蓮瓣蘭大雪素SEP 1基因克隆和表達的研究

張雪梅， 趙 婧， 趙銀河

（云南農(nóng)業(yè)大學作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點實驗室和工程中心， 昆明650201）

全球開花植物已知有250 000多種，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中占有明顯的優(yōu)勢?；ㄆ鞴偈侵参锷尺^程中的重要的器官，已經(jīng)成為進化論者和生態(tài)學家的研究焦點。對授粉方式的適應(yīng)，花器官發(fā)生了巨大變化，有利于對被子植物花器官進化的進一步了解。

開花是高等植物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的一個重要過程，即受外界環(huán)境因素的影響，又受內(nèi)在基因的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)MADS－box基因在花發(fā)育過程中起著重要作用［1］。隨著花器官發(fā)育研究的深入，有關(guān)花器官發(fā)育的相關(guān)基因研究已取得了突破性的進展，這主要體現(xiàn)在通過對雙子葉植物擬南芥和金魚草的花同源異型突變體的研究發(fā)現(xiàn)上。這些雙子葉植物的花由同心圓的四輪結(jié)構(gòu)組成，從外向內(nèi)依次為：第1輪萼片，第2輪花瓣，第3輪雄蕊，第4輪心皮［2］。花器官的同源異形突變體有一個共同的特征，即相鄰兩輪器官的發(fā)育同時受到影響。按照變異器官分布的空間順序，這些突變體分為三類：第一類突變體的萼片轉(zhuǎn)化為心皮，花瓣轉(zhuǎn)化為雄蕊，導致花的組成由外至內(nèi)依次為心皮－雄蕊－雄蕊－心皮；第二類突變體將花瓣轉(zhuǎn)化為萼片，雄蕊轉(zhuǎn)化為心皮，花組成為萼片－萼片－心皮－心皮；第三類突變體雄蕊轉(zhuǎn)化為花瓣，心皮轉(zhuǎn)化為類似萼片的結(jié) 構(gòu)，花組成為萼片－花瓣－花瓣－萼 片［3－4］。通 過ABC功能基因的轉(zhuǎn)化，無法使葉片轉(zhuǎn)變成花器官，因此，植物從營養(yǎng)器官到花器官轉(zhuǎn)變的過程還需要其他花發(fā)育相關(guān)基因的參與［2－3］。在尋找與 ABC類基因相互作用的蛋白時發(fā)現(xiàn)了這類SEPALLATA（SEP）基因。目前ABCE模型能成功地解釋花器官發(fā)育，即A＋E控制萼片的發(fā)育，A＋B＋E控制花瓣的發(fā)生，B＋C＋E控制雄蕊的發(fā)育，C＋E決定心皮的發(fā)育［5］。另外，胚胎的發(fā)育由D和E類基因共同控制。在擬南芥中，E類基因有4個，SEPALLATA 1（SEP 1），SEP 2，SEP 3，SEP 4［3］，它們在功能上是冗余的，在四輪花器官中都表達，單獨突變sep 4沒有明顯的表型變化，如果sep 1、sep 2、sep 3、sep 4四類基因都突變，那么，所有花器官變成葉狀的結(jié)構(gòu)，表明擬南芥的SEP 1、SEP 2、SEP 3、SEP 4基因都與花發(fā)育相關(guān)。因此，擬南芥花器官的發(fā)育是受SEP類基因與A、B、C類基因的共同調(diào)控。SEP類轉(zhuǎn)錄因子不僅能夠與B、C類蛋白共同作用，調(diào)控第三和第四輪花器官的發(fā)育，還能夠與D類基因編碼蛋白相互作用，調(diào)控胚珠的發(fā)育［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，sep 1、sep 2、sep 3 三重突變體具有和stk、shp 1、shp 2三突變體類似的胚珠結(jié)構(gòu)，此外，STK和SHP等C類基因編碼蛋白都可能和SEP－3－蛋白形成聚合體，這表明SEP 與D類基因共同決定胚珠的發(fā)育［3，5］。除了在擬南芥中的作用外，在其它植物中也發(fā)現(xiàn)SEP類基因在花發(fā)育的功能。

