帶魚酶解蛋白亞鐵螯合肽對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)生長、免疫及品質(zhì)的影響*

梁營芳 林慧敏 石蕓潔 鄧尚貴

(浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 舟山 316022)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是世界主要養(yǎng)殖對蝦之一, 也是中國主要對蝦養(yǎng)殖品種。在集約化養(yǎng)殖過程中, 傳染性疾病的暴發(fā)是制約對蝦養(yǎng)殖效益的主要因素(Karthikeyan et al, 2015; Lin et al,2015)。藥物防病有一定的優(yōu)勢, 但藥物殘留及病原菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的增加制約了藥物的使用, 通過添加提高免疫機(jī)能的生物活性物質(zhì)是營養(yǎng)飼料學(xué)的重要研究方向和熱點(diǎn)。有關(guān)提高養(yǎng)殖對蝦的免疫研究, 現(xiàn)有報(bào)道集中在微量元素如維生素(Lee et al, 2004)、活性物質(zhì)如多糖(Wang et al, 2008; Yudiati et al, 2016)以及中草藥(Sha et al, 2016)等免疫添加劑對免疫相關(guān)指標(biāo)的影響。

蛋白水解肽能夠與生物體內(nèi)的必需微量金屬元素相結(jié)合, 從而形成蛋白肽-金屬的配合物, 該配合物在提高機(jī)體繁殖和生長能力、提高抗病免疫力, 以及對生理代謝的調(diào)節(jié)等方面具有不可替代的作用(Ashmead et al, 1989)。Lin 等(2014)以帶魚(Trichiurus lepturus)為原料, 經(jīng)過復(fù)合酶解和金屬螯合方法, 制備了帶魚酶解蛋白的亞鐵螯合物[Fe(II)-FPH], 實(shí)驗(yàn)表明該物質(zhì)具有較強(qiáng)的清除自由基以及體外抗氧化活性。研究還發(fā)現(xiàn)帶魚酶解蛋白亞鐵合物對小鼠有抗貧血、抗疲勞、增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力的功效(Huang et al, 2015; Lin et al, 2016), 實(shí)驗(yàn)還證明帶魚酶解蛋白亞鐵合物是相對安全的產(chǎn)品(Li et al, 2016)。目前, 關(guān)于金屬-水解肽螯合物對于凡納濱對蝦的生長和非特異性免疫、品質(zhì)影響方面的成果尚未見報(bào)道。

本研究在制備Fe(II)-FPH基礎(chǔ)上, 在養(yǎng)殖對蝦飼料中添加 Fe(II)-FPH, 對養(yǎng)殖凡納濱對蝦的生長指標(biāo)(特定增長率, 存活率, 增重率和出肉率)、免疫指標(biāo)(血清和肝胰腺組織中非特異性免疫因子 LZM 和AKP活性)及質(zhì)構(gòu)指標(biāo)(肌肉硬度、彈性、耐咀性)加以測定, 重點(diǎn)探討Fe(II)-FPH對養(yǎng)殖對蝦生長性能、非特異性免疫及品質(zhì)的影響。以期為Fe(II)-FPH在養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物免疫力調(diào)節(jié)和品質(zhì)提高中的應(yīng)用提供資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

帶魚魚糜由浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司提供。用鋸子將冷凍魚糜分裝成 100—200g/袋, 置于-20℃冰箱中保存, 使用前一晚放至 4℃冷藏室中緩慢解凍。木瓜蛋白酶(papain, 酶活力 20000IU/g), 購自上海金穗生物科技有限公司, LZM、AKP試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 Fe(II)-FPH制備

取解凍后的帶魚魚糜約50g, 置于500mL去離子水中融化, 調(diào)節(jié)混合漿液的 pH 至 6.5±0.1, 于35—40℃下保溫 10min后加入木瓜蛋白酶(按20000U/g比例), 45℃水浴、磁力攪拌酶解8h (控制酶解液 pH在 6.5左右)。于 95℃的水浴中加熱 10min用來鈍化木瓜蛋白酶, 將所得水解產(chǎn)物以 5000r/min轉(zhuǎn)速離心20min, 所得的中間清液即為FPH。將FPH溶液用 NaOH 溶液(1.0mol/L)調(diào)節(jié)至 pH=7.0, 添加1mol/L的FeCl2溶液(按體積的1.0%, 同時(shí)加0.1% Vc保護(hù)), 于 30℃的水浴進(jìn)行振蕩 30min, 并于10000r/min離心 15min, 將所得上清液采用實(shí)驗(yàn)室的納濾膜分離設(shè)備截留 1000—5000Da分子量的部分,經(jīng)冷凍干燥后得灰白色粉末狀物質(zhì)即為帶魚酶解蛋白亞鐵螯合肽(記為Fe(II)-FPH)。

