巰基功能化磁性微球的構(gòu)建及其對(duì)蛋白質(zhì)的親和分離

巰基功能化磁性微球的構(gòu)建及其對(duì)蛋白質(zhì)的親和分離

劉珊珊1，鄒雪艷2*，郭靜玉1，劉錦1，陳丹云1

(1. 河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,河南 開封 475004；2.河南大學(xué) 特種功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 開封 475004)

摘要：通過水熱法一步合成了納米Fe3O4微球，并在甲苯中用巰基丙基三甲氧基硅烷(MPS)對(duì)其進(jìn)行表面修飾得到了Fe3O4-SH微球，通過DTNB法測(cè)得微球表面巰基含量為333.54 μg/mg. 該納米微球可以吸附溶液中的Ni2+，從而形成Fe3O4-SH-Ni2+復(fù)合材料. 以此復(fù)合材料為載體，可以將以組氨酸為標(biāo)簽的(His-tagged)融合蛋白直接從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行提純，并在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的快速分離，其對(duì)His-tagged TRX蛋白的分離能力為20.6 μg/mg，特別適合于對(duì)以組氨酸為標(biāo)簽蛋白的分離純化.

關(guān)鍵詞：四氧化三鐵；巰基；組氨酸；蛋白質(zhì)分離；親和

中圖分類號(hào)：O61 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2015-1-24.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(21271062)，河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)研究項(xiàng)目(14B150003)．

作者簡(jiǎn)介：劉珊珊(1991-), 女, 碩士生, 研究方向?yàn)閺?fù)合納米材料的制備. *通訊聯(lián)系人, E-mail:zouxueyan@henu.edu.cn.

Construction of thiol-functional magnetic microspheres and

affinity separation of protein

LIU Shanshan1, ZOU Xueyan2*, GUO Jingyu1, LIU Jin1, CHEN Danyun1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China;

2.KeyLaboratoryforSpecialFunctionalMaterials,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Abstract:Ferriferrous oxide magnetic microspheres (MSs) were prepared via solvothermal route. The so-obtained MSs were modified by (3-mercapto-propyl)trimethoxysilane (MPS) in mythylbenzene to give birth of the ferriferrous oxide with thiol group (Fe3O4-SH) microspheres, which can absorb Ni2+ to form Fe3O4-SH-Ni2+. The amount of thiol group of Fe3O4-SH was tested to be 333.54 μg/mg by means of DTNB method. After chelating Ni2+ ions, Fe3SH-Ni2+ MSs were used to enrich and purify histidine-tagged (His-tagged) proteins directly from the mixture of lysed cells without pretreatment. Moreover, the prepared MSs can separate the target protein quickly in the magnetic field. It has been found that Fe3O4-SH-Ni2+ MSs present negligible nonspecific protein adsorption and high protein binding activity with the saturation capacity being 20.6 μg/mg and they are especially suitable for rapid purification of His-tagged proteins.

Keywords:Fe3O4; thiol group; His-tagged; protein separation; affinity

蛋白質(zhì)的分離純化，特別是微量蛋白的純化，在蛋白組學(xué)領(lǐng)域是一個(gè)重要課題[1-4]. 傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)的分離純化通常對(duì)目標(biāo)蛋白都具有較高的選擇性[5-6]，然而這些方法都需要采用多步處理，如沉淀、透析、超過濾和層析等，處理工藝比較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)且成本較高. 隨著生物學(xué)的發(fā)展，蛋白質(zhì)可以帶上某一標(biāo)簽進(jìn)行表達(dá)，從而使蛋白質(zhì)可以通過此標(biāo)簽被特異性的分離純化[7-8]. 在這些親和標(biāo)簽中，以六聚組氨酸為標(biāo)簽的(His-tagged)蛋白使用最為廣泛. 這些His-tagged蛋白很容易通過微生物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，從而使這些標(biāo)簽蛋白在其體內(nèi)大量產(chǎn)生[9-10]. 在這些His-tagged的蛋白中，六聚組氨酸鏈對(duì)某些金屬離子具有親和力，如Ni2+和Cu2+，它們能特異性的固定這些金屬離子，并且這些金屬離子都可以再生[11-12]. 近年來，納米顆粒和納米棒作為一種新興的載體被用于蛋白質(zhì)的分離[13-16]. 盡管如此，這些合成方法仍有一定的局限性，如載體材料分離蛋白后難以從混合蛋白中分離，很難實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速分離. 為了便于實(shí)現(xiàn)材料的高效快速分離，本文作者以磁性納米Fe3O4為載體[17]，在其表面修飾巰基，從而在外加磁場(chǎng)的作用下，顯著地提高了材料分離蛋白的效率，以便于蛋白的分離提純.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

