軟骨細(xì)胞特殊染色技術(shù)的比較與應(yīng)用

于　斐，曾　暉，于紅燕，雷　鳴，袁　昊，肖德明

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳 廣東　518036；2.濱州市濱城區(qū)市立醫(yī)院，濱州 山東　256600)

軟骨細(xì)胞特殊染色技術(shù)的比較與應(yīng)用

于斐1，曾暉1，于紅燕2，雷鳴1，袁昊1，肖德明1

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳 廣東518036；2.濱州市濱城區(qū)市立醫(yī)院，濱州 山東256600)

【摘要】目的探討多種特殊染色技術(shù)在軟骨細(xì)胞中的染色規(guī)律及其應(yīng)用價值。方法選取出生7 d內(nèi)的C57BL/6J小鼠12只，處死后取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨行軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)，并行II型膠原免疫熒光鑒定，取5代以內(nèi)的原代細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，細(xì)胞爬片制備完成后行HE染色、番紅O-固綠雙染色、SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色及II型膠原免疫組化染色，觀察軟骨細(xì)胞組織形態(tài)變化，并對幾種染色方式進行比較。結(jié)果HE染色中細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚；番紅O-固綠雙染色中細(xì)胞核呈粉紅色，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)綠色，細(xì)胞形態(tài)結(jié)果較清晰；SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色時，衰老軟骨細(xì)胞呈綠色，未衰老細(xì)胞無著色；II型膠原免疫組化染色時，II型膠原呈棕黃色，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色。結(jié)論HE染色和番紅O-固綠雙染色可以清晰分辨細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對單個細(xì)胞形態(tài)的顯示比較清楚；SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色可以顯示出衰老細(xì)胞的數(shù)量及衰老的程度；II型膠原免疫組化染色可以對II型膠原進行定位與定量。

【關(guān)鍵詞】軟骨細(xì)胞，特殊染色，細(xì)胞爬片，原代細(xì)胞，膝關(guān)節(jié)

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制及治療措施的研究中經(jīng)常用到細(xì)胞學(xué)水平的研究，觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)成為實驗中的一種重要的方法。在過去的研究中[1-3]，人們對軟骨大體標(biāo)本的特殊染色技術(shù)已經(jīng)進行了大量的改良，并應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的研究中，取得了良好的效果，但是對于軟骨細(xì)胞水平的染色技術(shù)發(fā)展緩慢，以至于無法用簡便的方法對細(xì)胞形態(tài)進行觀察，對研究造成了不便。本研究利用C57BL/6J小鼠進行軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)，對軟骨細(xì)胞爬片進行HE染色、番紅O-固綠雙染色、SA-β半染糖苷酶衰老染色及II型膠原免疫組化染色，探討這幾種染色技術(shù)在軟骨細(xì)胞爬片中的染色規(guī)律及應(yīng)用價值，為骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞水平研究提供便利的條件。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物及實驗環(huán)境: 出生7 d內(nèi)的健康SPF級C57BL/6J小鼠12只【動物合格證號：No:44007200018611】，雌雄不限，體重(4±1) g，實驗用小鼠夠購買自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心【生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002；使用許可證號：zSYYX(粵)2013-0002】，飼養(yǎng)于北京大學(xué)/香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心深圳醫(yī)院實驗動物中心【使用許可證號：SYXK(粵)2010-0106】SPF級屏障區(qū)域的PVC鼠籠內(nèi)，持續(xù)過濾通氣，自由飲食，清潔飲水，每日保持12 h光照/黑暗循環(huán)。實驗流程和小鼠處理均遵循實驗動物管理規(guī)范條例。

