一株耐受高濃度硫酸鎂單細(xì)胞綠藻的分類學(xué)鑒定及單鹽脅迫對其生長的影響*

劉旭東 劉國祥 胡征宇

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

膠球藻(Coccomyxa Schmidle)是一類生境多樣化群體, 它們可以營自由生活(Verma et al, 2009), 可與原生動物、地衣、高等植物銀杏等光合共生(Lohtander et al, 2003; Trémouillaux-Guiller et al, 2007; Hoshina et al, 2008), 抑或寄生于海洋無脊椎動物(Stevenson et al, 1974)。

膠球藻類的分類較為混亂(Ettl et al, 1995)。膠球藻屬的第一個新種(Coccomyxa dispar Schmidle)于1901年由Schmidle發(fā)現(xiàn)。Schmidle描述了其主要特征: 兩端不對稱的近橢圓形細(xì)胞, 單個或幾個細(xì)胞被一層薄薄的膠被所覆蓋, 色素體片狀并位于細(xì)胞側(cè)壁, 蛋白核缺失(Schmidle, 1901)。該種也成為膠球藻屬的正模式種, 而之后 Fott的研究基于該種與Gloeocapsa confluens Kützing的相似性, 于1974年將C. dispar重新命名為Coccomyxa confluens (Kützing)Fott, 并成立后者為膠球藻屬的副模式種(Fott,1974)。該屬自定義以來, 一直爭議不斷。Schmidle認(rèn)為該屬與Dactylococcus, Dactylothece及Raphidium親緣關(guān)系較近(Schmidle, 1901)。1913年, 基于Coccomyxa dispar以似親孢子繁殖的特性, Chodat將膠球藻屬歸入 Protococcoidee (Chodat, 1913)。之后,由于觀察到細(xì)胞的橫二分裂, Printz將該屬置于Pleurococcaceae (Jagg, 1933)。Jagg通過對膠球藻細(xì)胞大量的觀察和培養(yǎng), 否認(rèn)了 Printz的觀點(diǎn), 并將該屬重新歸回 Protococcoidee, 并說明了膠球藻生境的非特異性, 同時在 Coccomyxa subellipsoidea中觀察到動孢子的存在(Jagg, 1933)。然而, 隨著偽膠球藻屬的提出, 膠球藻屬的分類地位重新變得有爭議。膠球藻屬被歸于膠球藻科, 而Herndon將膠球藻科放在他所新建的 Chlorosphaerales目下(Herndon, 1958)。Groover等認(rèn)為 Chlorosphaerales目應(yīng)當(dāng)被重新命名為Chlorosarcinales, 此目包括那些兼有營養(yǎng)分裂方式和無性生殖形成動孢子的屬(Groover et al, 1969)。1966年, Bourrelly將膠球藻科另置于綠球藻目之下(Bourrelly, 1966)。膠球藻科無動孢子, 似乎不應(yīng)該歸于Chlorosarcinales之下, 所以 Bourrelly的觀點(diǎn)在當(dāng)時看來是較為合理的(Stevenson et al, 1974)。1974年,基于該屬與Palmelogloea protuberans Kützing的相似性, Fott將之歸入Palmogloeaceae(Fott, 1974)。隨著分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的興起, 膠球藻屬的分類地位逐漸清晰。該屬位于共球藻綱, 并與微擬球藻屬(Nannochloropsis)親緣關(guān)系較近(Lohtander et al,2003)。2003年, Stefan Zoller等對于膠球藻與Omphalina共生研究認(rèn)為, 膠球藻主要分為3大支系,即營自由生活株系, 與地衣Omphalina共生株系及與地衣Peltigerales共生株系(Zoller et al, 2003)。

