深海鰹魚(Katsuwonus pelamis)眼窩油中DHA和EPA的提取及其抗抑郁活性研究*

李海波 呂倩倩 白 冬 王 歡 關(guān)麗萍 謝 超①

(1. 浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學(xué)院 舟山 316021; 2. 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 舟山 316022)

抑郁癥是主要的精神疾病之一, 它通常伴隨著某些相關(guān)的癥狀, 如: 定期的消極情緒, 減少體力活動, 產(chǎn)生無助感以及思想和認(rèn)知功能的遲鈍表現(xiàn)。在2000年, 它被世界衛(wèi)生組織列為第四大造成全球疾病負(fù)擔(dān)的主要原因, 并且可能到 2020年將成為第二大引發(fā)相關(guān)疾病障礙的原因(Lopez et al, 1998; Tian,2010)。當(dāng)前大約已有三分之二的抑郁癥患者采取了相關(guān)的治療措施, 但其體系完善的幅度仍舊很小。并且, 即便是目前已經(jīng)開發(fā)了許多有療效的抗抑郁藥,但是仍然有大約三分之一的受試者認(rèn)為當(dāng)前的醫(yī)療設(shè)備不夠完善, 其治療結(jié)果也不盡如人意(Thase,2003)。

二十二碳六烯酸(DHA, C22:6n3)和二十碳五烯酸(EPA, C20:5n3)都是長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA), 也被稱為ω-3脂肪酸, 具有降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病的功能。在過去的十年里, EPA和DHA已經(jīng)被普遍認(rèn)為是能夠?qū)θ祟惤】岛桶l(fā)展產(chǎn)生有益作用的有效膳食成分(Siriwardhana et al, 2012)。其在大腦和視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)中也具有重要作用(Bradbury, 2011)。并且有越來越多的證據(jù)表明, ω-3多不飽和脂肪酸可以有效的治療各種精神障礙, 尤其是單極重度抑郁癥(MDD)。例如, Mischoulon等(2008)研究了DHA的抗抑郁功效和劑量-響應(yīng)模式, 其試驗結(jié)果顯示, 較低劑量的DHA就可能對抑郁癥產(chǎn)生良好的治療效果。Mozaffari-Khosravi等(2013)進(jìn)行了一項運用單中心、隨機、雙盲、對照等方法的平行試驗組, 比較了EPA與DHA分別作為試劑對于依靠藥物來維持治療的輕度到中度抑郁癥患者的療效程度。其結(jié)果表明, EPA作為抗抑郁藥物的佐劑來治療輕度到中度的抑郁癥患者可能比DHA或安慰劑更有效。

深海鰹魚(Katsuwonus pelamis)是一類典型的身長60—250cm, 體重為400磅左右的金槍魚, 生存于太平洋、大西洋和印度洋的亞熱帶水域中(Farley et al,2006)。在食品企業(yè)里, 鰹魚通常被加工成為罐裝食品或生魚片, 而其下腳料則被認(rèn)為是廢棄物而丟棄。因此, 近幾年鰹魚廢棄物已經(jīng)對我國環(huán)境造成了嚴(yán)重的威脅。通過提取廢料鰹魚頭中的DHA和EPA, 能夠有效減少對環(huán)境的污染。本實驗的目的是研究從鰹魚眼窩油中提取的DHA和EPA對小鼠的幾個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響, 再運用動物抑郁模型, 例如強迫游泳實驗(Forced swimming test, FST)和懸尾實驗(Tail suspension test, TST)來評估它們的抗抑郁活性效果。

1 材料與方法

1.1 鰹魚眼窩肉的準(zhǔn)備

鰹魚頭用 40—45oC的熱水浸泡兩天以除去魚骨和魚皮。并將洗滌后的頭部眼窩肉擦干凈, 放置于-20oC的冰箱內(nèi)冷藏。

1.2 堿水解法

水解膠原蛋白和其它有機部分。堿水解法的方法如下: 首先, 將 100g擦干凈的鰹魚眼窩肉放置于三頸燒瓶中, 并加入1.5倍于原料的水。再將混合物在50oC的條件下攪拌均勻, 并用40%的氫氧化鉀將pH調(diào)至 8.0。接著將溫度升高到 80oC, 并持續(xù)攪拌50min。然后再在該混合物中加入5%的氫氧化鉀進(jìn)行水解, 并鹽析 15min。最后在 6000r/min在條件下離心5min, 此時分離出來的油相即為魚油(Barakat et al,2009)。