巰基丙基三甲氧基硅烷(MPS，95%)購自Alfa-Aesar公司；甲苯、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、氯化鎳(NiCl2·6H2O)均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

樣品的形貌及組成用透射電子顯微鏡(TEM，JEOL JEM-2010型，日本電子株式會(huì)社)、傅立葉變換紅外光譜儀(IR，AVATAR360型，美國尼高力公司)以及X射線衍射儀(XRD，X-PertPro，荷蘭飛利浦)進(jìn)行表征. 用紫外可見分光光度計(jì)(UV-Vis，752N型，上海奧普勒儀器有限公司)進(jìn)行表面巰基含量的測(cè)定. 磁滯回線由VSM振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VS M, Lake Sh ore 7410，中國計(jì)量科學(xué)研究院)進(jìn)行測(cè)定. 捕獲的His-tagged蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)(SDS-PAGEw，Poer PAC 300，鄭州寶賽科貿(mào)有限公司)，穩(wěn)壓電壓是70 V，分離電壓是120 V.

1.2　實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1磁性Fe3O4微球的制備

在50 mL錐形瓶中加入0.135～2.16 g FeCl3、2.7 g無水乙酸鈉和30 mL 乙二醇，室溫下攪拌1 h后轉(zhuǎn)入高溫反應(yīng)釜中，于160 ℃反應(yīng)12 h，自然冷至室溫. 磁性離心分離，沉淀分別用無水乙醇和去離子水洗滌數(shù)次，于60 ℃真空烘干24 h，即得到Fe3O4樣品.

1.2.2Fe3O4-SH的制備

取0.1 g上述Fe3O4樣品于100 mL三口瓶中，加入30 mL甲苯, 分散均勻；加入0.2 mL MPS，在室溫下繼續(xù)攪拌30 min，然后升溫至93 ℃反應(yīng)12 h. 產(chǎn)物分別用異丙醇和去離子水洗滌數(shù)次，于60 ℃真空烘干24 h，即得到Fe3O4-SH樣品. 得到的樣品采用DTNB法檢測(cè)表面巰基的含量[18].

1.2.3Fe3O4-SH微球吸附Ni2+

準(zhǔn)確稱取5 mg Fe3O4-SH樣品分散在50 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液中，于25 ℃水浴震蕩反應(yīng)2 h. 沉淀用水反復(fù)洗滌6次，然后分散在1 mL 25%的乙醇中備用.

1.2.4Fe3O4-Ni2+微球?qū)is-tagged蛋白的分離

文中分離的蛋白為His-tagged Thioredoxin(His-tagged TRX)，來自于PET-32a質(zhì)體[19]. 六聚組氨酸為標(biāo)簽的重組質(zhì)體被植入大腸桿菌體內(nèi)，并用常規(guī)的方法進(jìn)行蛋白的表達(dá)[20]. 一般來說，所有His-tagged融合蛋白都可以用親和分離的方法捕獲和富集. 蛋白分離的具體步驟如下：首先用1 000 μL破菌buffer(20 mmol/L pH=7.6 Tris-HCl，含0.2 mol/L NaCl)洗滌Fe3O4-SH-Ni2+復(fù)合材料，然后將這些復(fù)合材料加入到1 500 μL 細(xì)胞裂解液中，在搖床上(90 r/min)室溫孵化2 h；隨后，將捕獲了的Fe3O4-Ni2+復(fù)合材料進(jìn)行離心，并用破菌buffer洗滌3次以去除表面殘留的蛋白；最后，將捕獲的His-tagged TRX蛋白用300 μL咪唑(1 mol/L)洗脫，取洗滌后的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，剩余的上清液用于目標(biāo)蛋白的定量檢測(cè).