Kor?ikov于 1953年發(fā)現(xiàn)并描述了偽膠球藻屬(Pseudococcomyxa Kor?hikov, 1953)的 第 一 個 新 種(Pseudococcomyxa adhaerens Korsh)。該種單細(xì)胞, 長橢圓形, 細(xì)胞壁薄并且無膠被覆蓋, 色素體片狀側(cè)生,于核所在的細(xì)胞中部有一個凹陷點(diǎn)。藻細(xì)胞無性繁殖時, 原生質(zhì)體連續(xù)分裂, 第一次為橫分裂, 而之后為沿對角線分裂, 并產(chǎn)生2或4個似親孢子。子孢子拉長并產(chǎn)生自己的細(xì)胞壁后, 由母細(xì)胞壁一端破裂開口釋放。休眠期時, 藻細(xì)胞形成厚壁孢子, 并有紅色素產(chǎn)生。無四集體藻型階段。用墨汁或苯胺藍(lán)染藻細(xì)胞, 可見其一或兩端具有膠液團(tuán), 但若形成群體, 則居于底部的細(xì)胞無此膠液團(tuán)形成。偽膠球藻分布廣泛,并主要于土壤中存在。Korshikov認(rèn)為其介于Oocystaceae和 Ankistrodesmaceae之間, 并且從似親孢子的形成和拉長的細(xì)胞形狀上看更加偏向于后者,而后者中的一些種也能在細(xì)胞極端產(chǎn)生膠液團(tuán)(Kor?ikov, 1953)。1981 年, Fott認(rèn)為該種與 Coccomyxa simplex Mainx是同一株藻, 故成立新組合種Pseudococcomyxa. Simlex (Mainx) Fott (Fott, 1981)。Marvan等將偽膠球藻置于 Selenastraceae中(Marvan et al, 1984), 而Pr?schold等恢復(fù)了其系統(tǒng)發(fā)育位置于共球藻綱 Elliptochloris類群。Pr?schold等進(jìn)一步揭露了P. simplex與其它膠球藻株系的系統(tǒng)發(fā)育位置很近, 因此, 為了避免分類學(xué)的混淆, Coccomyxa simplex Mainx的分類地位被重新建立(Pr?schold,2011)。

本研究藻株為實(shí)驗(yàn)室75g/L濃度的硫酸鎂溶液中偶然發(fā)現(xiàn)并分離得到。1958年, Fott發(fā)現(xiàn)偽膠球藻(Pseudococcomyxa adhaerens)自發(fā)出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室化學(xué)溶液中(Fott et al, 1958)。1965年, Braune同樣在他實(shí)驗(yàn)室儲存的蒸餾水及硫酸鎂溶液中發(fā)現(xiàn)偽膠球藻,并通過實(shí)驗(yàn)證明硫酸鎂溶液中的偽膠球藻并非來自于空氣污染, 而是蒸餾水中本身帶入的(Braune,1964)。Rivasseau同樣提到Coccomyxa actinabiotis可以在蒸餾水中生存(Rivasseau et al, 2013)。

我們的研究擬著重使用分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)手段并結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理特征對生長于硫酸鎂溶液中的藻株進(jìn)行分類學(xué)鑒定。另一方面, Fv/Fm比值是光系統(tǒng)Ⅱ的最大光量子產(chǎn)率, 反映 PSⅡ反應(yīng)中心的內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率, 或PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)換效率, 其中, Fm是飽和脈沖激發(fā)得到的藻細(xì)胞的最大熒光, Fv是可變熒光, 即Fm與Fo(初始熒光)之差。在非脅迫條件下, 此參數(shù)變化很小, 但在脅迫條件下, 此參數(shù)變化較大,因此它是反映微藻生長環(huán)境良好與否的一個重要參數(shù)(尹翠玲等, 2007)。我們擬通過在不同培養(yǎng)條件下對藻株 Fv/Fm值的測量, 初步探究其耐受硫酸鎂單鹽的生理特性。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用藻株為實(shí)驗(yàn)室75g/L硫酸鎂溶液中采集并分離培養(yǎng)所得, 所用培養(yǎng)基為BG11(Stanier et al,1971)。送至中國科學(xué)院淡水藻種庫, 所得編號FACHB-1785。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

1.2.1 LM 觀察 將新鮮培養(yǎng)的活細(xì)胞直接使用顯微鏡(LEICA DMC 5000)進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)的觀察, 并用配套軟件進(jìn)行拍照。

1.2.2 TEM 觀察 將培養(yǎng)的藻細(xì)胞離心收集后,送至中國科學(xué)院水生生物研究所分析測試中心進(jìn)行電鏡樣品制備, 經(jīng)過固定, 脫水, 滲透, 包埋, 切片,染色后, 使用TEM(Hitachi TEM system HC-1)進(jìn)行觀察(殷明焱等, 2009)。

