斑點(diǎn)叉尾(Ictalunes punctatus)源中間氣單胞菌(Aeromonas media)分離鑒定及藥敏特性*

楊移斌 楊秋紅 胥 寧 董 靖 劉永濤 艾曉輝①

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所 武漢 430223; 2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 武漢 430223)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)肉湯、水解酪蛋白瓊脂(Casein hydrolysate agar, 中文別名:M-H瓊脂)、腦心浸出液(Brain Heart Infusion, BHI)、革蘭氏染色液、藥敏紙片及細(xì)菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司; PCR所用試劑、特異性引物及細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購自上海生工。

1.2 方法

1.2.2 細(xì)菌分離實(shí)驗(yàn) 選擇腹部出血瀕臨死亡的斑點(diǎn)叉尾10尾, 在無菌環(huán)境下取其肝、腎臟、脾臟、血水及腹水用于細(xì)菌分離, 用接種環(huán)蘸取各樣品于NA及 BHI平板上劃線, 恒溫 28℃培養(yǎng) 24h后, 挑取顏色相近、大小相同及數(shù)量較多的菌落再純化, 將分離得到的菌株與 25%甘油混勻后置于－80℃冰箱,命名為zy02。

1.2.3 回歸感染及LC50測定

人工感染 將 zy02菌株接種于 NA平板, 恒溫28℃培養(yǎng)18 h, 用無菌生理鹽水洗下菌苔, 并調(diào)整菌懸液濃度為5.8 × 108CFU/mL。

細(xì)菌 LC50測定 將分離的病原菌制成的菌懸液分別稀釋成 6.4×104、6.4×105、6.4×106、6.4×107、6.4×108、6.4×109CFU/mL, 然后分別從腹鰭基部注射到健康的斑點(diǎn)叉尾體內(nèi), 進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn), 每尾注射劑量為0.1mL。對(duì)照組的斑點(diǎn)叉尾注射等量的無菌生理鹽水, 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均設(shè)置2個(gè)重復(fù)每組的實(shí)驗(yàn)魚各10尾, 水溫保持在23—25℃。實(shí)驗(yàn)周期為7d,連續(xù)觀察斑點(diǎn)叉尾活動(dòng)情況, 并記錄實(shí)驗(yàn)魚的死亡尾數(shù), 并用概率單位圖解法(徐叔云等, 2002)計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)。

1.2.4 zy02菌株生理生化特性測定 將zy02菌株劃線于NA及BHI平板上, 恒溫28℃培養(yǎng)24h后, 觀察菌落大小、形態(tài)特征及其顏色, 并進(jìn)行革蘭氏染色,采用細(xì)菌生化微量鑒定參照文獻(xiàn)(東秀珠等, 2001)測定生理生化指標(biāo)。

1.2.5 細(xì)菌16S rDNA與gyrB基因測序

模板制備 將菌株 zy02接種于營養(yǎng)肉湯中,置于搖床恒溫 28℃搖蕩(200r/min)18 h, 將菌液經(jīng)高速離心后收集菌體, 提取DNA即作為PCR模板。

16S rDNA 測序 引物為 27F: 5′-AGAGTT TGATC(C/A)TGGCTCAG-3′, 反向 1492R: 5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′。參照璟祝琳等(2010)方法進(jìn)行 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物確定為目的片段后送上海生工純化及序列測定。

gyrB 測序 引物參照 Yamamoto等(1995)為UP1(正向引物): 5′-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCNGGN GGN AAR TTY GA-3′, UP2(反向引物): 5′-AGCAGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCNGCR TCN GTCAT-3′。PCR 反應(yīng)條件為參照邴旭文等(2009)。擴(kuò)增片段送上海生工純化測序。

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 將zy02菌株16S rDNA及gryB基因與 GenBank中已有序列進(jìn)行比對(duì), 根據(jù)比對(duì)結(jié)果檢索出同源性較高的序列采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配分析, 通過 MEGA5.1軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 1000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.2.6 zy02菌株藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 本次通過K-B法, 將菌株zy02接種于營養(yǎng)肉湯中, 28℃震蕩(200r/min)18h調(diào)整菌液濃度為1.0×107CFU/mL, 取稀釋菌液 200μL均勻涂布于水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上, 貼上不同的藥敏紙片, 恒溫28℃培養(yǎng)24h后測量抑菌圈直徑(mm), 根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片抑菌圈標(biāo)準(zhǔn)確定致病菌株對(duì)藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷

2.2 細(xì)菌分離

2.3 細(xì)菌鑒定

分離菌株 zy02為革蘭氏陰性桿菌, 無運(yùn)動(dòng)性, 詳細(xì)理化特性如表1所述, zy02菌株理化特性與中間氣單胞菌Aeromonas media一致。通過將16S rDNA及gyrB序列分析的結(jié)果與NCBI基因庫中已有序列比對(duì), 結(jié)果顯示菌株 zy02與氣單胞菌屬種類同源性最高, 通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖 2, 圖 3), 其結(jié)果顯示菌株 zy02與中間氣單胞菌Aeromonas media聚為一支, 同源性達(dá)到99% (圖2, 圖3)。綜合生理生化特征測定結(jié)果, 菌株zy02判定為中間氣單胞菌Aeromonas media。

