miRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用

陳軍寶 綜述 肖 苒 曹 誼 林審校

·綜述·

miRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用

陳軍寶 綜述 肖 苒 曹 誼 林審校

間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景，尤其是在骨組織工程中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化機(jī)制復(fù)雜，受到多方面因素的影響，不同種類的miRNA可分別參與抑制或促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，在其分化過程中具有核心作用。本文對不同作用的miRNA進(jìn)行歸類和總結(jié)，期待為未來的研究提供思路。

間充質(zhì)干細(xì)胞微小核糖核酸成骨分化信號通路

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）作為干細(xì)胞家族的重要成員，可分離自骨髓、脂肪、骨骼肌、滑膜、臍帶及臍帶血等組織，因其具有多向分化、自我復(fù)制、造血支持、免疫調(diào)控等特點(diǎn)，在干細(xì)胞治療、基因治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值[1-2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞的各種生物學(xué)功能，尤其是在MSCs成骨分化與成熟過程中的作用日益受到重視[3]。本文就miRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行綜述。

1 miRNA簡介

miRNA是一類長度為20～24 bp的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于動植物、真菌等各類生物體內(nèi)，主要通過調(diào)控基因表達(dá)參與多種病理生理過程。1993年，Lee等[4]在研究秀麗隱桿線蟲突變表型時首次發(fā)現(xiàn)miRNA，迄今已發(fā)現(xiàn)了千余種miRNA，現(xiàn)已明確其參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝、氧化應(yīng)激等[5]。

2 miRNA與MSCs的成骨分化的關(guān)系

miRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中具有核心作用，通過對信號通路中不同水平的關(guān)鍵分子的調(diào)節(jié)，構(gòu)成間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而達(dá)到對干細(xì)胞成骨的精確調(diào)控。Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)，在用抗壞血酸（50 μg/mL）誘導(dǎo)的大鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞系和MLO-A5成骨前體細(xì)胞系成骨分化過程中，MC3T3-E1成骨細(xì)胞系中有51種miRNA的表達(dá)量發(fā)生顯著改變，其中有31種miRNA的表達(dá)減少；在MLO-A5成骨前體細(xì)胞系中有20種miRNA的表達(dá)量發(fā)生顯著改變，其中有6種miRNA的表達(dá)減少。研究證實(shí)了不同種類的miRNA可通過其靶基因作用于經(jīng)典Wnt信號通路，而調(diào)控MSCs的成骨分化。Wang等[7]將置于PHBHHx帶溝槽材料上的大鼠骨髓來源的MSCs細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，與在滑面PHBHHx材料上培養(yǎng)的MSCs相比較，分析miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有18種miRNA出現(xiàn)差異性的表達(dá)，其中14種miRNA的表達(dá)量明顯上調(diào)（包括miR-140，miR-210，miR-214等），4種miRNA表達(dá)明顯下調(diào)（包括let-7a，let-7i，miR-146a，miR-196a），進(jìn)一步將差異性表達(dá)的miRNAs與其靶基因的作用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MSCs成骨分化成熟主要與MAPK、Smad信號通路相關(guān)，其中miR-93、miR-214、miR-324-3p、miR-503、miR-674-5p通過其相應(yīng)的作用靶點(diǎn)調(diào)控MAPK信號通路，而miR-93、miR-503、miR-140、miR-298、miR-146a、miR-351則主要調(diào)控Smad信號通路。miRNA在MSCs成骨細(xì)胞分化過程中的調(diào)控信號網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，是研究的難點(diǎn)。

3 MSCs成骨分化的影響因素

MSCs的成骨分化成熟過程受多種因素的影響，包括種子細(xì)胞的來源、分離純化方式、誘導(dǎo)分化策略、血管化進(jìn)程等[8]。Guillot等[9]對胎兒骨髓、外周血、肝臟3種不同組織來源的MSCs的分化能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs成骨分化能力最強(qiáng)，肝臟來源的MSCs成骨分化能力最弱。其他因素，如細(xì)胞生長的微環(huán)境、支架材料、生物力學(xué)信號等，也會對MSCs的成骨分化成熟產(chǎn)生影響。

4 miRNA在MSCs的成骨分化過程中的作用

miRNA通過與靶基因mRNA的相互作用來調(diào)節(jié)MSCs成骨分化過程中的轉(zhuǎn)錄因子、信號分子及其相對應(yīng)的受體的功能。不同種類的miRNA可分別參與調(diào)節(jié)TGF-β、MAPK、PI3K、Wnt、Notch等多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控MSCs的分化及成熟[10]。