1.3 分子測定方法

1.3.1 基因組DNA的提取 取新鮮的指數(shù)生長期的藻細(xì)胞于 10000 r/min離心 1min去上清液, 加入300μL Tris-HCl懸浮緩沖液, 移入1.5mL EP管中, 充分震蕩搖勻, 以收集到高密度的藻細(xì)胞。使用MiniBeadbeater石英珠研磨均質(zhì)器(Biospec Product,Inc.)將藻細(xì)胞于4800 r/min研磨30s, 用以打破細(xì)胞壁。使用AxyPrep基因組DNA提取試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)提取藻細(xì)胞基因組 DNA, 并以其作為模板擴(kuò)增ITS及18S rDNA片段。

1.3.2 18S rDNA的擴(kuò)增 設(shè)計(jì)使用50μL PCR擴(kuò)增體系, 其中包括模板DNA 10μL, 正反引物各1μL,Taq Buffer 5μL, Taq 酶 0.65μL, dNTP1μL 和 ddH2O 31.35μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min; 94°C變性1min, 56°C 復(fù)性 1 min, 72°C 延伸 1.5 min (共 34個循環(huán)); 72°C延伸10 min。用于擴(kuò)增18S rDNA的引物為通用引物, 序列如下:

正 向 引 物 (18SF): 5’-CCAACCTGGTTGATCCT GCCAGTA-3’

反向引物(18SR): 5’-CCTTGTTAACGACTTCAC CTTCCTCT-3’

1.3.3 ITS序列的擴(kuò)增 設(shè)計(jì)使用50μL PCR擴(kuò)增體系, 其中包括模板 DNA 10μL, 正反引物各 1μL,Taq Buffer 5μL, Taq酶 0.65μL, dNTP 1μL 和 ddH2O 31.35μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性 5min; 94°C變性1min, 56°C 復(fù)性 1 min, 72°C 延伸 1.5 min(共 34個循環(huán)); 72°C延伸10 min。用于擴(kuò)增ITS rDNA序列的引物為通用引物, 序列如下:

正向引物(ITSF): 5′-CAAGGTTTCCGTAGGTGA-3′

反向引物(ITSR): 5′-GGCATCCTGGTTAGTTTC T -3′

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與測序 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后, 使用膠回收試劑盒(Axygen,AP-GX-50)回收, 電泳緩沖液為 TAE。將回收得到的PCR產(chǎn)物交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 通過 GenBank數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)序列。將所得序列使用軟件MEGA 5.05進(jìn)行比對和手工矯正。DNA數(shù)據(jù)的堿基組成分析, 堿基轉(zhuǎn)換與顛換比率分析, 核苷酸替代飽和分析以及分類階元之間的遺傳距離分析等, 也同樣采用 MEGA 5.05完成。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)。ML樹采用軟件PAUP 4.0構(gòu)建, 其最適取代模型及參數(shù)由Modeltest程序得到。貝葉斯樹采用軟件 MrBayes(v3.1.2)(Huelsenbeck et al,2001)。ML法以最大鄰接樹為起點(diǎn)進(jìn)行啟發(fā)式搜索,NNI交換算法, 并選取普通時間可逆模型(GTR+G+I)作為ML分析的最適取代模型。Bayesian樹的進(jìn)化模型同 ML, 位點(diǎn)間差異比率采用 γ分布比率差異(gamma-distributed rate variation), 其中部分為不變位點(diǎn)(a proportion of invariant sites), 其余參數(shù)為默認(rèn)值;采用MCMC法運(yùn)算10000000代, 每10000代取樣1次, 從得到的 1000個樣本中舍棄 250個老化樣本后總結(jié)得到共有樹。

1.4 不同培養(yǎng)液對藻株FACHB-1785的影響

設(shè)計(jì) 11種培養(yǎng)條件, 即蒸餾水, 0.3mmol/L MgSO4(為BG11標(biāo)配MgSO4濃度), 3mmol/L MgSO4,30mmol/L MgSO4, 300mmol/L MgSO4, 600mmol/L MgSO4, 1200mmol/L MgSO4(pH=5.75), 1200mmol/L NaCl (pH=6.59), 1200mmol/L CaCl2(pH=5.10),1200mmol/L MgCl2(pH=5.82), 1200mmol/L Na2SO4(pH=5.79)。每天搖 3次, 并定時使用分光光度計(jì)(UV-1700)測定藻液在 680nm波長處的吸光度值, 用OD680變化表征藻細(xì)胞的生長情況。

