培養(yǎng)法和PCR法用于實(shí)驗(yàn)大、小鼠細(xì)菌檢測(cè)的比較分析

馮　潔，謝建云，馮麗萍，魏曉鋒，高　誠(chéng)

(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上?！?01203)

培養(yǎng)法和PCR法用于實(shí)驗(yàn)大、小鼠細(xì)菌檢測(cè)的比較分析

馮潔，謝建云，馮麗萍，魏曉鋒，高誠(chéng)

(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海201203)

【摘要】目的比較培養(yǎng)法和PCR法對(duì)實(shí)驗(yàn)大、小鼠的細(xì)菌檢測(cè)效果。方法分別采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)合生化鑒定方法和PCR方法，對(duì)78只SPF級(jí)大鼠和422只SPF級(jí)小鼠進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果78只SPF級(jí)大鼠均未檢測(cè)出陽(yáng)性。422只SPF級(jí)小鼠，培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性率7.11%(30/422)，其中金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌22只，肺炎克雷伯桿菌2只。PCR法檢測(cè)陽(yáng)性率7.58%(32/422)，其中金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌25只，肺炎克雷伯桿菌2只。結(jié)論P(yáng)CR法的敏感性高于培養(yǎng)法，操作簡(jiǎn)便、快捷，適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌的快速診斷和大規(guī)模的質(zhì)量篩查。

【關(guān)鍵詞】培養(yǎng)法；PCR法；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；細(xì)菌

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌這3種細(xì)菌均屬于條件性致病菌，廣泛分布于自然界，正常情況下不會(huì)導(dǎo)致人和動(dòng)物的臨床癥狀和疾病發(fā)生，但在免疫功能低下、定居部位改變或失調(diào)等特定情況下可引起機(jī)體的感染。這類(lèi)細(xì)菌主要通過(guò)接觸和空氣傳播，以潛伏感染為主，對(duì)于免疫系統(tǒng)受損的宿主，常表現(xiàn)為感染、炎癥甚至死亡[1-3]，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果均造成影響。我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)及監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T14922.2-2011明確規(guī)定，無(wú)特定病原體級(jí)(specific pathogen free，SPF)實(shí)驗(yàn)大、小鼠必須檢測(cè)和排除上述3個(gè)項(xiàng)目。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等條件性致病菌的陽(yáng)性率屢見(jiàn)不鮮[4-6]。國(guó)標(biāo)推薦的檢測(cè)方法為經(jīng)典的分離培養(yǎng)法，也是微生物診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但鑒于培養(yǎng)法存在耗時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣、結(jié)果受檢測(cè)人員主觀判定干擾較大等多方面原因，本實(shí)驗(yàn)室嘗試建立金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌3重PCR檢測(cè)方法，并與國(guó)標(biāo)推薦的分離培養(yǎng)法進(jìn)行比對(duì)，以探索PCR方法作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌快速檢測(cè)方法的可行性。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物：所有檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠均為SPF級(jí)，來(lái)自上海10家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位。

1.1.2菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、綠膿桿菌ATCC 27853購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，肺炎克雷伯桿菌CMCC 46117購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3主要試劑：血瓊脂平皿、營(yíng)養(yǎng)肉湯、NAC培養(yǎng)基、革蘭氏染液、細(xì)菌生化鑒定管、瓊脂粉均購(gòu)自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司，高鹽甘露醇平皿、DHL平皿均購(gòu)自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶、PCR buffer、Mg2+、2× Taq Plus Master Mix(Dye Plus)、DL2000 plus DNA marker均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，瓊脂糖購(gòu)自西班牙Bio-West公司，GoldViewTM核酸染料購(gòu)自上海賽百盛(SBS)基因技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)法檢測(cè)：按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14926-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)檢測(cè)方法(1)(2)》進(jìn)行金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌的常規(guī)分離培養(yǎng)、鑒定。無(wú)菌采集動(dòng)物回盲部?jī)?nèi)容物，分別接種至高鹽甘露醇平皿、NAC增菌液和DHL平皿，36℃培養(yǎng)(24～48)h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。若有可疑樣品則按國(guó)標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟繼續(xù)進(jìn)行下一步純化和鑒定工作。