4.1 促進(jìn)成骨分化

Zhou等[11]用伊班磷酸鹽處理牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞，其miRNA-18a的表達(dá)量明顯升高，提示miRNA-18a可能參與伊班磷酸鹽誘導(dǎo)的牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，來源于牙周炎患者的牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力明顯降低，其機(jī)制是炎癥因子IL-1β和TNF-α可上調(diào)Smurfl的表達(dá)水平，而Smuffl可負(fù)性調(diào)控MSCs的成骨分化，miRNA-17能通過抑制Smuffl的表達(dá)，從而促進(jìn)牙周膜中MSCs的成骨分化。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中，miRNA-22及其靶基因HDAC6是MSCs向成骨分化的重要調(diào)節(jié)因子，高表達(dá)的miRNA-22通過抑制HDAC6的水平，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，同時還可抑制脂肪組織的形成。Li等[14]發(fā)現(xiàn)miRNA-26a能促進(jìn)VEGF的分泌，調(diào)節(jié)骨髓來源的MSCs的成骨分化和血管形成過程，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在骨骼缺損的周圍組織中miRNA-26a的表達(dá)水平增高，骨組織的再生能力和血管化能力明顯增強(qiáng)。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在間充質(zhì)干細(xì)胞系hFOBl.19細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中，miRNA-27的表達(dá)量在其分化的第12小時開始增加，在分化的第72小時明顯增加，和對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，他們還證實(shí)miRNA-27的水平與β-連環(huán)蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，β-連環(huán)蛋白可與結(jié)腸腺瘤性息肉?。ˋdenomatous polyposis coli，APC）蛋白形成復(fù)合物而發(fā)生降解，miRNA-27可直接抑制APC基因的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)信號分子β-連環(huán)蛋白的降解，最后細(xì)胞內(nèi)不斷累積的β-連環(huán)蛋白可激活經(jīng)典Wnt信號通路，促進(jìn)hFOBl.19細(xì)胞向成骨分化成熟。Hu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，hFOBl.19細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中，miRNA-142-3p表達(dá)增多，抑制miRNA-142-3p的表達(dá)則對hFOBl.19細(xì)胞的成骨分化有抑制作用，其機(jī)制也可能與miRNA-142-3p抑制APC基因的蛋白表達(dá)，激活Wnt信號通路有關(guān)。Suh等[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b促進(jìn)hMSCs的成骨分化成熟，還干擾成骨分化的負(fù)向調(diào)控基因（如：HDAC4、CTNNBIP1、DUSP2等），而間接促進(jìn)骨的生成，這些基因可分別通過Smads、ERK、Wnt等信號通路，影響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。Hassan等[18]發(fā)現(xiàn)，miRNA-218能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞，其機(jī)制是miRNA-218能夠抑制DKK2、SFRP2、SOST等Wnt信號通路的負(fù)性調(diào)控因子，間接激活Wnt信號通路。因此，miRNA-218與Wnt信號通路形成的正反饋可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。Bhushan等[19]將骨形態(tài)生成蛋白-2/6（BMP2/6）誘導(dǎo)小鼠C2C12和MC3T3細(xì)胞成骨分化，在細(xì)胞分化24 h后，可檢測到miRNA-181a表達(dá)量明顯增加，發(fā)現(xiàn)miR-181a可直接作用于Tgfbi和TβR-I靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)TGF-β和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)C2C12和MC3T3細(xì)胞的成骨分化進(jìn)程。