1.5 PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)的測定

使用德國Walz公司產(chǎn)Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz, Effeltrieh, Germany)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。將所養(yǎng)各組藻液于第 13天測定 Fv/Fm值。測量前將微藻樣品暗適應(yīng) 15min。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm可在熒光儀上直接讀出, 其中用飽和脈沖[4800μmol/(m2·s), 持續(xù)時間為 0.8s)激發(fā)得 Fm(最大熒光)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Origin 7.5軟件作圖。用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因子方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

單細(xì)胞, 或無明顯膠被的聚集群體(圖 1a—1i)。細(xì)胞橢圓形。色素體側(cè)位, 長片狀, 幼時 1個(圖1e—1f), 成熟后多為分葉的2瓣、或2個(圖1a—1d,1g—1h)。無蛋白核。成熟細(xì)胞長6—9微米, 寬5—7微米, 長寬比為 1.2—1.5 倍(圖 1a—1d, 1g—1h)。以形成2—4個似親孢子進(jìn)行無性繁殖(圖1g—h)。

在膠球藻屬膠被不明顯的幾個物種中, 本株藻和膠球形膠球藻C. gloeobotrydiformis Reisigl 1969形態(tài)相似, 都為橢圓形、具有較小的長寬比值, 且色素體在成熟后不止1個。但膠球形膠球藻的色素體可達(dá)3個, 有些分布在細(xì)胞兩端。而本株藻細(xì)胞無論在生境條件下或培養(yǎng)條件下, 色素體均側(cè)位并與細(xì)胞縱軸平行, 成熟細(xì)胞多為分葉的2瓣, 絕不為多個。

生長于蒸餾水環(huán)境中的藻細(xì)胞內(nèi)油滴含量增加, 葉綠體體積變小(圖 1p); 而 1200mmol/L 的MgSO4對藻細(xì)胞形態(tài)影響較小, 葉綠體顏色變黃,細(xì)胞內(nèi)含物增加(圖 1o); 1200mmol/L的NaCl使藻細(xì)胞部分白化, 細(xì)胞內(nèi)積累大量內(nèi)含物, 葉綠體收縮明顯(圖 1l); 1200mmol/L的 CaCl2, MgCl2和Na2SO4使細(xì)胞大量白化, 內(nèi)含物充滿細(xì)胞, 細(xì)胞趨于死亡(圖 1k, 1m, 1n)。

圖1 藻株FACHB-1785顯微圖片F(xiàn)ig.1 Micrographs of strain FACHB-1785

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

2.2.1 基于 18S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 2) 將所選 18S序列進(jìn)行比對后剪切, 得到由27條長度為1684bp的序列所組成的矩陣。所有位點(diǎn)中有1327(78.8%)個保守位點(diǎn), 346(20.5%)個可變位點(diǎn),239(14.2%)個簡約信息位點(diǎn)。堿基組成分析顯示所有序列平均堿基組成為A=24.4%, T/U=25.4%, C=22.0%,G=28.2%, A+T含量(49.8%)少于G+C含量(50.2%)。堿基轉(zhuǎn)換/顛換比(R)為1.72。用配對序列之間的轉(zhuǎn)換距離和顛換距離對未校準(zhǔn)過的P-distance距離分別作圖, 得到的堿基替換飽和性分析結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)換和顛換替代都與 P-distance距離呈線性關(guān)系, 并且轉(zhuǎn)換速率大于顛換, 即序列未達(dá)飽和。18S系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建旨在顯示膠球藻類群所處的分類地位及該類群內(nèi)各分支所處的位置。如圖所示, 所選藻株位于膠球藻類群之中, 屬于膠球藻屬。整個膠球藻類群與Elliptochloris類群親緣關(guān)系最近, 并與 Nannochloris和Choricystis類群共處于共球藻綱下的一個分支內(nèi)。