1.2.2DNA提?。喝∩鲜龌孛げ?jī)?nèi)容物0.2 g，懸浮于1 mL的PBS(pH 7.4)中，850 r/min離心5 min后取上清液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，提取DNA模板，用于PCR檢測(cè)。獲得DNA樣品于-20℃ 保存。

1.2.3PCR法檢測(cè)：采用本單位已建立好的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌3重PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)[7-9]。引物序列見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體系50 μL，包括2× Taq Plus Master Mix (Dye Plus) 25 μL，其中Mg2+終濃度為2.5 mmol/L，dNTP終濃度為200 μmol/L，引物各0.2 μmol/L。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min后，按95℃ 變性30 s，57℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s的程序循環(huán)34次，最后72℃ 延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，經(jīng)凝膠電泳純化回收后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知核酸序列進(jìn)行BLAST。

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果

采用培養(yǎng)法對(duì)422只SPF級(jí)小鼠、78只SPF級(jí)大鼠進(jìn)行檢測(cè)，共檢出30只陽(yáng)性動(dòng)物(7.11%)，均為小鼠。其中檢出金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌22只，肺炎克雷伯桿菌2只。 其中有4只動(dòng)物檢測(cè)結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均為陽(yáng)性。

2.2PCR法檢測(cè)結(jié)果

對(duì)上述動(dòng)物同時(shí)進(jìn)行金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌3重PCR檢測(cè)，共檢出32只陽(yáng)性動(dòng)物(7.58%)，均為小鼠。其中檢出金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌25只，肺炎克雷伯桿菌2只。對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序后，與GenBank發(fā)表的序列進(jìn)行比對(duì)，同源性均可達(dá)98%以上。其中有5只動(dòng)物金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均為陽(yáng)性。

2.3培養(yǎng)法與PCR法檢測(cè)結(jié)果比較

被檢動(dòng)物的品系和檢測(cè)結(jié)果詳情見(jiàn)表2。培養(yǎng)法檢測(cè)出陽(yáng)性樣品30只，PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性樣品32只。培養(yǎng)法分別檢測(cè)金黃色葡萄球菌10只、綠膿桿菌22只、肺炎克雷伯桿菌2只；PCR方法分別檢測(cè)金黃色葡萄球菌10只、綠膿桿菌25只、肺炎克雷伯桿菌2只。其中有1例金黃色葡萄球菌和3例綠膿桿菌經(jīng)培養(yǎng)法檢測(cè)為陰性，但PCR檢測(cè)為陽(yáng)性。有1例經(jīng)培養(yǎng)法檢測(cè)金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性，但PCR法未能檢出。

表1　PCR引物列表

表2　被檢動(dòng)物品系及檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌質(zhì)量控制是評(píng)價(jià)動(dòng)物質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)之一。細(xì)菌感染對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身的生長(zhǎng)發(fā)育、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)使用、科學(xué)研究的結(jié)果以及從業(yè)人員和環(huán)境均能造成不同程度的影響。因此，開(kāi)發(fā)新型檢測(cè)手段無(wú)論從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制還是從生物安全的角度都顯得尤為必要。

