改良超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3

改良超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3

禹松林1，方慧玲1，張瑞蘋2，程歆琦1，韓建華1，蘇薇1，

程倩1，侯立安1，姜小梅3，邱玲1

(1. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.中日友好醫(yī)院檢驗科，

北京 100029；3.美國AB SCIEX公司北京代表處，北京 100015)

摘要：目的建立可同時區(qū)分3-epi 25-羥基維生素D3[3-epi 25(OH)D3]、25-羥基維生素D3[25(OH)D3]和25-羥基維生素D2[25(OH)D2]的改良超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)。方法采用甲醇、硫酸鋅沉淀蛋白，以穩(wěn)定同位素為內(nèi)標，正己烷提取，色譜采用甲醇和水以一定比例進行梯度洗脫，質(zhì)譜采用正離子條件下多離子反應(yīng)監(jiān)測模式，3-epi 25(OH)D3和25(OH)D3的定量離子通道質(zhì)荷比(mass to charge, m/z)均為413.3→395.3，25(OH)D2的m/z為401.4→383.4；同位素內(nèi)標25(OH)D2-d3和25(OH)D3-d3的m/z分別為416.3→398.3和404.4→386.4。25(OH)D3和25(OH)D2分別以各自的標準品和同位素內(nèi)標制作標準曲線；3-epi 25(OH)D3采用25(OH)D3的標準曲線和內(nèi)標。評價方法的線性、精密度和準確度等，同時用本法和常規(guī)UPLC-MS/MS測定307例臨床樣本，考察方法的一致性，判別3-epi 25(OH)D3對常規(guī)UPLC-MS/MS測定結(jié)果的影響。結(jié)果本法可在13 min內(nèi)將3-epi 25(OH)D3、25(OH)D3和25(OH)D2完全區(qū)分開，3種物質(zhì)互不干擾，線性相關(guān)系數(shù)(r)>0.999， 25(OH)D3總變異參數(shù)(CV)的均值(范圍)為2.82%(2.45%～3.21%)，批內(nèi)CV為1.82%(1.76%～1.91%)；25(OH)D2總CV的均值(范圍)為4.34%(2.88%～7.01%)，批內(nèi)CV為2.62%(1.91%～3.66%)。25(OH)D2、25(OH)D3和3-epi 25(OH)D3的準確度分別104.5%～106.8%、98.9%～106.9%、108.0%～109.9%。隨機測定307例臨床樣本，結(jié)果顯示樣本3-epi 25(OH)D3濃度均在3.0 ng/mL以下，本法和常規(guī)UPLC-MS/MS分析25-羥基維生素D[25(OH)D]的結(jié)果分別為15.53±8.58和(15.98±9.08)ng/mL，偏差為-0.46 ng/mL，百分偏差為-2.44%，2種方法的結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(t=0.631，P=0.53)，R`2=0.978。用本法測定得到的維生素D不足、缺乏和充足率分別為76.9%、14.3%、8.8%，常規(guī)法的結(jié)果分別為75.6%、15.3%、9.1%，2種方法對臨床判定的一致率達94.1%，3-epi 25(OH)D3對臨床常規(guī)UPLC-MS/MS基本無影響。結(jié)論成功建立了可同時區(qū)分3-epi 25(OH)D3、25(OH)D3和25(OH)D2的改良UPLC-MS/MS，該法準確、特異，為評價臨床常規(guī)UPLC-MS/MS及自動化免疫分析25(OH)D的方法提供了方法學基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：25-羥基維生素D；3-epi 25-羥基維生素D3；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)10-1021-06R446.1