蓮瓣蘭（Cymbidium tortisepalum）是中國春蘭的一個新品系，大雪素為滇蘭四大名品之首，寬葉蓮瓣素白花素心品種，并且于春節(jié)期間開花［6］，俗稱大素心，已有數(shù)百年的栽培歷史，原產(chǎn)于滇西的部分地區(qū)［6］。本研究以蓮瓣蘭大雪素為實驗材料，用RACE方法快速地克隆全長cDNA，從花的器官材料中分離開花相關(guān)SEP 1基因并進行克隆。通過對蓮瓣蘭大雪素SEP 1基因的初步研究，了解SEP 1基因是植物花器官調(diào)控途徑的一個重要因子。

1 材料與方法

1．1 材 料

1）所采用材料為蓮瓣蘭大雪素（Cymbidium tortisepalum），是中國蘭花中的優(yōu)秀品種，也是滇蘭蓮瓣蘭中的一顆明珠，是蓮瓣蘭代表品種。它盛開在元旦春節(jié)花，它的花枝高挺出架，潔白的花朵顯得格外清雅、素凈，具有暗香［9］。

2）必要培養(yǎng)液的配置。200 m L LB培養(yǎng)液的配制：2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、1 g NaCl（p H＝7），若配制固體培養(yǎng)基則加3 g瓊脂。

3）實驗設(shè)備。計算機、PCR儀、電泳槽、離心機、振蕩床、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、滅菌鍋、烘箱、移液設(shè)備、容器、刮子等。

1．2 方 法

1．2．1 RNA的提取

選用 TransZol Plant（TransGen Biotech，Beijing，code＃ET 121－01）提取大雪素花器官的RNA，嚴格按照試劑盒進行。

1．2．2 特異性引物設(shè)計

3′－RACE CDC Primer：5－AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC（T）30 VN－3

SEP－F 5－TTGAAAAGAGAGTAAGAGATGGGA－3

SEP－R 5－AACTTCTGATTTGCCCCCC－3

1．2．3 cDNA的合成

按SMART RACE c DNA Amplication Kit操作流程進行。3’SMART－RACE PCR加入以下試劑于滅菌的PCR反應(yīng)管中：Total RNA，2μg；10×Advantage PCR Buffer，5μL；d NTP mix（10 mmol／L），4μL；Primers（10μmol／L），各0．75μL；Advantage 2 Polymerase Mix，2μL；dd H2O 17．75μL?；旌弦陨显噭虝弘x心，將反應(yīng)管放在預(yù)熱的PCR儀上，按下列程序進行循環(huán)：35的循環(huán)；94℃×3 min 30 s，94℃×20 s，58℃×30 s，72℃×1 min，72℃×7 min，4℃×∞循環(huán)結(jié)束后，取3μL樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測合成情況。

1．2．4 電泳檢測，割膠回收目的片段

取5μL的PCR產(chǎn)物進行克隆，克隆方法參照文獻［7］，隨機篩選白色菌落，送北京華大基因公司進行測序。

1．2．5 SEP 1基因的表達

選用 TransZol Plant（TransGen Biotech，Beijing，code＃ET 121－01）分別提取苞葉、花萼、花瓣，合蕊柱以及授粉后3天的合蕊柱的RNA，然后進行cDNA的合成。選用特異引物進行RT－PCR．，其引物序列如下：

SEP－F 5－ACGCATGTTGTAGGATACG－3

SEP－R 5－AACTTCTGATTTGCCCCCC－3

PCR反應(yīng)條件與克隆該基因一樣，反應(yīng)終止取5止的PCR產(chǎn)物，用1．0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 RACE的結(jié)果

圖1 SEP 1基因全長電泳結(jié)果

用轉(zhuǎn)錄組測序方法獲得了SEP 1基因的序列，在NCBI http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／database 中 進行功能預(yù)測是SEP 1 5′片段序列。為了進一步研究這些基因的功能及表達特性，克隆了全長序列cDNA。對瓣蘭大雪素不同發(fā)育時期的花原基、花蕾以及合蕊柱混合樣品進行Total RNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳方法監(jiān)測RNA的質(zhì)量；以Total RNA為模板，按照RACE試劑盒的說明進行反轉(zhuǎn)錄后得到3′端和5′端cDNA模板，對3′端的cDNA模板進行特異引物和Outprimer進行PCR擴增，獲得3′端片段，5′端與3′端的序列進行拼接，再一次進行全長cDNA的克隆，對菌液PCR進行擴增，見圖1。