4.2 抑制成骨分化

Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-17家族成員（主要是miRNA-17-5p和miRNA-106a）可抑制脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hADSCs）向成骨分化，但可促進(jìn)其向脂肪組織的分化成熟。發(fā)現(xiàn)hADSCs在向成骨細(xì)胞分化的過程中，BMP-2、TAZ和MSX2的mRNA表達(dá)水平在分化的第4天達(dá)到峰值，然后逐漸降低。BMP2（TGFβ/BMPs信號通路成員）作為miRNA-17-5p和miRNA-106a的作用靶點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)骨的發(fā)生、骨骼形成和骨折愈合，miRNA-17-5p和/或miRNA-106a可抑制BMP2的表達(dá)水平，干預(yù)hADSCs的成骨分化。Zeng等[21]證實(shí)，在hADSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中，抑制miRNA-100的功能可增加BMPR2的表達(dá)，其機(jī)制是BMPs與BMPR2的結(jié)合后可激活BMPR1，進(jìn)而使胞內(nèi)的Smads信號分子發(fā)生磷酸化，抑制成骨細(xì)胞的分化成熟。Wei等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34家族成員（miRNA-34b和miRNA-34c）可以通過抑制核基質(zhì)蛋白SATB2的表達(dá)，從而抑制小鼠成骨細(xì)胞的分化成熟，并且能通過減少CDK4、CDK6和CyclinD1的蛋白積累，抑制成骨細(xì)胞的增殖。Yang等[23]證實(shí)，在小鼠原代成骨細(xì)胞的體外礦化過程中，miRNA-93的表達(dá)量明顯降低，miRNA-93的靶基因直接作用位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄因子Sp7的編碼區(qū)內(nèi)。他們發(fā)現(xiàn)，Sp7作為成骨細(xì)胞礦化過程的關(guān)鍵分子，高表達(dá)的Sp7可以與miRNA-93的啟動子區(qū)結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄，從而抑制成骨細(xì)胞的礦化進(jìn)程。Mizuno等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在BMP4誘導(dǎo)的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（ST2細(xì)胞）向成骨細(xì)胞分化的過程中，ST2細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的miRNA-125b可直接作用于其靶基因ErbB2，在ST2細(xì)胞分化的早期抑制細(xì)胞的增殖和成骨分化。Eskildsen等[25]證實(shí)，miRNA-138可通過抑制FAK蛋白表達(dá)來調(diào)節(jié)人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，過度表達(dá)的miRNA-138使FAK蛋白的磷酸化減弱，影響FAK下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)；破壞miRNA-138的功能后，F(xiàn)AK蛋白的磷酸化增強(qiáng)，可激活其下游的ERK1/2信號通路，使Runx2發(fā)生磷酸化，增強(qiáng)Osterix的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。TNF-α可通過上調(diào)miR-155的表達(dá)，以抑制BMP-2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化，TNF-α可能通過激活SAPK/JNK信號通路抑制BMP-2誘導(dǎo)的成骨分化[26]。Tome等[27]證實(shí)，高表達(dá)的miRNA-335可破壞間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化，且Wnt3a信號可以正向調(diào)節(jié)miR-335的表達(dá)，從而抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和增殖；IFN-γ的作用與Wnt3a相反，可以負(fù)向調(diào)節(jié)miRNA-335的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化成熟。研究發(fā)現(xiàn)，ERRγ可促進(jìn)miRNA-433在小鼠骨源性間充質(zhì)干細(xì)胞譜系C3H10T1/2細(xì)胞中的表達(dá)，而在BMP-2誘導(dǎo)的細(xì)胞成骨分化過程中，ERRγ和miR-433的表達(dá)量均減少。此外，在C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的過程中，高表達(dá)的ERRγ和miR-433可抑制成骨分化標(biāo)志基因Runx2和ALP的表達(dá)，說明miR-433可負(fù)向調(diào)控C3H10T1/2細(xì)胞的成骨分化成熟[28]。

5 展望

間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程成骨種子細(xì)胞的重要來源，在骨缺損修復(fù)與再造領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。miRNA作為調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及成熟過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明，miRNA靶基因的功能特異性、miRNA之間的相互作用，以及環(huán)境因素的作用影響等，是未來研究的重點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化機(jī)制會不斷被闡明，從而為骨組織工程提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Role of MicroRNA in the Process of Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells

CHEN Junbao1,XIAO Ran2,CAO Yilin2.1 The Fifth Department;2 Research Center,Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.Corresponding author:CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com).

Mesenchymal stem cells;MicroRNA;Osteogenic differentiation;Signal pathway

Q813.1+1

B

1673－0364（2016）06－0375－03

2016年3月12日；

2016年5月5日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.013

100144北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院整形五科（陳軍寶）；100144北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心（肖苒，曹誼林）。

曹誼林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。

【Summary】Mesenchymal stem cells have great application prospects in tissue engineering and regenerative medicine as seed cells,especially have evoked the extensive attention in the application of bone tissue engineering.Mechanisms of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells are complicated.It is affected by various factors.Different kinds of miRNA can inhibit or promote the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells respectively,it plays a key role in the differentiation process.In this paper,miRNA in different roles was classified and summarized,expecting to provide ideas for future research.