1.3 對蝦飼料的制備及其組成

基礎(chǔ)配料為: 35.0%魚粉, 10.0%玉米粉, 15.0%小麥粉, 28.0%豆粕, 2.5%大豆油, 2.5%魚油, 以及5.0%復(fù)合維生素和符合礦物質(zhì)元素, 2.0%羧甲基纖維素鈉。測定結(jié)果表明基礎(chǔ)飼料營養(yǎng)水平: 粗脂肪為6.0%,粗蛋白為 26.5%, 碳水化合物為 40.0%, 粗灰分為8.0%。對上述組分加以粉碎至 60目并均勻混合, 添加0, 500, 1000, 1500, 2000以及2500mg/kg的帶魚酶解蛋白亞鐵螯合肽, 加少許水均勻攪拌。用雙螺桿壓條機(jī), 制成顆粒飼料(直徑為1.5—2.0mm), 于55℃熟化烘干2h, 室溫晾干后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和管理

實(shí)驗(yàn)對蝦由舟山海洋研究所蝦苗場提供, 挑選規(guī)格整齊(8.5±0.3)cm、質(zhì)量(0.92±0.01)g、活力好的健康活潑的凡納濱蝦960尾隨機(jī)分為6組, 每個(gè)飼料組設(shè)置4組重復(fù), 每組重復(fù)飼養(yǎng)40對尾, 在試驗(yàn)場內(nèi)馴養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。在56d實(shí)驗(yàn)期間, 每天3次喂料, 時(shí)間分別在8:30、14:30和20:30, 根據(jù)對蝦的攝食情況來調(diào)節(jié)投喂率, 日投喂率為對蝦體質(zhì)量的10%—20%。實(shí)驗(yàn)養(yǎng)蝦用水采用循環(huán)過濾水系統(tǒng), 期間保持充氧, 控制水體pH 7.8—8.0、溫度25±0.2℃鹽度為 5.2 左右, NH4+水平低于 0.005mg/L, 溶解氧高于6.0mg/L。

試驗(yàn)分組: 第 1組對照組: 基礎(chǔ)飼料飼喂; 第2—6組到為 Fe(II)-FPH 飼喂組: 分別以添加 500、1000、1500、2000、2500mg/kg的Fe(II)-FPH基礎(chǔ)飼料飼喂。

1.5 對蝦生長指標(biāo)的測定及公式

于飼養(yǎng)試驗(yàn)第0、28和 56天, 將各箱內(nèi)的對蝦分別計(jì)數(shù)并稱重, 計(jì)算成活率、增重率、特定增長率和出肉率()。

計(jì)算公式為:

成活率(%) = 成活對蝦尾數(shù)/實(shí)驗(yàn)初投放的對蝦尾數(shù)×100%。

特定增長率(%/d) = ln(試驗(yàn)?zāi)┢趯ξr重量/試驗(yàn)初期對蝦重量)/飼養(yǎng)天數(shù)×100%。

增重率(%) = (試驗(yàn)?zāi)┢趯ξr重量－試驗(yàn)初期對蝦重量)/試驗(yàn)初期對蝦體重量×100%。

出肉率(%) = 對蝦肌肉重量/對蝦整體重量×100%。

1.6 對蝦生化成分的測定

將待測樣品稱重, 置培養(yǎng)皿中, 于 65℃下烘干,置于 105℃烘箱內(nèi)烘至恒重, 稱重, 并計(jì)算其干物質(zhì)的含量。對蝦灰分含量采用GB 5009.4-2010《食品中灰分的測定》測定; 粗脂肪含量使用全自動(dòng)索氏抽提儀測定; 粗蛋白含量使用全自動(dòng)凱氏定氮儀測定。

1.7 對蝦非特性免疫指標(biāo)測定

血清和肝胰腺中LZM、AKP參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書。所制備樣品均在12h內(nèi)完成測定。

1.8 質(zhì)構(gòu)分析

對蝦的硬度、彈性和耐咀性的測定采用美國TMSPRO物性分析儀。質(zhì)構(gòu)剖面分析(texture profile analysis,TPA)特性檢測參數(shù)為: 平底柱形探頭 P/50 (直徑50mm); 選取距離頭部3 cm處背部的肌肉組織為測定部位; 測試速度為1mm/s, 樣品的壓縮形變量25.0%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe(II)-FPH對對蝦生長性能的影響