圖1 斑點(diǎn)叉尾死亡率(%)與菌液濃度對(duì)數(shù)[lg(CFU/mL)]的關(guān)系曲線Fig.1 Relationship between I. punctatus mortality and logarithmic bacterial concentration

2.4 藥敏特性

藥敏特性研究結(jié)果顯示: 菌株zy02對(duì)環(huán)丙沙星、氯霉素、氟苯尼考及諾氟沙星等13種藥物高度敏感;對(duì)紅霉素中度敏感; 對(duì)阿莫西林、 磺 胺異 噁 唑、克林霉素及利福平等5種藥物耐藥。具體見表2。

3 討論

氣單胞菌按照新的分類方式, 隸屬于新建的氣單胞菌科(Colwellet al, 1986), 是兼性厭氧革蘭氏陰性桿菌種類。氣單胞菌大部分種類廣泛分布于水體、污泥、土壤及空氣中, 其中數(shù)種如嗜水氣單胞菌(陸承平, 1992)、維氏氣單胞菌(馬志宏等, 2009)、溫和氣單胞菌(劉方等, 2016)及殺鮭氣單胞菌(楊嘉龍等, 2007)等都是水生動(dòng)物重要病原菌, 可引起多種水產(chǎn)動(dòng)物如斑點(diǎn)叉尾(劉堂水等, 2006; 梁萬文等, 2007; 耿毅等, 2007)、大鯢(凌空等, 2015)、錦鯉(姜艷麗,2015)、南方大口鯰(賀蓉等, 2005)、西伯利亞鱘(馬志宏等, 2009)及黃顙魚(劉方等, 2016)等大量死亡。而中間氣單胞菌對(duì)水生動(dòng)物致病的報(bào)道相對(duì)較少, 僅黃文明等(2013)報(bào)道了中間氣單胞菌引起胭脂魚發(fā)病及王高學(xué)等(2007)報(bào)道了中間氣單胞菌引起刺參腐皮病。本研究通過病原分離純化鑒定及人工感染等實(shí)驗(yàn),證實(shí)了本次斑點(diǎn)叉尾出血性死亡是由中間氣單胞菌感染引起的, 在國內(nèi)尚屬首次報(bào)道。水生動(dòng)物出血病一般由氣單胞菌種類引起, 但可能因地域差異、養(yǎng)殖水域環(huán)境及養(yǎng)殖種類等不同, 導(dǎo)致發(fā)病的病原也不盡相同, 本次報(bào)道中間氣單胞菌引起斑點(diǎn)叉尾出血性死亡, 為斑點(diǎn)叉尾疾病防控提供了新的參考依據(jù)。

表1 菌株zy02生理生化特征Tab.1 Physiologic and biochemical characteristics of strain zy02

圖2 zy02株根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of strain zy02

圖3 zy02株根據(jù)gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequence of strain zy02

表2 zy02藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibiotic sensitivity test on strain zy02

本對(duì)菌株zy02鑒定時(shí), 不僅測定了其理化特性,而且對(duì)其16S rDNA和gyrB基因序列進(jìn)行了分析, 從分子角度進(jìn)行鑒定。gyrB基因即促旋酶(Gyrase)的B亞單位基因, 該基因序列全長約為 1.2—1.4kb, 其平均堿基替換率為 100萬年替換 0.7%—0.8%, 比 16S rDNA基因的每5000萬年替換1%的替換率要快, 因此 gyrB基因具有更高的分辨率, 特別在區(qū)分和鑒定近緣菌種方面較16S rDNA基因更具優(yōu)勢(郝云婕等,2008), 從而使得本次中間氣單胞菌的鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

在病害防控過程中使用抗生素進(jìn)行治療, 以達(dá)到減少經(jīng)濟(jì)損失的目的通常采用的措施之一。但隨著疾病暴發(fā)頻率及規(guī)模不斷升級(jí), 抗生素濫用時(shí)有發(fā)生, 在此過程中很可能產(chǎn)生大量耐藥菌株。本次以19種抗生素對(duì)分離菌株 zy02進(jìn)行了藥敏測定, 結(jié)果顯示菌株 zy02對(duì)阿莫西林、 磺 胺異 噁 唑、克林霉素及利福平等5種抗生素耐藥。黃文明等(2013)研究表明來自胭脂魚體內(nèi)分離的中間氣單胞菌對(duì)慶大霉素、氟苯尼考等高度敏感, 對(duì)利福平中度敏感; 王高學(xué)等(2007)研究表明中間氣單胞菌僅對(duì)氟苯尼考等高度敏感, 而對(duì)硫酸慶大霉素等耐藥, 與本文結(jié)果有差異。其原因可能在于菌株來源、地理環(huán)境及用藥情況等不同, 導(dǎo)致不同的耐藥結(jié)果。為此我們?cè)谏a(chǎn)疾病防控時(shí), 嚴(yán)格選擇高度敏感藥物交替使用, 同時(shí)注意使用藥物的劑量及療程, 最大程度上避免病原菌的耐藥性產(chǎn)生。

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