1.1.2實驗儀器: 高壓滅菌器(日本Hirayama公司)，用于實驗材料的滅菌；電熱鼓風(fēng)干燥箱(中國精宏公司)，用于滅菌材料的干燥；純水機(美國Millipore公司)，用于試劑配制；恒溫水浴鍋(上海百典儀器設(shè)備有限公司)，用于試劑復(fù)溫；生物潔凈工作臺(中國蘇凈公司)，用于實驗操作；微量移液槍(Thermo fisher)，用于試劑配制及細(xì)胞培養(yǎng)；高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，用于細(xì)胞離心；培養(yǎng)箱(德國Themo公司)，用于細(xì)胞培養(yǎng)；光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)，用于細(xì)胞觀察及拍照。

1.1.3實驗試劑: II型膠原一抗、goat anti-rabbit IgG H&L (Cy3 ?) preadsorbed 9購自Abcam公司，生物素化兔抗山羊IgG、SABC-POD、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，fast green solution、safranin O solution購自Scytek公司，細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天公司，Collagenase、胰酶購自Worthington公司，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，青/鏈霉素溶液購自伊科賽公司，胎牛血清購自Life公司，0.4%臺盼藍(lán)溶液購自廣州晶欣公司，二甲苯、無水乙醇、30% H2O2購自廣州化學(xué)試劑廠，蘇木素購自廣州速聚生物有限公司，中性樹膠購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，伊紅Y購自行知生物科技有限公司。

1.1.4試劑配制: 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液：改良型RPMI-1640培養(yǎng)基 90 mL，胎牛血清 10 mL；4% II型膠原酶消化液：collagenase粉末 4 g, PBS 96 mL。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng): 取出生7 d以內(nèi)的C57BL/6J小鼠12只，全部實驗動物氣管窒息法處死，置于75%酒精中浸泡5 min，取出小鼠用碘伏消毒膝關(guān)節(jié)處；PBS漂洗3遍各3 min；將組織塊剪切成 1 mm3；加入含有雙抗的4% II型膠原酶中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化4 h；充分吹打細(xì)胞消化液，200目過濾收集濾液；1 500 r/min離心5 min，無菌PBS清洗并離心2次；棄上清液加入6 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種至培養(yǎng)瓶中；于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，1∶3比例傳代，取3代以內(nèi)的細(xì)胞進行實驗。

1.2.2軟骨細(xì)胞爬片的制作： 準(zhǔn)備多聚賴氨酸溶液浸泡后的24孔板大小的蓋玻片于超凈臺中晾干；5代以內(nèi)的軟骨原代細(xì)胞消化后臺盼藍(lán)計數(shù)，配制成1×105/mL細(xì)胞懸液；24孔板中加入少許培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液均勻滴到玻片上；常規(guī)培養(yǎng)6 h等到細(xì)胞貼壁后，再滴加培養(yǎng)基布滿整個板底，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

1.2.3軟骨細(xì)胞的鑒定： 將分離取得的細(xì)胞1×105接種到細(xì)胞爬片，靜止貼壁；吸去上清培養(yǎng)基；孵育一抗，anti-collagen II antibody，37℃，1 h；PBS輕微洗滌3次；孵育goat anti-rabbit-Cy3，37℃ 1 h；PBS輕微洗滌3次；孵育Hoechst 33258，室溫15 min。

1.2.4細(xì)胞爬片的HE染色： 4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片20 min，流水沖洗3次各2 min，蘇木素滴染2 min, 自來水返藍(lán)2 min，80%酒精急洗，伊紅滴染30 s。

1.2.5細(xì)胞爬片的番紅O-固綠雙染色： 4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片20 min，流水沖洗2 min ×3，蘇木素染核2 min，自來水返藍(lán)2 min，番紅O染液滴染30 min，95%乙醇分化10 s，自來水洗10 s，60℃預(yù)熱固綠滴染1 min，蒸餾水急洗一次，番紅O染液復(fù)染30 min，95% 乙醇分化5 s，自來水沖洗10 s。

1.2.6細(xì)胞爬片的SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色： ①染色工作液根據(jù)碧云天細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書配制：β-半乳糖苷酶染色液A 10 μL，β-半乳糖苷酶染色液B 10 μL，β-半乳糖苷酶染色液C 930 μL，X-Gal溶液50 μL，混合均勻。②β-半乳糖苷酶染色固定液固定30 min，PBS洗5 min ×3，染色工作液覆蓋爬片37℃過夜。

