二氧化硅復(fù)合微球的制備及其對His-tagged融合蛋白質(zhì)的分離

二氧化硅復(fù)合微球的制備及其對His-tagged融合蛋白質(zhì)的分離

王立1，王朋2，何曉鋒2，鄒雪艷3，趙彥保3，李賓杰4，董爍4*

(1. 河南大學(xué) 歐亞國際學(xué)院，河南 開封 475001;2. 河南大學(xué) 民生學(xué)院，河南 開封 475004;

3. 河南大學(xué) 特種功能材料重點實驗室,河南 開封 475004；4. 河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,河南 開封 475004)

摘要：采用水熱法合成了巰基納米二氧化硅(SiO2-SH)，并在其表面修飾亞氨基二乙酸基團(-IDA)得到SiO2-SH/IDA微球. 該微球從溶液中可吸附更多的Ni2+形成SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球. 研究結(jié)果表明，利用該復(fù)合微球可以較好地分離以組氨酸為標簽(His-tagged)的融合蛋白.

關(guān)鍵詞：復(fù)合材料；功能化；親和分離；組氨酸

中圖分類號：O61 文獻標志碼：A

收稿日期：2014-12-15.

基金項目：國家自然科學(xué)基金(21271062),河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點研究項目(14B150003)．

作者簡介：王立(1972-)，男，實驗師，主要從事復(fù)合納米材料的制備. *通訊聯(lián)系人，E-mail: BHH570@126.com.

Synthesis of silica microshpheres and separation

of His-tagged protein

WANG Li1, WANG Peng2, HE Xiaofeng2, ZOU Xueyan3, ZHAO Yanbao3,

LI Binjie4, DONG Shuo4*

(1.EurasiaInternationalCollegeofHenanUniversity,Kaifeng475001,Henan,China;

2.MinshengCollege,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China;

3.KeyLaboratoryforSpecialFunctionalMaterials,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China;

4.SchoolofMedicine,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Abstract:Marcapto-silica microspheres (SiO2-SH MSs) were prepared through a solvothermal route, then these SiO2-SH MSs were further modified by conjugating iminodiacetic acid (IDA) toafford SiO2-SH/IDA MSs. These -SH groups and -IDA groups as binding sites can chelate Ni2+ ions, which can be further used to enrich and separate His-tagged proteins directly from the mixture of lysed cells without sample pretreatment. Results show that these MSs present negligible nonspecific adsorption and high protein binding, which are especially suitable for purification of His-tagged proteins.

Keywords:composite materials； functionalization； affinity separation； His-tagged

隨著生命科學(xué)的發(fā)展提取高純度的活性蛋白對于生物學(xué)及一些交叉學(xué)科有著重要意義[1-3]. 蛋白質(zhì)提純有很多方法如沉淀、透析、超過濾和層析等，但是這些方法大都需要采用多步處理，操作復(fù)雜、費時且成本較高；相比之下，親和分離具有簡便、快速的特點[4-5]. 蛋白質(zhì)提純通常要求對目標蛋白具有較高的選擇性[6-7]，如以六聚組氨酸為標簽的(His-tagged)蛋白[8-9]，它們對金屬離子如鎳、鈷等離子具有高度的選擇性，如洗脫條件溫和，與金屬離子結(jié)合不受變性劑影響等優(yōu)良性能[10-11]. 納米材料由于具有許多獨特的物理和化學(xué)特性及生物相容性，常被用作生物載體，若進一步對納米材料進行表面修飾還可以賦予材料特殊性能，在材料學(xué)、磁學(xué)、電學(xué)、光學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、催化等領(lǐng)域都將具有應(yīng)用價值[12-15]. 本文作者采用巰基丙基三甲氧基硅烷為硅源，一步法制備了巰基納米二氧化硅(SiO2-SH)微球，并在其表面修飾-IDA基團，使之成為SiO2-SH/IDA雙功能團復(fù)合材料，顯著提高了表面Ni2+的吸附量.