1.3 脂肪酸甲酯的制備

脂肪酸甲酯的制取首先需要加入 200μL的乙酰氯并在75oC的溫度下恒溫1h。接著, 將反應(yīng)物用4mL,7%的K2CO3進(jìn)行中和, 并用2mL的己烷來萃取。然后在 2500r/min條件下進(jìn)行 20min離心分離。此時1.6mL的己烷層能夠在氮氣下干燥, 并再次溶解于280μL的庚烷內(nèi)并注射進(jìn)入氣相色譜儀(GC)。

1.4 脂肪酸甲酯的氣相色譜(GC)

將 1μL試樣注入 SHIMADZU-PLUS-GC系統(tǒng)。進(jìn)樣器的溫度為250oC, 隨后脂肪酸甲酯在30m的聚乙二醇?xì)庀嗝?xì)血管柱上被分離。柱的初始溫度為160oC, 保持 5min; 然后以 5oC/min的速度緩慢升溫并最終達(dá)到230oC。氣相色譜儀利用萃取的方法能定量測定DHA和EPA的值。通過與真實的標(biāo)準(zhǔn)保留時間比較, 脂肪酸(DHA和EPA)就可被鑒定出來。純的DHA和EPA的甲酯可被用作標(biāo)準(zhǔn)來分析他們的相對含量。標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度通過蒽酮法測定(注射 2μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于氣相色譜儀內(nèi), 獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線, 并分析出它的峰值)。

1.5 給藥

對不同組的健康小鼠進(jìn)行藥物治療, 并對每一個進(jìn)行測試。將氟西汀溶解于生理鹽水中。并且所有劑量均表示為每kg體重所對應(yīng)的藥物的mg數(shù)。食物, 不包括水, 在給動物喂藥的前一個小時內(nèi)不能攝入。將藥品以DHA或EPA(50, 100和300mg/kg), 氟西汀(10mg/kg), 鹽水(15mg/kg)的配比, 連續(xù) 21天每天1次的方式給小鼠(每組有10只)口服喂藥且進(jìn)行相關(guān)的強迫游泳實驗和懸尾實驗。并在最后一次的藥物治療后進(jìn)行1h的行為測試。

1.6 強迫游泳實驗(FST)

在強迫游泳實驗中, 采用本地品種的雄性Balb/e小鼠(18—22g)(Porsolt, 1981)。將其安置在六個組。在試驗當(dāng)天, 將小鼠逐個在扔進(jìn)一個裝有10cm高的水, 水溫為(22±3)oC 的有機玻璃圓筒內(nèi)(高 25cm, 直徑10cm), 使它們在水里待上6min。所有游泳測試的過程都會被圓筒上方直接固定的攝像機所記錄。在實驗過程期間也還會有兩個主要的觀察員, 但觀察員對每個小鼠的治療和錄像帶的得分情況都毫不知曉。在游泳訓(xùn)練結(jié)束后, 將小鼠用毛巾擦干, 并帶回它們原來的處所。小鼠在這個實驗中僅被測驗一次。且所有的強迫游泳實驗都是在上午12點到下午6點這個時間段內(nèi)進(jìn)行。

1.7 懸尾實驗(TST)