1.2.7細(xì)胞爬片的II型膠原免疫組化染色： 4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片20 min，流水沖洗2 min ×3；烤片3 min；蒸餾水沖洗2次；抗原修復(fù)； PBS沖洗3次；滴加過氧化物酶阻斷劑；PBS液沖洗3次；滴加非免疫性動物血清；滴加II型膠原一抗；PBS液沖洗3次；滴加生物素標(biāo)記的二抗；滴加SP溶液；滴加2滴新鮮配制的DAB溶液。

2結(jié)果

幾種特殊染色方法觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)比較見表1。

2.1倒置顯微鏡下軟骨細(xì)胞形態(tài)

常規(guī)消化細(xì)胞，并用含10% FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，分別與0、3、7 d于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)(圖1見彩插6)。0 d軟骨細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)瓶底，處于待貼壁狀態(tài)；3 d軟骨細(xì)胞完全貼壁，呈梭形、三角形或多角形；7 d軟骨細(xì)胞融合，鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底。

2.2II型膠原免疫熒光鑒定軟骨細(xì)胞

II型膠原是軟骨細(xì)胞分泌的特異性膠原，可利用II型膠原的免疫熒光對軟骨細(xì)胞進行鑒定。熒光標(biāo)記后，軟骨細(xì)胞細(xì)胞核呈圓形紫藍(lán)色熒光，II型膠原呈條帶狀紅色熒光(圖2見彩插6)。

2.3HE染色觀察軟骨細(xì)胞

蘇木素可與核酸等酸性物質(zhì)結(jié)合顯示藍(lán)色，而伊紅可與堿性蛋白物質(zhì)結(jié)合顯示出紅色，進而將細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)區(qū)分開來。染色后我們可以看到軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色，為圓形或者卵圓形，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，三角形或梭形(圖3見彩插6)。

2.4番紅O-固綠雙染色觀察軟骨細(xì)胞

番紅O是堿性染料可與核酸結(jié)合顯示紅色，固綠是酸性染料可與蛋白結(jié)合將顯示藍(lán)色或者綠色。染色后我們可以看到細(xì)胞核呈粉紅色，但部分顏色被細(xì)胞質(zhì)染色所覆蓋，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)綠色(圖4見彩插6)。

2.5SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色觀察軟骨細(xì)胞

細(xì)胞衰老后，溶酶體中β半乳糖苷酶的表達(dá)升高，表達(dá)量越高，細(xì)胞所染顏色越重，衰老程度也越嚴(yán)重。染色后我們能夠清楚的看到細(xì)胞質(zhì)綠染且顏色深淺不一，細(xì)胞核無法辨別(圖5見彩插6)。

2.6II型膠原免疫組化染色觀察軟骨細(xì)胞

II型膠原免疫組化染色可以特異性的定位II型膠原的位置，蘇木素復(fù)染后可以顯示細(xì)胞核的位置。染色后我們可以看到II膠原表達(dá)出呈現(xiàn)棕黃色，而細(xì)胞核呈現(xiàn)紫色(圖6見彩插6)。

表1　幾種特殊染色方法觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

注：“-”為陰性，“+”為陽性且“+”至“++++”陽性程度越高，分辨越明顯。

Note. “-” is negative, “+” is positive ,“+”to“++++” represent the increasing levels of positive staining and better resolution