1實驗部分

1.1　試劑與儀器

巰基丙基三甲氧基硅烷(MPS，95%)購自Alfa-Aesar公司；十六烷基三甲基氯化銨(CTAC，≥98.0%)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三乙醇胺(TEA，≥98.0%)；γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)和亞氨基二乙酸(IDA，98%)均購自阿拉丁公司；氯化鎳(NiCl2·6H2O)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

樣品的形貌及組成分別使用透射電子顯微鏡(TEM，JEOL JEM-2010型，日本電子株式會社)、傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，AVATAR360型，美國尼高力公司)、熱重分析儀(TG，TGA/SDTA851e，Merrler-Toledo Instruments公司)進行檢測. 捕獲的His-tagged蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(SDS-PAGE，Power PAC 300，鄭州寶賽科貿(mào)有限公司)，穩(wěn)壓電壓為70 V，分離電壓為120 V. 捕獲蛋白的含量用紫外-可見分光光度計(UV-Vis，nanodrop 2000c，美國Thermo公司)進行測定，測定波長為400 nm.

1.2　實驗部分

1.2.1SiO2-SH的制備

在50 mL燒瓶中加入17 mL去離子水，2.8 mL無水乙醇和0.03 g CTAC，攪拌10 min；加入1.1 mL TEA，繼續(xù)攪拌20 min；升溫至60 ℃，加入0.14 mL MPS的混合物，繼續(xù)反應(yīng)3 h；得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 mL高壓反應(yīng)釜中，于110 ℃反應(yīng)48 h，自然冷至室溫. 離心分離反應(yīng)溶液，固體產(chǎn)物用鹽酸乙醇溶液洗滌3次以去除模板，然后用無水乙醇和去離子水各洗滌3次，于60 ℃烘干即得到SiO2-SH樣品.

1.2.2SiO2-SH/IDA的制備

稱取0.8 g IDA和0.5 g NaOH加入100 mL三口瓶內(nèi)，再加入10 mL水；控制溶液溫度為0 ℃，加入1.0 g KH560，磁力攪拌20 min，升至室溫反應(yīng)4 h，再升溫至65 ℃繼續(xù)反應(yīng)12 h. 所得溶液標記為樣品1.

取3 mL 樣品1加入100 mL三口瓶內(nèi)，用6 mol·L-1HCl溶液調(diào)pH=3；加水稀釋至10 mL，再調(diào) pH=2，加入0.2 g SiO2-SH樣品，升溫至90 ℃，反應(yīng)3 h；沉淀分別用無水乙醇和去離子水洗滌3次，即得SiO2-SH/IDA樣品.

1.2.3SiO2-SH/IDA微球吸附Ni2+

準確稱取3 mg SiO2-SH/IDA樣品分散在50 mL 2 mol·L-1NiCl2溶液中，放入25 ℃水浴中，震蕩反應(yīng)2 h；反應(yīng)后沉淀用水反復(fù)洗滌6次，得到SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品，樣品分散在1 mL 25%的乙醇中備用.

1.2.4SiO2-SH/IDA-Ni2+微球?qū)is-tagged蛋白的分離

本文中分離的蛋白為His-tagged Thioredoxin (His-tagged TRX)[16]，來自于PET-32a質(zhì)體[17]，被植入大腸桿菌體內(nèi)進行表達[18]. 一般來說，所有His-tagged融合蛋白都可以用親和分離的方法捕獲分離. 蛋白分離的具體步驟如下：首先用1 000 μL破菌buffer (20 mmol·L-1Tris-HCl，含0.2 mol·L-1NaCl) 洗滌SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合材料，然后將這些復(fù)合材料分散到1 500 μL 細胞裂解液中，在搖床上 (90 r/min)于 4 ℃孵育2 h；隨后，將捕獲了目標蛋白的復(fù)合材料用破菌buffer離心洗滌數(shù)次以去除表面殘留的蛋白；最后，捕獲的His-tagged TRX蛋白用一定濃度的300 μL咪唑進行洗脫，取適量洗脫后的蛋白進行SDS-PAGE分析，剩余的部分用于目標蛋白濃度的定量檢測.