2結(jié)果與討論

2.1　反應(yīng)條件的影響

圖1為加入不同量的鐵源制備的Fe3O4樣品的TEM和XRD圖，圖1a~e加入的FeCl3的量分別為0.135 g(0.5 mmol)、0.27 g(1 mmol)、0.54 g(2 mmol)、1.35 g(5 mmol)和2.16 g(8 mmol). 從圖中可以看出，當(dāng)鐵源的質(zhì)量小于0.54 g時(shí)，制備的樣品為球形，但表面由許多小顆粒組成，平均粒徑為200 nm；而當(dāng)鐵源質(zhì)量大于1.35 g時(shí)，制備的樣品為實(shí)心球，平均粒徑為600 nm. 圖1f中曲線b-e分別為FeCl3的加入量為1、2、5、8 mmol時(shí)Fe3O4樣品的XRD圖. 從圖1中還可以看出，制備的4種Fe3O4樣品主體結(jié)構(gòu)一致，在(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)處的衍射峰均對(duì)應(yīng)于立方結(jié)構(gòu)的Fe3O4，說明所制備的Fe3O4納米微球?yàn)槊嫘牧⒎浇Y(jié)構(gòu)，與PDF卡(75-0033)的特征峰一致.

2.2　巰基含量的定量檢測(cè)

我們選擇鐵源初始加入量為2 mmol(圖1c)和5 mmol(圖1d)條件下制備的Fe3O4樣品進(jìn)行表面修飾，得到了兩種Fe3O4-SH樣品，分別記作樣品Fe3O4-SH(2 mmol)和Fe3O4-SH(5 mmol). 通過DTNB法定量檢測(cè)表面巰基含量，樣品Fe3O4-SH(2 mmol)和Fe3O4-SH(5 mmol)表面的巰基含量分別為333.5和163.3 μg/mg. 這可能是由于當(dāng)鐵源初始量為2 mmol時(shí)制備的樣品表面由許多小顆粒組成，增加了比表面積，在進(jìn)行表面修飾時(shí)可以更多的與-SH結(jié)合，而當(dāng)鐵源初始量為5 mmol時(shí)制備的Fe3O4樣品為實(shí)心球，比表面積小，所以表面巰基含量更低.

FeCl 3的加入量：(a) 0.5 mmol; (b) 1 mmol; (c) 2 mmol; (d) 5 mmol; (e) 8 mmol. 圖1　不同F(xiàn)eCl 3加入量下制備的Fe 3O 4樣品的TEM圖和XRD圖 Fig.1　TEM images and XRD spectrum of Fe 3O 4 samples obtained under different FeCl 3 dos

2.3　Fe 3O 4-SH微球的表征

2.3.1TEM和磁滯回線分析

選用表面巰基含量較高的樣品Fe3O4-SH(2 mmol)為載體用于目標(biāo)蛋白的分離. 圖2為鐵源加入量為2 mmol條件下制備的Fe3O4-SH樣品的TEM(圖2a)、在外加磁場(chǎng)作用下磁性分離的效果圖(圖2b)以及對(duì)應(yīng)的磁滯回線圖(圖2c). 從圖中可以看出，表面修飾巰基前后的樣品形貌基本與圖1c保持一致，F(xiàn)e3O4-SH樣品形貌仍為球形，表面由很多小顆粒組成，平均粒徑約為200 nm. 從圖2b可以看出，制備的樣品在外加磁場(chǎng)的作用下能夠快速的從溶液中分離出來. 圖2c為樣品在300 K條件下測(cè)得的磁滯回線. 從圖中可以看出，制得的樣品具有很好的磁性，其飽和磁化強(qiáng)度為130.9 emu·g-1，矯頑力為55.2 Gs.