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.014

基金項目：國家“863”計劃資助項目(2014AA022304)；國家自然科學基金資助項目(81201337、81171665)；國家臨床重點專科資助項目

作者簡介：禹松林，男，1986年生，碩士，實習研究員，主要研究領(lǐng)域為色譜質(zhì)譜技術(shù)在臨床中的應(yīng)用。

通訊作者：邱玲，聯(lián)系電話：010-69159707。

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determinations of serum 3-epi 25-hydroxyvitamin D3 [3-epi 25(OH)D3], 25-hydroxyvitamin D3 [25(OH)D3] and 25-hydroxyvitamin D2 [25(OH)D2] by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). MethodsSerum samples were mixed with internal standard [25(OH)D2-d3 and 25(OH)D3-d3] and treated with methanol and ZnSO4 solution to precipitate protein, and then extracted with hexane. Gradient elution with methanol and water was used in chromatography, and chromatography system was in the positive electro-spray ionization mode and multiple reaction monitor mode, and the transitions used for each analyte were: 3-epi 25(OH)D3 to 25(OH)D3 mass to charge (m/z) 413.3→395.3，3-epi 25(OH)D3 to 25(OH)D2 m/z 401.4→383.4, 25 (OH)D2-d3 m/z 416.3→398.3 and 25(OH)D3- d3 m/z 404.4→386.4. 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were quantified by internal standard and standard curves. The quantification of 3-epi 25(OH)D3 used the same internal standard and standard curves as 25(OH)D3. The linearity, precision and accuracy were evaluated. A total of 307 samples were determined by this method and routine UPLC-MS/MS established early to evaluate consistency and the influence of 3-epi 25(OH)D3 on routine UPLC-MS/MS. ResultsBy this method, serum 3-epi 25(OH)D3 , 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were separated and quantified in 13 min. The linearity correlation coefficients(r) were > 0.999. The total and within-run coefficients of variation (CV) of 25(OH)D3 were 2.82%(2.45%-3.21%) and 1.82%(1.76%-1.91%). For 25(OH)D2, they were 4.34%(2.88%-7.01%) and 2.62%(1.91%-3.66%). The accuracies of 25(OH)D2, 25(OH)D3 and 3-epi 25(OH)D3 were 104.5%-106.8%， 98.9%-106.9% and 108.0%-109.9%, respectively. In all the 307 patients, the concentration of 3-epi 25(OH)D3 was less than 3 ng/mL. The means of this method and routine UPLC-MS/MS for 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D] were 15.53±8.58 and (15.98 ±9.08) ng/mL, respectively， with a bias of -0.46 ng/mL, and bias% of -2.44%， and there was no statistical significance between the 2 methods(t=0.631， P=0.53). R`2 was 0.978. The rates of vitamin D deficiency, insufficiency and sufficiency were 76.9%, 14.3% and 8.8% by this method, respectively, and the rates for routine UPLC-MS/MS were 75.6%, 15.3% and 9.1%. The consistency of the 2 methods was 94.1%. There was no influence of 3-epi 25(OH)D3 on clinical routine UPLC-MS/MS. ConclusionsThe established UPLC-MS/MS can separate serum 3-epi 25(OH)D3, 25(OH)D2 and 25(OH)D3 . It is accurate and specific, and it provides a reference method for the evaluation of routine UPLC-MS/MS and automated immunoassays for determining 25(OH)D.

收稿日期：(2015-01-28)

Improved method for the determination of serum 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometryYUSonglin1,FANGHuiling1,ZHANGRuiping2,CHENGXinqi1,HANJianhua1,SUWei1,CHENGQian1,HOULi′an1,JIANGXiaomei3,QIULing1.(1.DepartmentofClinicalLaboratory，PekingUnionMedicalCollegeHospital，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100730，China； 2.DepartmentofClinicalLaboratory,China-JapanFriendshipHospital，Beijing100029，China； 3.ABSCIEXInc.BeijingRepresentativeOffice，Beijing100015，China)

Key words: 25-hydroxyvitamin D；3-epi 25-hydroxyvitamin D3；Liquid chromatography tandem mass spectrometry