Fe(II)-FPH飼喂對凡納濱對蝦的成活率、增重率、特定生長率和出肉率的影響見表1。由表1可知, 飼喂至第28天, 添加0、500和1000mg/kg的Fe(II)-FPH對對蝦的基本生長性能沒有顯著影響(P＞0.05); 隨著Fe(II)-FPH 濃度增加(1500—2500mg/kg), Fe(II)-FPH對對蝦的生長表現(xiàn)出顯著促進(jìn)作用(P＜0.05)。與空白組相比較, 1500—2500mg/kg的Fe(II)-FPH提高對蝦成活率(3.98%—4.13%)、增重率(5.43%—5.84%)和特定生長率(0.22%—0.39%/d)。飼喂至第 56天,500mg/kg Fe(II)-FPH對對蝦的成活率(5.23%)有顯著提高(P＜0.05), 但對其增重率、特定生長率及出肉率影響不顯著(P＞0.05); 添加 1000—2500mg/kg Fe(II)-FPH顯著提高對蝦成活率(8.03%—9.09%)、增重率(5.89%—8.72%)、特定生長率(0.41%d—0.49%/d)和出肉率(1.60%—2.05%) (P＜0.05)。

大量研究表明, 多種不同來源的(分子量較小)水解肽, 通過N端氨基、C端羧基及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)與金屬元素形成的配合物, 體內(nèi)外穩(wěn)定性更佳(Kurzaket al, 2004; Buglyóet al, 2007), 同時(shí)表現(xiàn)出較為特殊的生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和生理活性, 例如: 激素樣活性,抗菌活性, 酶抑制, 免疫和生理調(diào)節(jié)功能等(Fisheret al, 2005; Megíaset al, 2008)。本實(shí)驗(yàn)制備的 Fe(II)-FPH飼喂對蝦, 對其生長性能的影響機(jī)制極有可能為: 攝入體內(nèi)的Fe(II)-FPH可以通過增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力, 從而起到改善其生長活力的效果。

表1 飼喂Fe(II)-FPH對對蝦生長性能的影響Tab.1 Growth performance of L. vannamei fed with Fe(II)-FPH

2.2 Fe(II)-FPH對實(shí)驗(yàn)對蝦的生化特性影響

由表2可知, 飼喂開始時(shí), 空白組的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量依次為43.52%、69.95%、5.22%及 15.75%。添加 500—1500mg/kg Fe(II)-FPH對對蝦的粗蛋白和粗脂肪含量影響不顯著(P＞0.05),2000mg/kg和2500mg/kg的Fe(II)-FPH對粗蛋白和粗脂肪含量的提高分別為 0.62%—0.92%和 0.14%—0.17%, 與空白組相比為顯著性差異(P＜0.05)。1000—2500mg/kg Fe(II)-FPH飼喂效果對干物質(zhì)及灰分含量的影響顯著(P＜0.05)。由此可知, 在 Fe(II)-FPH的添加量為2000mg/kg和2500mg/kg時(shí), 對于飼喂對蝦的基本生化特性指標(biāo)有顯著的提高作用。

表2 飼喂Fe(II)-FPH對對蝦成分的影響Tab.2 Composition change of L. vannamei fed with Fe(II)-FPH

2.3 Fe(II)-FPH對對蝦LZM活性的影響

對蝦血細(xì)胞吞噬異物后會(huì)分泌一些堿性蛋白質(zhì), 可以切斷細(xì)菌肽聚糖中的 β-1,4糖苷鍵從而破壞細(xì)胞壁的支架, 導(dǎo)致細(xì)胞脹裂而死亡。這些堿性蛋白質(zhì)即溶菌酶(LZM), LZM廣泛存在于蝦體體血清及其他組織液中, 是對蝦非特異性免疫系統(tǒng)的主要成分(Bon?inaet al, 2008), 健康對蝦血清中LZM溶菌活力較強(qiáng), 而瀕臨死亡的對蝦其溶菌活力基本喪失, 因此可以將LZM活力作為檢測蝦體的免疫狀態(tài)的參照指標(biāo)(Liuet al, 2015)。Fe(II)-FPH飼喂對對蝦血清、肝胰腺組織中LZM活性影響, 見表3?？瞻捉M對蝦血清和肝胰腺中, LZM 活性為 421.0—421.4U/mL 和 46.7—48.3U/mL。飼喂第 28天,1500—2500mg/kg Fe(II)-FPH對于對蝦血清和肝胰腺中 LZM 活性有顯著提高(P＜0.05), 分別達(dá) 457.8—458.3U/mL和52.0—52.8U/mL。飼喂第56天, 1000—2500mg/kg Fe(II)-FPH對對蝦LZM活性表現(xiàn)出了顯著增強(qiáng)作用(P＜0.05)。