2.2.2 基于 ITS rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)ITS序列比對產(chǎn)生一個含有52個長度為710 bp的序列矩陣。所有位點(diǎn)中有415個可變位點(diǎn), 其中372個為簡約信息位點(diǎn)。堿基組成分析顯示所有序列的平均堿基組成為A=21.7%, T=18.7%, C=30.5%, G=29.1%,A+T含量(40.4%)小于 G+C含量(59.6%), 堿基轉(zhuǎn)換/顛換比為 1.469。在序列飽和性分析中, 轉(zhuǎn)換和顛換與P-distance遺傳距離的線形相關(guān)顯示這些位點(diǎn)沒有突變飽和?；贗TS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹用于顯示膠球藻屬內(nèi)各種間的關(guān)系。該樹結(jié)果顯示, 本研究藻株 FACHB-1785與另外兩株藻共居于一個小分支(Clade C), 與它們分別僅有4和5個堿基差異。該小分支與一支膠球藻株系群(Clade A)和一支多偽膠球藻株系群(Clade B)親緣關(guān)系較近。

圖2 基于18S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 ML tree and Bayes tree inferred from 18S rDNA sequences

圖3 基于ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 ML tree and Bayes tree inferred from ITS rDNA

2.3 不同培養(yǎng)液對膠球藻FACHB-1785的影響

2.3.1 不同濃度MgSO4對膠球藻FACHB-1785細(xì)胞密度的影響(圖4a) 從圖中可以看出, 各組藻細(xì)胞中, 生長狀況最好的為 3mmol/L MgSO4組, 而0.3mmol/L MgSO4組次之。蒸餾水組藻細(xì)胞沒有經(jīng)歷下降過程, 但上升緩慢, 最終與 30mmol/L MgSO4組的生長狀況相差不大(P＞0.05)。除蒸餾水組之外, 其余各組藻細(xì)胞密度均經(jīng)歷了先下降, 2天左右之后逐漸回升的過程, 可見單鹽硫酸鎂的加入對藻細(xì)胞產(chǎn)生了一定的脅迫作用, 但膠球藻FACHB-1785可以通過短期(2天)的適應(yīng)而逐漸恢復(fù)生長。隨著單鹽硫酸鎂的濃度的增高(大于 3mmol/L), 藻細(xì)胞的生長開始出現(xiàn)被抑制的趨勢, 并隨濃度的增大, 抑制加深,1200mmol/L MgSO4組的細(xì)胞密度顯著低于其它各組(P＜0.05)。

2.3.2 1200mmol/L的各組鹽對膠球藻 FACHB-1785細(xì)胞密度的影響(圖 4b) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1200mmol/L MgSO4組藻細(xì)胞的終生物量顯著高于其它各組(P＜0.05), 而 Na2SO4組則顯著低于其它各組(P＜0.05)。1200mmol/L MgSO4組藻細(xì)胞經(jīng)歷了先下降,后上升的過程, 而其余各組藻細(xì)胞密度則先急劇下降, 而后緩慢下降, 這說明膠球藻FACHB-1785對高濃度單鹽 MgSO4的有一定的耐受性, 而對其它鹽則無此耐受性。

2.3.3 不同濃度MgSO4對膠球藻FACHB-1785光系統(tǒng)Ⅱ最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的影響(圖 4c) 結(jié)果顯示, 各組Fv/Fm值顯示了與細(xì)胞密度OD值相似的結(jié)果。3mmol/L MgSO4組藻細(xì)胞的光系統(tǒng)Ⅱ最大量子產(chǎn)率值最高, 0.3mmol/L MgSO4組次之, 蒸餾水組與30mmol/L MgSO4組藻細(xì)胞終 Fv/Fm值相差不大(P＞0.05), 而 1200mmol/L MgSO4組則顯著低于其它各組(P＜0.05), 說明一定濃度硫酸鎂對藻細(xì)胞光系統(tǒng)Ⅱ最大量子產(chǎn)率的增高有一定的促進(jìn)作用, 但若濃度過高則對藻細(xì)胞光系統(tǒng)Ⅱ會產(chǎn)生一定的脅迫。

2.3.4 1200mmol/L的不同鹽對膠球藻FACHB-1785光系統(tǒng)Ⅱ最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的影響(圖 4d) 由圖顯示, 1200mmol/L MgSO4組藻細(xì)胞的 Fv/Fm值顯著大于其它各組(P＜0.05)。而其它各組中, MgCl2組Fv/Fm值最大, 其余各組差異不顯著(P＞0.05), 但均較低, 其中 Na2SO4組最低, 僅有0.0605, 說明除了MgSO4鹽以外, 1200mmol/L的其它鹽嚴(yán)重抑制了膠球藻FACHB-1785的光系統(tǒng)Ⅱ最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)。