2．2 序列比對

通過測序獲得了功能預(yù)測為SEP 1基因的全長cDNA。這個基因cDNA全長為1 047 bp，包含有編碼框，207 bp的5′UTR和87 bp 3′UTR 的非翻譯區(qū)，并具有olig（d T）的尾巴，具有完整的開放閱讀框 （ORF）753 bp，編碼250氨基酸的蛋白質(zhì)，該基因序列從起始密碼子ATG，如圖2。從蓮瓣蘭大雪素中分離出來的SEP 1基因，是屬于MADS－box基因。

2．3 SEP 1基因在各個花器官的表達

從圖3可以看出，SEP 1基因除了授粉前合蕊柱和授粉后3 d合蕊柱，在其他各個花器官中都沒有表達，包括包裹在花序外面的苞葉，而在授粉前的合蕊柱中表達量最高。

圖2 SEP 1基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列

圖3 SEP 1基因在各個花器官的表達

3 討 論

本實驗以蓮瓣蘭大雪素為材料分離出SEP 1基因，通過RACE方法快速克隆出全長cDNA，確定該基因為1 047 bp的全長cDNA序列，編碼250個氨基酸。獲得的序列及其推導的氨基酸序列在NCBI上進行Blastx分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)含有典型的MADS結(jié)構(gòu)域（MADS－MEF 2－like）和 K結(jié)構(gòu)域，這兩個保守結(jié)構(gòu)域是MADS－box基因家族的典型特征，具有高度的保守性，與MADS－box家族中從其他植物提取出的SEP 1基因的同源性很高［3］。MADS－box 結(jié)構(gòu)域在MADS－box蛋白因子的N末端，大約有60個氨基酸組成具有高度保守結(jié)構(gòu)域，可以和特異DNA結(jié)合［4］，因此，MADS－box 結(jié)構(gòu)域具有 DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)二聚化的功能［5］。

SEP類基因?qū)儆贓類基因，在擬南芥中已研究得比較清楚。用RACE方法從蝴蝶蘭花葶和春蘭中克隆并己經(jīng)證明SEP基因參與花器官發(fā)育和植物開花的調(diào)控［8］。而從蓮瓣蘭大雪素中還沒有研究過，本研究結(jié)果顯示，該序列還與其他植物上克隆出來的SEP 1基因有很高的同源性［9］。在表達模式上，SEP 1在四輪中花器官中都表達，這與高等真雙子植物中分離出來的SEP 1不一致，這也許與蘭科比較復(fù)雜的花器官結(jié)構(gòu)有關(guān)系，將為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)，并且了解SEP 1在蓮瓣蘭大雪素中的調(diào)控。

雖然對花發(fā)育相關(guān)基因的研究已經(jīng)有幾十年，但是對于SEP基因功能的研究仍然存在著很多問題，在蘭花上的研究更少見，并且蘭花SEP 1基因的克隆以及SEP 1與開花相關(guān)基因、蛋白的作用關(guān)系還有待進一步研究，另外，SEP 1基因可以誘導開花，但其分子機制和在蓮瓣蘭花中的調(diào)控機制還有待研究。

［1］馬輝，張智俊，羅淑萍．植物 MADS－box 基因研究進展［J］．生物技術(shù)通報，2006（6）：14－18．

［2］Coen ES，Meyerowitz EM．The war of whorls：Genetic interactions controlling flower development［J］．Nature，1991，353：31－37．

［3］Theissen G．Development of floral organ identity：stories from the MADS house［J］．Current Opinion in Plant Biology，2001，4：75－85．

［4］叢楠，程治軍，萬建民．控制花器官發(fā)育的ABCDE模型［J］．中國農(nóng)學通報，2007，23（7）：124－127．

［5］Ditta G，Pinyopich A，Robles P，et al．The SEP 4 gene of Arabidopsis thaliana functions in floral organ and meristem identity［J］．Curr Biol，2004，14：1 935－1 940．

［6］陳貴．云南名蘭大、小雪素［J］．中國花卉園藝，2001，17：45．

［7］趙銀河，彭晟，周平，等．蓮瓣蘭大雪素SOC 1基因克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析［J］．種子，2015，34（5）：1－5．

［8］袁秀云，蔣素華，田云芳，等．1個蘭花 MADS－box 基因的克隆與表達分析［J］．河南農(nóng)業(yè)大學學報，2013，47（6）：683－691．

［9］張則婷，李學寶．MADS－box 基因在植物發(fā)育中的功能［J］．華中師范大學植物生理學通訊，2007，43（2）：198－202．