有研究表明, 生物體所必需的微量元素(如 Fe、Zn、Ca及Mn等), 可與小肽形成不同結(jié)構(gòu)的螯合物,這些螯合物形成后, 可有效抵御微量元素與其它物質(zhì)生成難以溶解的無機(jī)鹽(Ashmead, 2001), 減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失, 而且小肽類物質(zhì)也能夠增強(qiáng)其吸收利用的效率。從本文結(jié)果來看, 當(dāng)Fe(II)-FPH的添加量為1500—2500mg/kg時(shí), 對對蝦的血清及肝胰腺組織中的LZM活性有著顯著的提高作用。因此在對蝦的基礎(chǔ)飼料添加 Fe(II)-FPH有利于養(yǎng)殖對蝦提高機(jī)體的非特異性免疫能力, 進(jìn)而可以抵抗環(huán)境污染物、病原體侵染, 提高存活率。

2.4 Fe(II)-FPH對對蝦AKP活性的影響

AKP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶, 在體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移與代謝, 是參與動(dòng)物體內(nèi)免疫活動(dòng)重要的水解酶類(Pipe, 1990)。Fe(II)-FPH飼喂對對蝦血清、肝胰腺組織中AKP活性影響, 見表4。對于對蝦血清, 2000—2500mg/kg Fe(II)-FPH可顯著增強(qiáng) AKP 活力(P＜0.05); 對于對蝦肝胰腺組織,1500—2500mg/kg Fe(II)-FPH即可起到顯著提高AKP活力的作用(P＜0.05)。

表3 飼喂Fe(II)-FPH對對蝦LZM活性的影響Tab.3 LZM activity of L. vannamei fed with Fe(II)-FPH

表4 飼喂Fe(II)-FPH對對蝦AKP活性的影響Tab.4 AKP activity of L. vannamei fed with Fe(II)-FPH

2.5 Fe(II)-FPH對對蝦質(zhì)構(gòu)的影響

硬度和彈性是用臼齒第一下咬住樣品所施的力,以及被咬樣品恢復(fù)至原來狀態(tài)的程度, 這兩者作為關(guān)鍵指標(biāo), 一般決定著消費(fèi)者對水產(chǎn)品的接受程度。在飼料中添加 Fe(II)-FPH對養(yǎng)殖凡納濱對蝦的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)產(chǎn)生的影響, 見圖 1。由圖可知, 隨飼料中Fe(II)-FPH添加量的增加, 各項(xiàng)指標(biāo)均隨 Fe(II)-FPH添加比例的增加而升高。添加 Fe(II)-FPH量在500—1500mg/kg時(shí)對肌肉硬度、彈性、耐咀性無顯著影響, 但當(dāng)添加2000—2500mg/kg時(shí)則顯著優(yōu)于對照組及500—1500mg/kg添加組(P＜0.05)。隨著飼料中Fe(II)-FPH添加比例的升高, 肌肉硬度升高的原因可能是由于蝦體攝入 Fe(II)逐漸增多, 蝦體肌肉肌纖維蛋白互相之間合力增強(qiáng), Fe(II)強(qiáng)化了內(nèi)部組織結(jié)構(gòu),因而彈性增強(qiáng), 硬度加大(Merkin et al, 2014)。

圖1 飼喂Fe(II)-FPH對對蝦質(zhì)構(gòu)的影響Fig.1 Sensible quality characteristics of L. vannamei fed with Fe(II)-FPH

3 結(jié)論

本研究在基礎(chǔ)對蝦飼料中, 添加了不同濃度帶魚蛋白水解肽-金屬配合物(Fe(II)-FPH), 考察了Fe(II)-FPH對對蝦的非特異性免疫增強(qiáng)效果和生長促進(jìn)作用。研究結(jié)果表明500mg/kg和1000mg/kg的較低濃度、28d的短時(shí)間飼喂 Fe(II)-FPH, 對凡納濱對蝦的機(jī)體生長性能和生化指標(biāo), 以及非特異性免疫酶活性的影響均無顯著差異(相比于空白對照組)(P＞0.05); 而2000mg/kg以上的高濃度及56d的較長時(shí)間飼喂 Fe(II)-FPH, 均在一定程度上提升了凡納濱對蝦的生化指標(biāo)、血清以及肝胰腺中的非特異性免疫酶活性(LZM和AKP)等, 究其原因, 作者認(rèn)為有可能利用小分子量酶解肽在機(jī)體內(nèi)的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收的機(jī)制, 將酶解肽和金屬螯合物一并吸收到特定的靶器官, 增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力, 也同時(shí)提高了生物體對脂肪、蛋白質(zhì)及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。同時(shí), 高濃度(≥2000mg/kg)、較長時(shí)間(56d)的 Fe(II)-FPH飼喂, 對蝦肌肉組織彈性影響較明顯,蝦體彈性加大, 水產(chǎn)品品質(zhì)增強(qiáng)。