3 討論

球狀氣生綠藻通常由于細(xì)胞形狀單一且典型的分類特征較少, 而不能完全通過形態(tài)學(xué)評估來反應(yīng)其進(jìn)化地位, 其中, 膠球藻和偽膠球藻是這種形態(tài)界限模糊的典型代表(Neustupa et al, 2008)。與共球藻綱的其它藻相同的是, 相比于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法,膠球藻的分子數(shù)據(jù)結(jié)果暗示了其屬內(nèi)更加豐富的物種多樣性(Neustupa et al, 2008)。其中, 核ITS序列區(qū)域有著更高的變異性, 并被廣泛用于較低分類級別的系統(tǒng)發(fā)育分析(Trémouillaux-Guiller et al, 2007)。但膠球藻屬內(nèi)半數(shù)以上已確定種并無分子數(shù)據(jù), 僅從分子數(shù)據(jù)上無法準(zhǔn)確判斷一株藻的系統(tǒng)發(fā)育位置。故本研究結(jié)合了形態(tài)學(xué)方法與系統(tǒng)發(fā)育方法共同判斷本藻株FACHB-1785所屬的分類地位。

本研究的系統(tǒng)進(jìn)化樹包含了大多數(shù)已知分子序列的膠球藻。從兩株進(jìn)化樹中均可以看出, 本株藻FACHB-1785位于膠球藻屬內(nèi), 并與一支與地衣Peltigerales共生的膠球藻株系群(Clade A)和一支多偽膠球藻株系群(Clade B)親緣關(guān)系較近。ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹更適合處理種間的關(guān)系(Bock et al, 2011)。從ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹來看, 本藻株所屬支系Clade C與Clade A和Clade B顯著的分為三支, 并得到一定自展支持值的支持(ML/BI: 69/0.97)。另外, Clade C支系還未在前人的相關(guān)文獻(xiàn)中提到。

另外, 從整個膠球藻屬來看, 本藻株的形態(tài)特征是獨(dú)特的。膠球藻屬內(nèi), 細(xì)胞長寬比, 形狀, 大小, 膠被形態(tài)及葉綠體形態(tài)和位置為分種的主要特征(Ettl et al, 1995)。就本藻株而言, 區(qū)別于其它種的主要特征在于膠被形態(tài)和葉綠體特征。本藻株膠被不明顯。在膠球藻屬膠被不明顯的幾個物種中, 本藻株和膠球形膠球藻C. gloeobotrydiformis Reisigl 1969形態(tài)相似, 都為橢圓形、具有較小的長寬比值(1.2—1.5), 且色素體在成熟后不止1個。但膠球形膠球藻的色素體可達(dá)3個, 有些分布在細(xì)胞兩端。而本藻株細(xì)胞無論在生境條件下或培養(yǎng)條件下, 色素體均側(cè)位并與細(xì)胞縱軸平行, 成熟細(xì)胞多為分葉的2瓣, 絕不為多個。

通過以上比較, 我們綜合認(rèn)為本藻株FACHB-1785為膠球藻屬下一個不確定種, 并可能是一個新種。

圖4 膠球藻FACHB-1785在不同培養(yǎng)條件的生長Fig.4 Growth of strain FACHB-1785 under different culture conditions

另外, 由于簡單膠球藻(Coccomyxa simplex)的分類地位被重新確立(Pr?schold et al, 2011), 偽膠球藻的分類地位需要進(jìn)行修訂(Krienitz et al, 2012)。最近的分子數(shù)據(jù)表明膠球藻與偽膠球藻形成一個單一的共球藻綱類群, 并包含許多種, 傳統(tǒng)的膠液產(chǎn)生不同的標(biāo)準(zhǔn)難以作為分屬的特征(Neustupa et al, 2008)。該觀點(diǎn)得到本研究結(jié)果支持。幾株偽膠球藻在兩株系統(tǒng)進(jìn)化樹, 特別是基于ITS所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中, 并未完全與膠球藻分開。ITS樹中, 幾株偽膠球藻共居于一支株系, 但該株系中仍有其它膠球藻存在, 偽膠球藻不能從膠球藻中獨(dú)立出來。故將其獨(dú)立為一屬的觀點(diǎn)仍需更多證據(jù)支持, 膠液產(chǎn)生不同的標(biāo)準(zhǔn)可能只是膠球藻屬的分種特征。