2結(jié)果與討論

圖1為SiO2-SH/IDA樣品的TEM(a)、FT-IR(b)和TG(c)圖. 從圖1a可以看出，制備的樣品為核殼結(jié)構(gòu)，粒徑均一，分散性好，平均粒徑為120 nm. 從圖1b可以看出，1 124、801和471 cm-1有明顯的吸收峰，分別歸屬于Si-O-Si的反對稱伸縮吸收、對稱伸縮振動吸收及彎曲振動吸收，說明制備的樣品主要成分為SiO2[19]. 在2 550 cm-1處為-SH的伸縮振動[20]，說明制備的樣品表面含有-SH. 2 926 cm-1為亞甲基的伸縮振動峰，另外在687 cm-1為IDA中-NH鍵的伸縮振動峰[21]. 從圖1c的TG曲線可以看出，從220 ~700 ℃有明顯的失重，總失重率約為54.7%，這主要是由于表面修飾的-SH和-IDA基團的熱分解所致.

蛋白質(zhì)的親和分離已成為蛋白質(zhì)分離中的重要方法，配體與靶蛋白之間通過特異性識別，可從混合蛋白中實現(xiàn)對目標蛋白的分離純化. 為了提高對目標蛋白的親和分離效率，可將長短不一的連接臂分子插入配體與基體之間，以減小空間位阻. 圖2為SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品以及分離His-tagged TRX蛋白質(zhì)的示意圖. 本文作者利用制備的SiO2-SH納米球為載體，通過在其表面修飾一層-IDA基團，從而鍵合了長短相間的兩種連接臂，減小了分離蛋白時的空間位阻，從而可以更好的實現(xiàn)對目標蛋白的分離.

圖1　SiO 2-SH/IDA樣品的TEM(a)、FT-IR(b)和TG(c)圖 Fig.1　TEM image (a), FT-IR spectrum (b) and TG curve (c) of as-prepared SiO 2-SH/IDA samples

圖2　樣品制備及分離蛋白示意圖 Fig.2　Schematic representation of the preparation procedure of SiO 2-SH/IDA-Ni 2+ and its enrichment and separation of His-tagged proteins

為了檢測樣品分離目標蛋白的效果，我們采用十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對分離的蛋白進行檢測. 圖3為用不同濃度咪唑進行洗脫His-tagged TRX蛋白的電泳圖. 可以看出，隨著咪唑洗脫濃度的增大，雜蛋白的量也逐漸增加；當咪唑濃度為1 mol·L-1時，洗脫效果最好，可以實現(xiàn)對目標蛋白的特異性分離.

泳道: (1) 0.5 mol·L -1; (2) 1 mol·L -1; (3) 2 mol·L -1; (4) 3 mol·L -1; (5) 混合蛋白; (6) Marker. 圖3　不同濃度咪唑洗脫條件下分離His-tagged TRX 融合蛋白的SDS-PAGE圖 Fig.3　SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by as-prepared SiO 2-SH/IDA-Ni 2+ MSs.

為了檢測制備樣品對His-tagged蛋白均具有特異性分離能力，我們選用了兩種His-tagged蛋白(His-tagged TRX蛋白和His-tagged LOV蛋白)進行檢測 (保持咪唑洗脫濃度為1 mol·L-1不變). 如圖4所示，SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品對兩種蛋白均具有較好的分離效果，幾乎沒有非特異性吸附. 采用紫外分光光度計檢測分離蛋白的能力分別為2.3 mmol/g (His-tagged LOV)和4.5 mmol/g (His-tagged TRX).

泳道: (1) 分離His-tagged TRX蛋白; (2) 含His-tagged TRX的混合蛋白; (3) 含His-tagged LOV的混合蛋白; (4) 分離His-tagged LOV蛋白; (5) Marker. 圖4　SiO 2-SH/IDA-Ni 2+樣品分離不同 His-tagged融合蛋白的SDS-PAGE圖 Fig.4　SDS-PAGE analysis of the fractions washed off from SiO 2-SH/IDA-Ni 2+ MSs when different kinds of His-tagged proteins were used

3結(jié)論

采用水熱法合成了表面帶巰基的納米二氧化硅(SiO2-SH)，并在其表面修飾-IDA基團，再用其吸附溶液中的Ni2+，得到SiO2-SH/IDA-Ni2+微球. 用此微球?qū)is-tagged TRX蛋白進行分離，實驗證明其可以特異性的分離目標蛋白，分離蛋白的能力為4.5 mmol/g，顯示出較好的應(yīng)用前景.