目前細(xì)菌檢測(cè)的方法一般包括分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)抗體、抗原以及核酸檢測(cè)方法等[10,11]。細(xì)菌分離培養(yǎng)被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，也是最為常用的方法。我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)標(biāo)推薦的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌檢測(cè)，采用的就是分離培養(yǎng)法。該方法根據(jù)細(xì)菌生物學(xué)特性、表型特征進(jìn)行鑒定，經(jīng)典、準(zhǔn)確，但存在操作繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、效率較低等缺陷，受檢測(cè)試劑、檢測(cè)程序、軟硬件等多因素限制，易造成檢測(cè)結(jié)果的偏離。分子生物學(xué)技術(shù)則是針對(duì)細(xì)菌的特異性DNA進(jìn)行檢測(cè)，因具有敏感、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用，我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科研工作者已陸續(xù)開(kāi)發(fā)了多種病原體的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)[12,13]。多重PCR是以普通PCR為基礎(chǔ)，同時(shí)加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，從而達(dá)到快速高效的一種新型手段[14-16]。但PCR方法也存在易污染、易出現(xiàn)假陽(yáng)性、產(chǎn)物需經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證等缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)加以規(guī)避。

本研究針對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌同時(shí)開(kāi)展了培養(yǎng)法和PCR法檢測(cè)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，PCR法檢出率略高于培養(yǎng)法，在實(shí)際操作過(guò)程中采用國(guó)標(biāo)推薦的分離培養(yǎng)法，全程至少需要3～7 d時(shí)間，而PCR法僅需1 d時(shí)間即可完成。因此PCR方法在效率和敏感性上都具有較大優(yōu)勢(shì)，適合用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌感染的快速診斷和大規(guī)模的質(zhì)量篩查。但值得注意的是，PCR產(chǎn)物易造成對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)，因此在操作過(guò)程中應(yīng)盡量避免。

理論上講培養(yǎng)法檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣品，PCR法檢測(cè)應(yīng)均能檢出。但本研究中有1例樣品經(jīng)培養(yǎng)法檢測(cè)金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性，但PCR法檢測(cè)為陰性。這一現(xiàn)象在其他類(lèi)似文獻(xiàn)報(bào)道中也出現(xiàn)過(guò)[17]，我們認(rèn)為原因可能是樣品DNA提取失敗，以后的PCR檢測(cè)過(guò)程中可考慮加入質(zhì)控引物，以評(píng)估被檢樣品的DNA模板質(zhì)量是否合格。

綜上，分離培養(yǎng)法和PCR法均能用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌檢測(cè)，應(yīng)將兩者結(jié)合，以達(dá)到準(zhǔn)確、高效的目的。對(duì)少量樣品進(jìn)行感染診斷，采用分離培養(yǎng)法較為合適。當(dāng)出現(xiàn)動(dòng)物疫情爆發(fā)需要快速診斷或進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時(shí)可采用PCR結(jié)合測(cè)序法進(jìn)行篩查。

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〔修回日期〕2015-06-17

研究報(bào)告

Comparison of culture and PCR assays for detection of

bacteria in laboratory rats and mice

FENG Jie, XIE Jian-yun, FENG Li-ping, WEI Xiao-feng, GAO Cheng

(Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai Quality Monitoring Center of

Laboratory Animals, Shanghai 201203, China)

【Abstract】ObjectiveTo compare the efficiency of bacteria culture and PCR assays for detection of Staphylococcusaureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) in laboratory rats and mice. Methods Bacteria culture combined with biochemical identification and PCR assay were used to detect 78 SPF rats and 422 SPF mice and the results of the two methods were compared. Results All the 78 rats were negative. Of the 422 mice, the positive rate by culture was 7.11% (30/422), of which, 10 were S. aureus, 22 were P. aeruginosa, and 2 were K. pneumoniae. The positive rate by PCR was 7.58% (32/422), of which, 10 were S. aureus, 25 were P. aeruginosa, and 2 were K. pneumoniae.ConclusionsThe high sensitivity, rapid procedure and easy to operate of PCR assay makes it valuable for rapid bacteria diagnosis and large-scale screening in laboratory animals.

【Key words】Culture; PCR; Laboratory animals; Bacteria; Staphylococcus aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) Rats; Mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.005

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 08-0023-04

[作者簡(jiǎn)介]馮潔(1981-)，女，碩士，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制，E-mail： moyifj@163.com。

[基金項(xiàng)目]上海市科委基金項(xiàng)目(12140900500、14140900600)。