用夾子(長度為2cm)夾住小鼠尾巴并將其單獨懸掛在一個箱子內(nèi)(25cm×25cm×30cm), 使其頭部到箱子的底部約為5cm。測試在一個黑暗的房間里, 在最小的背景噪音下進(jìn)行。每只小鼠都懸掛6min, 并觀察其靜止不動的時間且在最后的4min內(nèi)進(jìn)行間斷測試衡量。所有的測試過程都會被箱子上方直接固定的攝像機所記錄。在實驗過程期間也會有兩個主要的觀察員, 但是他們對每個小鼠的治療和錄像帶得分情況都毫不知曉。只有當(dāng)小鼠是被被動懸掛, 或者完全不動的情況下才認(rèn)為它們是靜止不動的。小鼠在這個實驗中僅被測驗一次。且所有的強迫游泳實驗都是在上午 11點到下午 3點這段時間內(nèi)進(jìn)行的(Steru et al,1985)。

1.8 對5-羥色胺引起小鼠頭抽動綜合征的增強作用

在藥物測試過程中, 進(jìn)行腹腔注射75mg/kg的5-羥色胺之前應(yīng)先口服測試藥物60min。然后將小鼠放入玻璃鐘罩內(nèi), 14min后5次計數(shù)相鄰間隔2min的頭部抽動小鼠的數(shù)量(包括第14和16min, 24和26min,34和36min, 44和46min, 54和56min)。在這些間隔的時間內(nèi)小鼠也同時被觀察是否存在全身性震顫,前蹄踩踏或伸展姿勢將腹部放置于接近籠子表面的情況。并計算每個小鼠的得分情況(最大的得分情況=25, 包括頭抽動癥狀的存在與否)(Corne et al, 1963;Sánchez-Mateo et al, 2009)。

1.9 曠場試驗

曠場試驗用于評估動物的探究性活動(Elliott et al, 1986)。在實驗之前, 所研究的DHA和EPA應(yīng)先對小鼠給藥60min。這項研究是在Archer的方法上稍作修改對小鼠進(jìn)行試驗的(Archer, 1973)。曠場裝置是一個非透明的塑料容器(80cm×60cm×30cm), 其底部被分成了48個尺寸為10cm×10cm的單元, 且之間沒有圍墻。這些動物被輕輕地放在了平臺的中心, 被允許去探索周圍的環(huán)境。在 5min之內(nèi), 手動計數(shù)該小鼠的水平(橫向移動)和豎直得分(后肢站立次數(shù))情況。并且, 觀察人員也不知道哪個組的小鼠已經(jīng)被治療過, 以及它們在曠場裝置內(nèi)的得分情況。該實驗在黑暗的房間內(nèi)進(jìn)行, 其光照由裝置在中心1m以上的60瓦電燈泡提供, 能夠投射出淡黃色的光。

1.10 高效液相色譜(HPLC)的條件與測定

將小鼠斷頭處置, 迅速將其大腦取出, 放置于冰冷的玻璃板上解剖, 隨后分離得到前額葉丘腦, 大腦皮層和海馬體。將組織稱重, 并放入于0.1mol/L磷酸二氫鈉水溶液中(包括 0.85mmol/L OSA, 0.5mmol/L EDTA·NA2)進(jìn)行超聲處理, 隨后離心(12000r/min,30min)。然后, 通過高效液相色譜-電化學(xué)法分析 5-羥色胺和去腎上腺素。高效液相色譜系統(tǒng)包括一個微孔反相柱(Shimadzu LC-10ATVP高效液相系統(tǒng),Shimadzu L-ECD-6A電化學(xué)檢測器, N2000高效液相操作軟件, Hypersil ODS C18色譜柱 4.6×150mm 5μm)(Thermo, USA)。流動相為0.1mol/L的磷酸二氫鈉水溶液(包括 0.8mmol/L OSA, 0.5mmol/L EDTA·NA2)和11%的甲醇, 并用磷酸調(diào)至 pH=3.4, 并經(jīng) 0.45μm 濾膜過濾。通過被量化的5-羥色胺和去腎上腺素來繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線, 隨后再對每一個樣品計算其曲線下面積(AUC)。進(jìn)樣量通常為20μL。且本實驗每個樣本的檢出限為20pg/g。