2.3.2XRD分析

圖3為制備的Fe3O4和Fe3O4-SH樣品的XRD圖，從圖中可以看出，F(xiàn)e3O4-SH樣品與修飾前的XRD主峰基本保持一致，在(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)處都有特征峰，仍為面心立方結(jié)構(gòu)，與PDF卡(75-0033)的特征峰一致.

2.3.3IR分析

圖4為制備的Fe3O4和Fe3O4-SH樣品的IR圖. 從圖中可以看出，584和3 460 cm-1分別對(duì)應(yīng)Fe3O4的特征吸收峰和其表面的羥基伸縮振動(dòng)峰；1 634 cm-1為表面結(jié)合水的H-O-H 的彎曲振動(dòng)峰；可以看出，F(xiàn)e3O4-SH的主體峰位與Fe3O4基本一致，但在2 925和2 852 cm-1出現(xiàn)了亞甲基的伸縮振動(dòng)峰，說明微球的表面修飾了-SH.

圖2　Fe 3O 4-SH樣品的TEM(a)，在外加磁場(chǎng)作用下的照片(b)及磁滯回線(c) Fig.2　TEM image of Fe 3O 4-SH sample (a), Fe 3O 4-SH sample show a strong magnetic response to an applied magnetic field (b) room temperature (300 K) magnetic hysteresis loops of Fe 3O 4-SH sample (c).

2.3.4蛋白分離示意圖

圖5為樣品的制備及分離蛋白的示意圖. 文中采用FeCl3為鐵源，通過水熱法一步制得Fe3O4微球，然后在甲苯體系中表面修飾了巰基，進(jìn)一步吸附Ni2+后，可用于分離His-tagged的融合蛋白. 在外加磁場(chǎng)的作用下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的快速分離.

圖3　制備Fe 3O 4和Fe 3O 4-SH樣品的XRD圖 Fig.3　XRD pattern of Fe 3O 4 and Fe 3O 4-SH samples

圖4　樣品Fe 3O 4和Fe 3O 4-SH的IR譜圖 Fig.4　IR spectra of Fe 3O 4 and Fe 3O 4-SH samples

圖5　制備樣品分離蛋白質(zhì)示意圖 Fig.5　Procedure of the preparation of Fe 3O 4-SH-Ni 2+ microspheres and the enrichment and separation of His-tagged proteins

2.3.5SDS-PAGE分析

圖6為用制備的樣品分離His-tagged TRX蛋白的電泳圖，泳道1為Marker，泳道2為混合蛋白，泳道3為用制備微球分離混合蛋白的條帶，其中His-tagged TRX蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為22 kD. 從圖6中看出，制備的磁性納米微球能夠從混合蛋白中分離出His-tagged TRX蛋白，而且對(duì)His-tagged TRX蛋白純化的特異性很高. 通過對(duì)目標(biāo)蛋白的定量檢測(cè)可知，制備微球?qū)is-tagged TRX蛋白的分離能力為20.6 μg/mg.

泳道：(1) Marker；(2) 大腸桿菌細(xì)胞裂解液； (3) 制備微球?qū)旌系鞍椎姆蛛x. 圖6　微球分離His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE圖 Fig.6　SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

3結(jié)論

通過水熱法合成了納米Fe3O4，再通過表面修飾得到了Fe3O4-SH微球. 該納米微球可以吸附溶液中的Ni2+，從而直接用于分離以組氨酸為標(biāo)簽的(His-tagged)融合蛋白，并且在外加磁場(chǎng)的作用下可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的快速分離. 實(shí)驗(yàn)證明，所制備的材料對(duì)蛋白的分離效果很好，且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的特異性分離，在實(shí)現(xiàn)對(duì)組氨酸為標(biāo)簽蛋白的快速分離方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值.