目前，維生素D不僅被認為是一種維生素，還被認為是一種激素，與心血管疾病、腫瘤、糖尿病等有關(guān)[1-4]。維生素D在體內(nèi)主要以維生素D2和維生素D3兩種形式存在，前者主要來源于植物性食物及補充劑，后者則主要來源于動物性膳食及紫外線照射自身合成。這兩種形式的維生素D經(jīng)血液循環(huán)進入肝臟后在維生素D 25-羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的25-羥基維生素D2[25-hydroxyvitamin D2，25(OH)D2]和25-羥基維生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25(OH)D3]，總稱25-羥基維生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D][5-6]。25(OH)D半衰期較長，比較穩(wěn)定，且體內(nèi)含量相對較高，是監(jiān)測體內(nèi)維生素D營養(yǎng)狀況的最佳指標[5]。但人體內(nèi)還存在25(OH)D3的差向異構(gòu)體——3-epi 25(OH)D3，與25(OH)D3僅有一個羥基鍵方向上的差異。有研究顯示，3-epi 25(OH)D3在部分人體內(nèi)含量較高，但是其生物學活性目前還不清楚，其可能不具有25(OH)D3的生物學作用，但由于其影響，可能會高估25(OH)D的含量[7-8]。采用質(zhì)譜法測定25(OH)D具有準確、可靠的特點，本實驗室之前已建立了快速測定25(OH)D2和25(OH)D3的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)[9]，但是該法尚無法區(qū)分測定3-epi 25(OH)D3。鑒于3-epi 25(OH)D3的生物學效應(yīng)尚不完全清楚，目前國際采用的測定25(OH)D的候選參考方法建議將其區(qū)分[10-11]。我們旨在前期研究基礎(chǔ)之上，通過方法改進，實現(xiàn)對3-epi 25(OH)D3、25(OH)D3和25(OH)D2的區(qū)分測定。

材料和方法

一、儀器、試劑和血清樣品

本研究使用的主要儀器和試劑同文獻[9]，另外新增標準品3-epi 25(OH)D3(美國Sigma公司，純度為98%)，phenomenex色譜柱(100 mm×3 mm，2.6 μm )。

所用血清樣品為北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科2014年3月至4月之間進行維生素D檢測的患者血清樣本。

二、方法

參考文獻1. 標準品和樣本制備同[9]。

3. 色譜質(zhì)譜條件采用phenomenex色譜柱，以甲醇為流動相A、0.1%甲酸的水溶液為流動相B，采用梯度洗脫：0～2.0 min 70% A，2.0～5.0 min 70%～75% A，5.0～6.5 min 75% A，6.5～10.0 min 75%～80% A，10.0～11.0 min 80% A，11.01～12.0 min 90% A， 12.01～13.0 min 70% A；流速為0.5 mL/min，柱溫為45 ℃，進樣10 μL。采用正離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測模式。霧化氣、加熱氣和氣簾氣分別為65、60和20 kPa，碰撞氣為中度，噴霧電壓為5 500 V，去溶劑溫度為550 ℃。以標準溶液濃度為X軸，標準和內(nèi)標峰面積的比值為Y軸，進行線性回歸分析，經(jīng)“1/X”權(quán)重得回歸方程。將樣品峰面積比代入標準曲線方程，計算血清樣品25(OH)D的濃度，3-epi 25(OH)D3測定以25(OH)D3-d3為內(nèi)標、以25(OH)D3標準曲線進行計算。

4. 加樣回收試驗混合血清分別添加 50、100 ng/mL的混合標準品溶液各0.05 mL，每種處理各制備2個平行管，每管樣品重復(fù)進樣2次，計算加樣回收率。

5. 精密度試驗對分別含有低、中、高3個濃度的質(zhì)控血清進行3次重復(fù)分析，每次每種血清重復(fù)分析3份，每份重復(fù)進樣3次，考察方法的精密度。

6. 準確度驗證利用本研究建立的改良UPLC-MS/MS測定美國國家標準與技術(shù)研究院(the National Institute of Standards and Technology，NIST)有證標物SRM 972a的4個水平，重復(fù)測定2次，觀察方法的準確性。

7.方法比對用改良UPLC-MS/MS與之前本實驗室建立的常規(guī)UPLC-MS/MS[9]同時隨機測定307例血清樣本，分析2種方法的一致性。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0及MedCalc 9.6.2.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用兩相關(guān)樣本t檢驗、Passing-Bablok 回歸分析和Bland-Altman 散點圖評價2種方法的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、改良UPLC-MS/MS測定25(OH)D的結(jié)果