1.11 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用單向方差分析(ANOVA)并結(jié)合Newman-Keuls檢驗和Turkey檢驗的方法來進(jìn)行分析的(Tallarida et al, 1987)。0.05及以下的概率水平可被廣泛接受。卡方檢驗被用于檢測由丁苯誘導(dǎo)的運動活性的百分比。由丁苯那嗪引起的眼瞼下垂, 和由 5-羥色胺誘導(dǎo)的綜合征可運用Mann-Whitney檢驗中的非參數(shù)數(shù)據(jù)來進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHA和EPA甲酯的純化和結(jié)構(gòu)鑒定

利用氣相色譜儀分析鰹魚眼窩油中提取的 DHA和 EPA(圖 1)。在樣品制備過程之前應(yīng)先將標(biāo)準(zhǔn)化的DHA和EPA甲酯注入氣相色譜系統(tǒng)內(nèi)。這兩種魚油在氣象色譜頻譜內(nèi)產(chǎn)生的兩個主峰分別在洗脫的第15.779min和第21.298min(圖1C), 這與圖1A和圖1B在第15.779min (EPA甲酯)和第21.298min產(chǎn)生(DHA甲酯)的峰相同。由此, 樣品溶液中的 DHA 甲酯和EPA甲酯可以對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰的保留時間來計算、分析出樣品中DHA和EPA的含量, 并可證明鰹魚眼窩油中確實含有DHA和EPA。

2.2 在強迫游泳實驗中DHA和EPA對不動時間的影響

當(dāng)DHA和EPA的劑量為50mg/kg (P＜0.001)時,能明顯地發(fā)現(xiàn)小鼠通過對該劑量的依賴使不動狀態(tài)的時間減少到108.1±10.7s。然而, 當(dāng)DHA和EPA 的劑量分別為100和300mg/kg (P＜0.001)時, 其不動狀態(tài)時間只減少到127.7±17.9s和124.4±15.3s?？瞻讓φ招∈蟮牟粍訝顟B(tài)時間為157.0±16.1s。因此, 可以得出這三種情況對小鼠不動狀態(tài)的抑制作用分別為31.15%、18.66%和20.76%。其結(jié)果見圖2。

2.3 在懸尾實驗中DHA和EPA對不動時間的影響

相比較空白對照小鼠的不動狀態(tài)時間為 127.88±15.68s, 當(dāng) DHA和 EPA的劑量分別為 100mg/kg和300mg/kg (P＜0.001)時, 能發(fā)現(xiàn)小鼠通過對該劑量的依賴使不動狀態(tài)的時間減少到 89.6±9.1s和 93.5±7.7s。然而, 當(dāng)DHA和EPA的劑量為50mg/kg時, 可使小鼠的不動狀態(tài)時間發(fā)生更大幅度的改變, 減少到 70.1±4.8s (P＜0.001)。因此, 可得出其抑制作用分別為29.93%、26.88%和45.18%。結(jié)果見圖3。

2.4 在曠場試驗中DHA和EPA對不動時間的影響

表1展示了曠場試驗的實驗結(jié)果。本次試驗研究表明, 作者用 DHA和 EPA(劑量分別為 50, 100和300mg/kg)治療的小鼠與空白對照組的小鼠在 5min的曠場試驗中表現(xiàn)的無明顯區(qū)別。在強迫游泳實驗中給小鼠口服氯丙咪嗪也不能使它們在曠場試驗內(nèi)顯著地改變橫向移動及豎立的次數(shù)。

圖1 脂肪酸氣相色譜圖Fig.1 Gas-chromatogram of fatty acid standard substances and the samples

圖2 在強迫游泳實驗中, 給小鼠口服DHA和EPA后測定的不動狀態(tài)時間Fig.2 Immobility time of DHA and EPA in the FST after oral administration in mice

圖3 在懸尾實驗中, 給小鼠口服DHA和EPA后測定的不動狀態(tài)時間Fig.3 Immobility time of DHA and EPA in the TST after oral administration in mice

表1 DHA和EPA對小鼠5min曠場試驗的結(jié)果數(shù)據(jù)記錄Tab.1 Effects of DHA and EPA on parameters recorded in 5min in open field test