3討論

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞，被包埋在軟骨基質(zhì)中，它可以感受機體周圍的變化，維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡，其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)主要是糖蛋白和II型膠原[4]。軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核較小，呈圓形或卵圓形，有一到數(shù)個核仁，細(xì)胞可呈三角形、梭形或多角形。在軟骨組織中，越靠近周邊的軟骨細(xì)胞越幼稚，常單個分布；越靠近中央的軟骨細(xì)胞越成熟，常多個聚集在一起[5]。骨關(guān)節(jié)炎(OA)與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的衰老和凋亡密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為進行性的軟骨關(guān)節(jié)破壞，本質(zhì)上是一種生物學(xué)重建過程[6]。隨著我國老齡化進程的加劇，該病已經(jīng)成為影響老年人健康的主要慢性退行性病變之一，但是對其發(fā)病機制仍然知之甚少，因此對該病的研究成為近年來的熱點。

目前對于動物標(biāo)本的特殊染色技術(shù)發(fā)展較快，在骨關(guān)節(jié)炎領(lǐng)域的研究中應(yīng)用廣泛。細(xì)胞學(xué)水平的研究與動物水平的研究同等重要，但是細(xì)胞染色技術(shù)發(fā)展較慢，在骨關(guān)節(jié)炎研究領(lǐng)域應(yīng)用較少，這一方面是因為細(xì)胞染色與組織標(biāo)本相比染色困難，另一方面是由于電鏡等技術(shù)的發(fā)展代替了染色對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察。但是，對于軟骨細(xì)胞的特殊染色仍有其優(yōu)點，比如操作簡便、價格低廉、不需要特殊的儀器設(shè)備等，這對于沒有電鏡等特殊設(shè)備的實驗室仍然是一個好的選擇。

本課題組在進行骨關(guān)節(jié)炎的研究過程中，根據(jù)研究的需要對軟骨細(xì)胞的HE染色、番紅O-固綠雙染色、SA-β-半乳糖苷酶衰老染色和II型膠原免疫組化染色條件進行了探究，取得了良好的效果。

蘇木素-伊紅染色技術(shù)是病理技術(shù)中最經(jīng)典的染色方法，是由Waldeyer于1863年首先提出來的，一直沿用至今。常規(guī)的HE染色是根據(jù)蘇木素和伊紅兩種染料對酸堿性物質(zhì)的親和性不同而著色，蘇木素可與核酸等酸性物質(zhì)結(jié)合，從而使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，而伊紅可以與細(xì)胞質(zhì)中的堿性蛋白物質(zhì)結(jié)合，顯示出紅色，進而將細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)區(qū)分開來[7]。我們可以看到，在軟骨細(xì)胞爬片的HE染色中，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，單個細(xì)胞的輪廓也清晰可辨，是一種觀察細(xì)胞形態(tài)較好的染色方式。

番紅O-固綠雙染色中，番紅O是堿性染料可與核酸結(jié)合將細(xì)胞核紅染，固綠是酸性染料可與蛋白結(jié)合將細(xì)胞核染成藍(lán)色或者綠色[8]。在軟骨細(xì)胞爬片中，可以分辨出細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但分辨率不如HE染色清楚，這種分辨情況與軟骨組織中兩種染色的分辨情況正好相反，這可能是由于固綠與番紅O相比更容易著色，而綠色可以覆蓋部分紅色使得結(jié)構(gòu)相對不太清晰。但是，該染色在軟骨細(xì)胞或軟骨組織中是一種特異性的染色，其使用率較高，通過我們在軟骨細(xì)胞爬片上的實驗也得到了預(yù)期的效果，可以在軟骨細(xì)胞中加以應(yīng)用。

β-半乳糖苷酶是檢驗細(xì)胞衰老的一種特異性的標(biāo)志酶，由Dimri等[9]在1995年首次提出，衰老軟骨細(xì)胞在pH 6.0時會表現(xiàn)出溶酶體β-半乳糖苷酶活性的升高，衰老的軟骨細(xì)胞可以表達(dá)此酶，通過對不同階段的軟骨細(xì)胞的衰老染色情況進行分析，可以得到軟骨細(xì)胞的衰老情況，從而確定不同狀態(tài)下軟骨細(xì)胞老化的速度及程度[10]。通過實驗結(jié)果我們可以看到，由于β-半乳糖苷酶表達(dá)量的升高，細(xì)胞質(zhì)被染成綠色，并且當(dāng)細(xì)胞衰老程度越嚴(yán)重時，綠色越明顯，而未衰老的細(xì)胞則無此染色。該染色在反應(yīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)方面不清楚，無法分辨細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。