在本實驗條件下，25(OH)D2和25(OH)D3經(jīng)正離子電噴霧離子化后，可見較高豐度的母離子和子離子，所以選擇多離子反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitor，MRM)模式，其檢測的離子對及質(zhì)譜條件見表1。以本實驗條件處理標準溶液及血清所得UPLC-MS/MS分析色譜圖見圖1。25(OH)D2和25(OH)D3及內(nèi)標的保留時間約為5.0 min，分析時間約為13 min，各成分分離良好，互不干擾，且有效分離了3-epi 25(OH)D3。由于相同濃度下3-epi 25(OH)D3和25(OH)D3質(zhì)譜中響應(yīng)強度一致，因此應(yīng)用25(OH)D3-d3作為3-epi 25(OH)D3的內(nèi)標，應(yīng)用25(OH)D3的標準曲線計算3-epi 25(OH)D3的濃度。

表1　質(zhì)譜條件

三、標準曲線和檢測限(limit of detection，LOD)

采用改良UPLC-MS/MS測定濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的標準品并建立標準曲線。采用內(nèi)標法定量，每次測定25(OH)D2和25(OH)D3的線性相關(guān)系數(shù)(r)均>0.999 0。

以信噪比(signal to noise，S/N)為3、3次測定CV<20%作為測定25(OH)D2和25(OH)D3的LOD，結(jié)果分別為0.9、0.6 ng/mL；定量限(limit of quantification，LOQ)分別為1.8和1.2 ng/mL(S/N>10，CV<20%)。

四、25(OH)D2和25(OH)D3的加樣回收率

在混合血清中分別添加2種濃度(50、100 ng/mL)的25(OH)D2和25(OH)D3混合標準品，采用改良UPLC-MS/MS測定3次。25(OH)D2的回收率分別為102.26%(101.31%～103.91%)、99.93%(97.99%～101.45%)；25(OH)D3的回收率分別為101.42%(100.52%～102.17%)和98.29%(97.57%～99.40%)。

五、25(OH)D2和25(OH)D3的精密度

改良UPLC-MS/MS測定25(OH)D3總CV的均值為2.82%(2.45%～3.21%)，批內(nèi)CV為1.82%(1.76%～1.91%)；25(OH)D2總CV的均值為4.34%(2.88%～7.01%)，批內(nèi)CV為2.62%(1.91%～3.66%)，見表2。

六、25(OH)D2和25(OH)D3的準確性

改良UPLC-MS/MS測定25(OH)D2的準確度為104.5%～106.8%，25(OH)D3為98.9%～106.9%，見表3。

注：(a)25(OH)D3和3-epi 25(OH)D3的離子色譜圖，3-epi 25(OH)D3為添加的標準品；(b)25(OH)D3和3-epi 25(OH)D3的內(nèi)標；(c)25(OH)D2離子色譜圖；(d)25(OH)D2的內(nèi)標；Intensity為強度，cps為個/s 圖1　25(OH)D2、25(OH)D3和3-epi 25(OH)D3以及內(nèi)標的UPLC-MS/MS分析色譜圖

表2　改良UPLC-MS/MS分析25(OH)D2和25(OH)D3的精密度

表3　改良HPLC-MS/MS檢測25(OH)D2和25(OH)D3的準確度驗證

七、方法學比對結(jié)果

采用改良UPLC-MS/MS測定307例臨床樣本，結(jié)果顯示3-epi 25(OH)D3均在3.0 ng/mL以下，本法和常規(guī)UPLC-MS/MS[9]測定25(OH)D均值分別為15.53±8.58、(15.98±9.08)ng/mL，偏差為-0.46 ng/mL，百分偏差為-2.44%，2種方法差異無統(tǒng)計學意義(t=0.631，P=0.53)，R2=0.978，見圖2。用改良UPLC-MS/MS測定得到的維生素D不足、缺乏和充足率分別為76.9%、14.3%、8.8%，常規(guī)UPLC-MS/MS測定得到的結(jié)果分別為75.6%、15.3%、9.1%；2種方法對臨床判定的一致率達94.1%，且不相符的數(shù)據(jù)相差非常小(僅有5例相差在5 ng/mL以上)。