參考文獻(xiàn)：

[1] SETO H, OGATA Y, MURAKAMI T, et al. Selective protein separation using siliceous materials with a trimethoxysilane-containing glycopolymer [J]. ACS Appl Mater Inter, 2012, 41: 411-417.

[2] LAO U L, MULCHANDANI A, CHEN W. Simple conjugation and purification of quantum dot-antibody complexes using a thermally responsive elastin-protein L scaffold as immunofluorescent agents [J]. J Am Chem Soc, 2006, 128(46): 14756-14757.

[3] LIU C M, MONSON C F, YANG T L, et al. Protein separation by electrophoretic- electroosmotic focusing on supported lipid bilayers [J]. Anal Chem, 2011, 83: 7876-7880.

[5] XIE H Y, ZHEN R, WANG B, et al. Fe3O4/Au core/shell nanoparticles modified with Ni2+- nitrilotriacetic acid specific to histidine-tagged proteins [J]. J Phys Chem C, 2010, 114: 4825-4830.

[6] YANG L R, GUO C, CHEN S, et al. pH-sensitive magnetic ion exchanger for protein separation [J]. Ind Eng Chem Res, 2009, 48: 944-950.

[7] LEE I S, LEE N, PARK J, et al. Ni/NiO core/shell nanoparticles for selective binding and magnetic separation of histidine-tagged proteins [J]. J Am Chem Soc, 2006, 128: 10658-10659.

[8] LEE K S, LEE I S. Decoration of superparamagnetic iron oxide nanoparticles with Ni2+: agent to bind and separate histidine-tagged proteins [J]. Chem Commun, 2008,14(6): 709-711.

[9] PORATH J, CARLSSON J, OLSSON I, et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation [J]. Nature, 1975, 258: 598-599.

[10] XU F, GEIGER J H, BAKER G L, et al. Polymer brush-modified magnetic nanoparticles for his-tagged protein purification [J]. Langmuir, 2011, 27: 3106-3112.

[11] AHRENDS R, PIEPER S, NEUMANN B, et al. Metal-coded affinity tag labeling: a demonstration of analytical robustness and suitability for biological applications [J]. Anal Chem, 2009, 81: 2176-2184.

[12] KIM J, PIAO Y, LEE N, et al. Magnetic nanocomposite spheres decorated with NiO nanoparticles for a magnetically recyclable protein separation system [J]. Adv Mater, 2009, 22: 57-60.

[13] GOTO Y, MATSUNO R, KONNO T, et al. Polymer nanoparticles covered with phosphorylcholine groups and immobilized with antibody for high-affinity separation of proteins [J]. Biomacromolecules, 2008, 9: 828-833.

[14] XU C J, XU K M, GU H W, et al. Nitrilotriacetic acid-modified magnetic nanoparticles as a general agent to bind histidine-tagged proteins [J]. J Am Chem Soc, 2004, 126: 3392-3393.

[15] MIZRAHI B, IRUSTA S, MCKENNA M, et al. Microgels for efficient protein purification [J]. Adv Mater, 2011, 23: H258-H262.

[16] OH B K, PARK S, MILLSTONE J E, et al. Separation of tricomponent protein mixtures with triblock nanorods [J]. J Am Chem Soc, 2006, 128: 11825-11829.

[17] 王現(xiàn)紅, 賀攀科, 程文正, 等. 單分散性雙相可溶四氧化三鐵納米微粒的多醇法制備及磁性[J]. 化學(xué)研究, 2014, 25(2): 119-123.

[18] LI B J, ZOU X Y, ZHAO Y B, et al. Biofunctionalization of silica microspheres for protein separation [J]. Mat Sci Eng C, 2013, 33: 2595-2600.

[19] LAVALLIE E R, REHEMTULLA A, RACIE L A, et al. Cloning and functional expression of a cDNA encoding the catalytic subunit of bovine enterokinase [J]. J Biol Chem, 1993, 268: 23311- 23317.

[20] SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular cloning: a laboratory manual [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: 33-34.

[責(zé)任編輯：毛立群]