2.5 DHA和 EPA對于 5-羥色胺治療頭抽動綜合征的影響

表2展示了DHA和EPA對5-羥色胺引起的小鼠頭抽動綜合征的結(jié)果?？梢悦黠@觀察到 DHA和 EPA(50mg/kg)對藥物引起的綜合征表現(xiàn)出微弱但卻重要的作用(P＜0.05, Mann-Whitney test)。而且, 盡管沒有明確的統(tǒng)計學(xué)意義, 仍能得出它們能對 5-羥色胺引起頭抽動綜合征有顯著效果。然而在任何一種情況下, 它所展示出的增強效應(yīng)卻都比氟西汀(一種抗抑郁藥, 能選擇性地或優(yōu)先地抑制5-羥色胺酸的攝入)要弱(P＜0.01)。

表2 DHA和EPA對5-羥色胺(75mg/kg i.p.)對于小鼠行為的影響Tab.2 Effect of DHA and EPA on 5-HT (75mg/kg i.p.)behavior in mice

2.6 對小鼠大腦中單胺神經(jīng)遞質(zhì)濃度的影響

用高效液相色譜-電化學(xué)法同時測定小鼠大腦區(qū)域內(nèi)主要的單胺神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物。其結(jié)果展示在表 3。DHA和 EPA的劑量為 50mg/kg, 氟西汀為5mg/kg?？梢悦黠@觀察到, 在強迫游泳實驗中, DHA和EPA及FLU能夠顯著增加主要神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺和去甲腎上腺素在小鼠海馬體、下丘腦及皮質(zhì)層中的濃度。

表3 在強迫游泳實驗中, DHA和EPA對小鼠大腦單胺神經(jīng)遞質(zhì)的影響Tab.3 Effects of FST exposure and DHA and EPA treatment on monoamine neurotransmitter concentrations in mouse brain

3 討論

在本次試驗中, 作者利用堿水解法來提取深海鰹魚眼窩肉中的DHA和EPA, 并采用強迫游泳實驗和懸尾實驗來驗證它們的抗抑郁活性。在這兩種實驗中, 當(dāng)DHA和EPA的劑量分別為50, 100和300mg/kg時都能減少小鼠不動狀態(tài)的時間, 顯示其抗抑郁活性。此外, DHA和EPA (50mg/kg, p.o.)還能增強5-羥色胺誘導(dǎo)的頭抽動應(yīng)答, 說明他們能參與到中樞血清素激活系統(tǒng)內(nèi)。

強迫游泳實驗(Porsolt et al, 1977)和懸尾實驗(Willner, 1984)都是一種表現(xiàn)行為絕望的模型, 這與人類的抑郁癥十分相似。這項測試是基于對動物的觀察, 從最開始的逃離表現(xiàn), 到后來發(fā)現(xiàn)無處可逃后的絕望, 從而使其產(chǎn)生了靜止不動的消極狀態(tài)。這種不動的狀態(tài)可能是反映了對于堅持直接逃跑的絕望,也可能是一種被動行為的發(fā)展, 使動物想要在緊張刺激的應(yīng)對活性形式中脫離。通過這兩種實驗, 可以發(fā)現(xiàn)使用DHA和EPA治療過的小鼠它們在直接逃跑行為過程中會使不動狀態(tài)時間降到最低, 而這可能是由于它們內(nèi)源性的抑郁癥減弱的效果。而且, 不同劑量處理的DHA和EPA(50, 100和300mg/kg)對抑制不動狀態(tài)的效果也有顯著差異。低劑量(50mg/kg)展現(xiàn)出了較好的活性, 而高劑量(100mg/kg和300mg/kg)的抗抑郁活性則相對較弱。

曠場試驗是用來評估DHA和EPA對自發(fā)運動活性的影響的。這是一個經(jīng)典的用于評估藥物和一般動物活性的自主效應(yīng)實驗(Galdino et al, 2009)。該研究結(jié)果表明了DHA和EPA并沒有顯著改變小鼠的運動活性(橫向移動和豎立)。因此可以說明, 在強迫游泳實驗中所觀察到的效果也是不可能由一般的運動活性的刺激而產(chǎn)生的。此外, 作者還發(fā)現(xiàn)DHA和EPA都能對由 5-羥色胺誘導(dǎo)的頭抽動綜合征產(chǎn)生輕微的增強作用, 這可能是由于它們中的一部分抗氧化活性參與到了血清素機制里。

