顯低于活力正常組(P<0.05、P<0.01)；精子DFI明顯高于活力正常組(P<0.01)，與文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]一致。

綜上所述，弱精子癥患者除了精子活力低下外，還伴有精子濃度及總數(shù)下降，精子運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)特征參數(shù)全面下降以及精子DFI增高，這些參數(shù)的改變可能是弱精子癥引起男性不育的機(jī)制之一。

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(本文編輯：范基農(nóng))

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收稿日期：(2014-12-16)

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)05-0442-04R446.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.008

通訊作者：姚余有，聯(lián)系電話：0551-63869179。

作者簡(jiǎn)介：焦瑞寶，男，1974年生，碩士，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)、教學(xué)及科研工作。

基金項(xiàng)目：銅陵市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013NS07)；銅陵市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(衛(wèi)科研[2013]15號(hào))