Ashmead H D, 2001. The absorption and metabolism of iron amino acid chelate. Archivos Latinoamericanos De Nutrición, 51(1 Suppl 1): 13—21

Ashmead H H, Ashmead D H, Graff D J, 1989. Amino acid chelated compositions for delivery to specific biological tissue sites: U.S., 4863898. 1989-09-05

Bon?ina M, Re??i? J, Vlachy V, 2008. Solubility of lysozyme in polyethylene glycol-electrolyte mixtures: the depletion interaction and ion-specific effects. Biophysical Journal,95(3): 1285—1294

Buglyó P, Nagy E M, Farkas E et al, 2007. New insights into the metal ion-peptide hydroxamate interactions: metal complexes of primary hydroxamic acid derivatives of common dipeptides in aqueous solution. Polyhedron, 26(8):1625—1633

Fisher A E O, Naughton D P, 2005. Metal ion chelating peptides with superoxide dismutase activity. Biomedicine &Pharmacotherapy, 59(4): 158—162

Huang S B, Lin H M, Deng S G, 2015. Study of anti-fatigue effect in rats of ferrous chelates including hairtail protein hydrolysates. Nutrients, 7(12): 9860—9871

Karthikeyan V, Selvakumar P, Gopalakrishnan A, 2015. A novel report of fungal pathogen Aspergillus awamori causing black gill infection on Litopenaeus vannamei (pacific white shrimp). Aquaculture, 444: 36—40

Kurzak B, Wo?na A, Jezierska J et al, 2004. Copper(II)complexes of several monophosphono dipeptides: the role of phosphonic oxygen and thioether sulfur in complex stabilization. Polyhedron, 23(11): 1939—1946

Lee M H, Shiau S Y, 2004. Vitamin E requirements of juvenile grass shrimp, Penaeus monodon, and effects on non-specific immune responses. Fish & Shellfish Immunology, 16(4):475—485

Li Y J, Lin H M, Deng S G et al, 2016. Genotoxicity and acute oral toxicity of peptides ferrous chelates of hairtail protein.International Journal of Clinical and Experimental Medicine,9(2): 4047—4052

Lin H M, Deng S G, Huang S B, 2014. Antioxidant activities of ferrous-chelating peptides isolated from five types of low-value fish protein hydrolysates. Journal of Food Biochemistry, 38(6): 627—633

Lin H M, Deng S G, Huang S B et al, 2016. The effect of ferrous-chelating hairtail peptides on iron deficiency and intestinal flora in rats. Journal of the Science of Food and Agriculture, 96(8): 2839—2844

Lin Y C, Chen J C, Chen Y Y et al, 2015. Crowding of white shrimp Litopenaeus vananmei depresses their immunity to and resistance against Vibrio alginolyticus and white spot syndrome virus. Fish & Shellfish Immunology, 45(1):104—111

Liu H T, Wang J, Mao Y et al, 2015. Identification and expression analysis of a new invertebrate lysozyme in Kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus). Fish & Shellfish Immunology, 49: 336—343

Megías C, Pedroche J, Yust M M et al, 2008. Production of copper-chelating peptides after hydrolysis of sunflower proteins with pepsin and pancreatin. LWT-Food Science and Technology, 41(10): 1973—1977

Merkin G V, Stien L H, Pittman K et al, 2014. The effect of stunning methods and season on muscle texture hardness in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Journal of Food Science,79(6): E1137—E1141

Pipe R K, 1990. Hydrolytic enzymes associated with the granular haemocytes of the marine mussel Mytilus edulis. The Histochemical Journal, 22(11): 595—603

Sha Y J, Wang L, Liu M et al, 2016. Effects of lactic acid bacteria and the corresponding supernatant on the survival,growth performance, immune response and disease resistance of Litopenaeus vannamei. Aquaculture, 452:28—36

Wang Y C, Chang P S, Chen H Y, 2008. Differential time-series expression of immune-related genes of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei in response to dietary inclusion of β-1, 3-glucan. Fish & Shellfish Immunology, 24(1):113—121

Yudiati E, Isnansetyo A, Murwantoko et al, 2016. Innate immune-stimulating and immune genes up-regulating activities of three types of alginate from Sargassum siliquosum in Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei.Fish & Shellfish Immunology, 54: 46—53