II型膠原是軟骨細(xì)胞分泌的特異性物質(zhì)，通過II型膠原免疫組化染色可以對軟骨細(xì)胞進行特異性的定位，對II型膠原的分布及定量作用明顯，通過蘇木素的復(fù)染，可以分辨其余細(xì)胞，作用很大。我們通過染色發(fā)現(xiàn)，II型膠原表達(dá)處呈現(xiàn)棕黃色，而通過蘇木素的復(fù)染，細(xì)胞核呈紫色，從而清晰的分辨出細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。由于II膠原只是細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)中的部分成份，該染色無法顯示細(xì)胞質(zhì)中的其他成份，所以單個細(xì)胞的形態(tài)不是很清楚。該染色在II型膠原特異性的定位及定量作用比較明顯。

綜上所述，各種染色方法各有優(yōu)缺點，但在軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察方面，HE染色和番紅O-固綠雙染色分辨細(xì)胞比較清楚，可以獲得更加全面的信息，尤其以HE染色最佳；SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色對于衰老軟骨細(xì)胞的數(shù)量及軟骨細(xì)胞衰老程度的檢測用處較大；II型膠原免疫組化染色則可以用于II型膠原的定位與定量。我們在使用軟骨細(xì)胞進行研究時，可以綜合采用多種染色方法。

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〔修回日期〕2015-07-12

研究報告

Comparison of different special staining techniques of

chondrocytes and their application values

YU Fei1, ZENG Hui1, YU Hong-yan2, LEI Ming1, YUAN Hao1, XIAO De-ming1

(1. Peking University Shenzhen Hospital, Guangdong Shenzhen 518036, China;

2. Municipal Hospital of Binzhou, Shandong Binzhou 256600)

【Abstract】ObjectiveTo compare the advantages and values of several special staining methods of chondrocytes.MethodsTwelve 7-day old healthy C57BL/6J mice were killed to obtain the cartilage tissue of the knee joint in order to isolate the chondrycytes. Type II collagen was used to assess the chondrocytes. Then the chondrocyte climbing slices were prepared. The materials were fixed, and HE staining, Safranin O-fast green staining, SA-β-gal staining and immunohistochemical staining of Type II collagen were performed and compared. ResultsHE staining showed clear morphology of the chondrocytes. The cell nuclei were stained blue and the cytoplasm was pink. Safranin O-fast green staining showed that the nuclei were pink and the cytoplasm green. SA-β-gal staining showed that the aging cells were green while the young cells were colorless. Immunohistochemical staining of type II collagen showed the distribution of type II collagen and they were stained brown while the cell nuclei were blue.ConclusionsHE staining and safranin O-fast green staining can provide more information than the other staining techniques. SA-β-gal staining is useful in the analysis of aging chondrocytes. Immunohistochemical of type II collagen can be used to study type II collagen.

【Key words】Chondrocytes, special staining; Cell climbing slices; Primary cells; Knee joint, mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.012

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0058-04

[通訊作者]肖德明 (1956-)，男，博士生導(dǎo)師、教授、主任醫(yī)師。研究方向：骨關(guān)節(jié)炎、骨科生物材料。E-mail: xiaodm1@163.com。

[作者簡介]于斐 (1989-)，男，碩士研究生。研究方向：骨關(guān)節(jié)炎、骨科生物材料。E-mail: ocarfyu@163.com。

[基金項目]國家自然科學(xué)基金面上項目(項目編號：81272032)；深圳市科工貿(mào)與信息委員會重點項目(項目編號：201101001)；深圳市科創(chuàng)委資助項目(項目編號：JCY20130402114702130)。