注：(a) Passing-Bablok回歸分析圖， Y=1.046 9 X-0.271 8， R 2=0.978 3；(B)Bland-Altman 散點圖 圖2　改良UPLC-MS/MS和常規(guī)UPLC-MS/MS的比較

討論

目前，不僅在骨骼方面，在糖尿病、心血管疾病、腫瘤、抑郁等方面維生素D的作用都受到廣泛重視。據(jù)估計，全球有超過10億人缺乏維生素D[6]，預(yù)防及診斷疾病促使對維生素D的檢測需求呈不斷增長趨勢。

25(OH)D半衰期較長，且含量較高，是衡量維生素D營養(yǎng)狀況的最佳指標[4]。25(OH)D主要以25(OH)D2和25(OH)D3形式存在，但同時部分人群體內(nèi)還存在同分異構(gòu)體3-epi 25(OH)D3。這些不同形式的25(OH)D可能具有不同強度的生物學效應(yīng)。研究認為應(yīng)分別對25(OH)D2、25(OH)D3進行測定，同時區(qū)分3-epi 25(OH)D3[10-11]。目前的免疫學方法(抗原抗體反應(yīng)原理)不能區(qū)分測定25(OH)D2和25(OH)D3，對準確評估體內(nèi)維生素D含量有很大的局限性。UPLC-MS/MS法特異性高、可同時測定25(OH)D2和25(OH)D3，被認為是檢測25(OH)D的金標準[9]。本實驗室前期建立了同時測定25(OH)D2和25(OH)D3的方法，但是不能區(qū)分測定3-epi 25(OH)D3，可能會影響25(OH)D3的測定準確性。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上通過方法改進實現(xiàn)了對3-epi 25(OH)D3的區(qū)分測定。由于3-epi 25(OH)D3和25(OH)D3僅有一個羥基方向上的差異，其理化性質(zhì)、在質(zhì)譜中的離子化效應(yīng)均基本一致，故本研究采用25(OH)D3的標準曲線和內(nèi)標對3-epi 25(OH)D3進行定量，準確性驗證結(jié)果顯示對3-epi 25(OH)D3的定量準確可靠。國際上可同時測定25(OH)D2、 25(OH)D3和3-epi 25(OH)D3的候選參考方法的樣本處理方法較為繁瑣、分析時間均較長[10-11]，本研究前處理簡單，較之前報道的方法分析時間也有縮短。

3-epi 25(OH)D3與25(OH)D3分子大小相同，結(jié)構(gòu)上僅有一個羥基空間方向上的差異，但是其可能無25(OH)D3的生物學效應(yīng)，目前在國內(nèi)對3-epi 25(OH)D3尚未發(fā)現(xiàn)對其含量或檢測的報道。本研究隨機測定了307例臨床樣本，結(jié)果顯示所含3-epi 25(OH)D3均在3.0 ng/mL以下，改良UPLC-MS/MS和常規(guī)UPLC-MS/MS[9]測定25(OH)D的結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(t=0.631，P=0.53)，2種方法的相關(guān)性和一致性均較好，對臨床判定的一致率也達94.1%，且不相符的數(shù)據(jù)相差非常小。但改良UPLC-MS/MS測定所用時間是常規(guī)UPLC-MS/MS[9]的2倍多，結(jié)果顯示采用常規(guī)UPLC-MS/MS[9]快速測定臨床樣本中的25(OH)D2和25(OH)D3基本不影響結(jié)果判定。

總之，本研究基于前期研究改良了UPLC-MS/MS測定血清25(OH)D2和25(OH)D3的方法，在國內(nèi)首次實現(xiàn)了對3-epi 25(OH)D3的測定。該方法準確、特異，對評價自動化免疫法檢測25(OH)D的準確性、不同形式的25(OH)D的生物學作用提供了方法學基礎(chǔ)。

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(本文編輯：龔曉霖)