有意思的是, 藻株FACHB-1785除了在高濃度硫酸鎂溶液中表現(xiàn)出一定的耐受性外, 在蒸餾水中同樣表現(xiàn)出較好的耐受特性。鎂是構(gòu)成葉綠素的中心元素, 其含量與相對葉綠素含量呈極顯著相關(guān)(張廣越等, 2010)。Hermans等的研究證明缺鎂脅迫可以引起葉綠體結(jié)構(gòu)與功能的異常, 葉綠體含量下降, 進(jìn)而直接影響PSⅠ與PSⅡ的功能(Hermans et al, 2005)。本研究中, 蒸餾水組的藻細(xì)胞雖然生長緩慢, 葉綠體體積變小(如圖 1p), 光系統(tǒng)Ⅱ活性略有降低, 但細(xì)胞通過一定時期的適應(yīng)而逐漸恢復(fù)(如圖 4a, 4c), 這說明藻株可以耐受極低濃度鎂對細(xì)胞產(chǎn)生的影響。與對照組蒸餾水組相比, 高濃度(1200mmol/L)其它鹽(NaCl,CaCl2, MgCl2, Na2SO4)的加入使細(xì)胞大部分白化, 葉綠體受損失色嚴(yán)重(如圖1k—1n), 藻細(xì)胞濃度持續(xù)下降(如圖 4b), 但高濃度(1200mmol/L)硫酸鎂鹽組藻細(xì)胞則通過4天的適應(yīng)而逐漸恢復(fù)生長(如圖4b), 說明該藻株對硫酸鎂鹽有獨(dú)特的單鹽抗性, 而光系統(tǒng)Ⅱ最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)值的顯著差異(如圖 4d)則暗示了高濃度其它單鹽可能通過影響藻株葉綠體的正常功能, 進(jìn)而影響了細(xì)胞的正常生長, 而在高濃度單鹽硫酸鎂條件下, 細(xì)胞通過對葉綠體的保護(hù), 從而維持了一定速率的細(xì)胞增長。Braune對于偽膠球藻的蒸餾水及高鹽環(huán)境耐受特性的研究表明, 藻細(xì)胞增長所需的營養(yǎng)物質(zhì)可能來源于蒸餾水, 并認(rèn)為藻細(xì)胞可能通過進(jìn)入“生理干燥期”來抵抗蒸餾水及高鹽環(huán)境帶來的不利因素(Braune, 1964)。

可以預(yù)見的是, 本藻株因其獨(dú)特的硫酸鎂單鹽耐受性而具有潛在的應(yīng)用價值。在富油藻株的篩選中,抗逆能力是其中重點(diǎn)考察的指標(biāo), 極端環(huán)境耐受藻株可最大限度的降低雜藻和敵害生物的侵染, 具有戶外大規(guī)模培養(yǎng)的條件(劉建國等, 2013)。本藻株可在通氣條件下大量培養(yǎng), 一定濃度硫酸鎂鹽的加入不僅提高了藻株的生物量(圖4a), 其一定的脅迫也促進(jìn)了胞內(nèi)油脂積累的增加(圖 1a—1i, 1o), 同時可以抑制其它可能雜藻的生長, 其較高的抗污染特性使其具有成為優(yōu)良產(chǎn)油藻株的潛質(zhì)。

4 結(jié)論

自實(shí)驗(yàn)室硫酸鎂單鹽溶液中分離得到一株綠藻,通過分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析, 結(jié)合形態(tài)學(xué)區(qū)別及生理特征, 綜合認(rèn)定為一種膠球藻(Coccomyxa sp.)。對其耐受硫酸鎂溶液的初步探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 藻株FACHB-1785對硫酸鎂單鹽及蒸餾水脅迫有著獨(dú)特的抗性, 而光系統(tǒng)Ⅱ最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的顯著差別則暗示了相比于其它單鹽溶液, 藻株可以更有效的抵御硫酸鎂對于光合系統(tǒng)的脅迫。這些特征同時表明該藻株有良好的抗雜藻污染特性, 具有潛在應(yīng)用前景。

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