參考文獻：

[1] MARTIN C, JAN S, HANA C, et al. Advances in purification and separation of posttranslationally modified proteins [J]. J Proteomics, 2013, 92: 2-27.

[2] NIU R, QIN S L. Progress in research of protein separation-and purification-techniques [J]. Chemical Technology Market, 2010, 33(4): 16-18.

[3] CHEN H Y, ZHANG C X, MA X K, et al. Strategies on the separation and purification of protein [J]. J Anhui Agri Sci, 2009, 37(36): 17849-17851.

[4] LEE I S, LEE N, PARK J, et al. Ni/NiO core/shell nanoparticles for selective binding and magnetic separation of histidine-tagged proteins [J]. J Am Chem Soc, 2006, 128 (33): 10658-10659.

[5] LEE K S, LEE I S. Decoration of superparamagnetic iron oxide nanoparticles with Ni2+: agent to bind and separate histidine-tagged proteins [J]. Chem Commun, 2008,14(6): 709-711.

[6] XIE H Y, ZHEN R, WANG B, et al. Fe3O4/Au core/shell nanoparticles modified with Ni2+- nitrilotriacetic acid specific to histidine-tagged proteins [J]. J Phys Chem C, 2010, 114 (11): 4825-4830.

[7] YANG L R, GUO C, CHEN S, et al. pH-sensitive magnetic ion exchanger for protein separation [J]. Ind Eng Chem Res, 2009, 48 (2): 944-950.

[8] 許艷, 萬敏, 張培因, 等. 六聚組氨酸在重組蛋白中的位置對鎳親和層析的影響[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2004,1(2): 90-93.

[9] HUANG Y, SHI R N, ZHONG X F, et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for insulin-like growth factor-I using six-histidine tag fused proteins[J]. Anal Chim Acta, 2007, 596(1): 116-123.

[10] AHRENDS R, PIEPER S, NEUMANN B, et al. Metal-coded affinity tag labeling: a demonstration of analytical robustness and suitability for biological applications [J]. Anal Chem, 2009, 81(6): 2176-2184.

[11] KIM J, PIAO Y, LEE N, et al. Magnetic nanocomposite spheres decorated with NiO nanoparticles for a magnetically recyclable protein separation system [J]. Adv Mater, 2009, 22(1): 57-60.

[12] 段濤, 楊玉山, 彭同江, 等. 核殼型納米復(fù)合材料的研究進展[J]. 材料導(dǎo)報, 2009, 23(2): 19-23.

[13] 鄒雪艷, 董爍, 李賓杰, 等. 納米材料在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)研究, 2014, 25(5): 543-550.

[14] ZOU X Y, LI K, ZHAO Y B, et al. Ferroferric oxide/L-cysteine magnetic nanospheres for capturing histidine-tagged proteins [J]. J Mater Chem B, 2014, 1: 5108-5113.

[15] 李廣錄, 何濤, 李雪梅. 核殼結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料的制備及應(yīng)用 [J]. 化學(xué)進展, 2011, 23(6): 1081-1089.

[16] JENG M F, CAMPBELL A P, BEGLEY T, et al. High-resolution solution structures of oxidized and reduced Escherichia coli thioredoxin [J]. Structure, 1994, 2(9): 853-868.

[17] LAVALLIE E R, REHEMTULLA A, RACIE L A, et al. Cloning and functional expression of a cDNA encoding the catalytic subunit of bovine enterokinase [J]. J Biol Chem, 1993, 268 (31): 23311-23317.

[18] SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular cloning: a laboratory manual [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001： 33-34.

[19] 鄒雪艷, 褚留杰, 董爍, 等. 生物功能化納米SiO2微球的構(gòu)建及對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的捕獲分離 [J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2012, 33(7)： 1394-1400.

[20] LI B J, ZOU X Y, ZHAO Y B, et al. Biofunctionalization of silica microspheres for protein separation [J]. Mat Sci Eng C, 2013, 33: 2595-2600.

[21] ZOU X Y, LI K, YIN Y B, et al. Synthesis of petal-like ferric oxide/cysteine architectures and their application in affinity separation of proteins [J]. Mat Sci Eng C, 2014, 34: 468-473.

[責(zé)任編輯：毛立群]