綜上, 本次研究提供的證據(jù)表明從鰹魚眼窩油中提取的DHA和EPA能夠在預(yù)測抗抑郁特性的動物模型中(強迫游泳實驗, 懸尾實驗)明確表明其具有抗抑郁活性效果。這不僅使得DHA和EPA增加了潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景, 而且還減少了對環(huán)境污染, 促進(jìn)了下腳料的開發(fā)利用。

Archer J, 1973. Tests for emotionality in rats and mice: a review.Anim Behav, 21(2): 205—235

Barakat N A M, Khil M S, Omran A M et al, 2009. Extraction of pure natural hydroxyapatite from the bovine bones bio waste by three different methods. J Mater Process Technol, 209(7):3408—3415

Bradbury J, 2011. Docosahexaenoic acid (DHA): an ancient nutrient for the modern human brain. Nutrients, 3(12):529—554

Corne S J, Pickering R W, Warner B T, 1963. A method for assessing the effects of drugs on the central actions of 5-hydroxytryptamine. Br J Pharmacol Chemother, 20:106—120

Elliott P J, Chan J, Parker Y M et al, 1986. Behavioral effects of neurotensin in the open field: structure-activity studies.Brain Res, 381: 259—265

Farley J H, Clear N P, Leroy B et al, 2006. Age, growth and preliminary estimates of maturity of bigeye tuna, Thunnus obesus, in the Australian region. Mar Freshwater Res, 57(7):713—724

Galdino P M, Nascimento M V M, Sampaio B L et al, 2009.Antidepressant-like effect of Lafoensia pacari A. St.-Hil.ethanolic extract and fractions in mice. J Ethnopharmacol,124(3): 581—585

Lopez A D, Murray C C J L, 1998. The global burden of disease,1990—2020. Nat Med, 4: 1241—1243

Mischoulon D, Catherine B P, Michael L et al, 2008. A double-blind dose-finding pilot study of docosahexaenoic acid (DHA) for major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol, 18(9): 639—645

Mozaffari-Khosravi H, Yassini-Ardakani M, Karamati M et al,2013. Eicosapentaenoic acid versus docosahexaenoic acid in mild-to-moderate depression: A randomized, double-blind,placebo-controlled trial. Eur Neuropsychopharmacol, 23(7):636—644

Porsolt R D, 1981. Behavioral despair. In: Enna S J, Malick J B,Richelson E eds. Antidepressants: Neurochemical Behavioral and Clinical Perspectives. New York: Raven Press, 129—139

Porsolt R D, Bertin A, Jalfre M, 1977. Behavioral despair in mice:a primary screening test for antidepressants. Arch Int Pharmacodyn Ther, 229(2): 327—336

Sánchez-Mateo C C, Bonkanka C X, Rabanal R M, 2009.Hypericum grandifolium Choisy: A species native to Macaronesian Region with antidepressant effect. J Ethnopharmacol, 121(2): 297—303

Siriwardhana N, Kalupahana N S, Moustaid-Moussa N, 2012.Health benefits of n-3 polyunsaturated fatty acids:eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid. Adv Food Nutr Res, 65: 211—222

Steru L, Chermat R, Thierry B et al, 1985. The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice.Psychopharmacology, 85(3): 367—370

Tallarida R J, Murray R B, 1987. Manual of Pharmacologic Calculations with Computer Programs, 2nd ed. New York:Springer-Verlag, 110—134

Thase M E, 2003. Evaluating antidepressant therapies: remission as the optimal outcome. J Clin Psychiatry, 64(Suppl. 13):18—25

Tian Y, 2010. Research progress of clinical antidepressant drugs.J China Traditional Chinese Medicine Information, 2: 175

Willner P, 1984. The validity of animal models of depression.Psychopharmacology, 83(1): 1—16