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    硫化氫介導(dǎo)的S-巰基化修飾及其化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

    2024-02-27 10:36:28全心雨唐志書
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)換法亞硝基二硫鍵

    張 珍, 全心雨, 唐志書,2)*

    (1)陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西 咸陽(yáng) 712046;2)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院研究生院, 北京 100700)

    H2S是一種無色有臭雞蛋氣味的氣體。1996年,Kimura等人首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生H2S的酶-胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine gamma-lyase,CSE),由此開啟了H2S研究的新紀(jì)元,人們對(duì)H2S的認(rèn)識(shí)也從環(huán)境毒物轉(zhuǎn)變?yōu)槔^一氧化氮和一氧化碳之后的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子[1,2]。隨后,相繼發(fā)現(xiàn)參與H2S生成的酶,包括硫醚-β-合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)和3-硫基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, 3-MST)。這些酶的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)一步揭示了H2S在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)作用。研究表明,H2S廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外,組織與器官,并與蛋白質(zhì)、DNA和其他活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)(例如:氧和氮的衍生氧化劑和自由基),通過影響細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)心血管、神經(jīng)元、免疫、呼吸、胃腸、肝、腎和內(nèi)分泌系統(tǒng)等,具有廣泛的生理和病理作用[3, 4]。

    研究發(fā)現(xiàn),在缺血再灌注損傷[5]、動(dòng)脈粥樣硬化[6]、癌癥[7]、腎纖維化/慢性腎病[8]及其他形式的血管疾病[9,10]等疾病中,H2S水平顯著降低。相反,在各種炎癥[11]和唐氏綜合癥[12]等疾病中,H2S水平明顯升高。研究表明,通過給予H2S供體或抑制產(chǎn)生H2S酶的活性,相應(yīng)地升高或降低體內(nèi)H2S水平,可以達(dá)到一定的治療作用[13]。因此,調(diào)節(jié)H2S水平有望成為治療這些疾病的新途徑,而H2S相應(yīng)的分子機(jī)制研究也至關(guān)重要。

    2009年,Mustafa等人首次提出H2S通過S-巰基化修飾蛋白質(zhì)的Cys殘基參與調(diào)控生理功能[14]。隨后,大量研究證明,H2S介導(dǎo)的S-巰基化修飾通過改變靶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。本文主要綜述了H2S介導(dǎo)的S-巰基化修飾及其化學(xué)檢測(cè)方法,為H2S相關(guān)生理病理分子機(jī)制的研究提供參考。

    1 S-巰基化修飾

    1.1 S-巰基化修飾研究現(xiàn)狀

    S-巰基化修飾是指H2S修飾靶蛋白中Cys巰基(-SH)或二硫鍵,從而產(chǎn)生-SSH基團(tuán),是繼磷酸化、泛素化、乙酰化和S-亞硝基化等之后新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[15,16]。目前,已有大量研究表明,S-巰基化修飾在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。例如:S-巰基化修飾參與了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)等多個(gè)方面的生物學(xué)過程。此外,S-巰基化修飾還與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),例如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤等[17,18]。因此,對(duì)S-巰基化修飾的研究已成為當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

    目前,通過PubMed檢索關(guān)鍵詞“sulfhydration”發(fā)現(xiàn),與S-巰基化修飾相關(guān)的研究論文共計(jì)290篇。自2009年以來,論文發(fā)表數(shù)量逐年遞增,2021年達(dá)到最高峰,共有49篇,2022年則有31篇。S-巰基化修飾在各種疾病的機(jī)制研究中越來越受到關(guān)注,但大部分研究?jī)H揭示了S-巰基化修飾的水平,而未進(jìn)一步闡明S-巰基化修飾的具體Cys位點(diǎn)。本文總結(jié)了目前已揭示S-巰基化修飾及其修飾的具體Cys位點(diǎn)的研究(Table 1)。

    1.2 S-巰基化修飾與S-亞硝基化修飾之間的關(guān)系

    S-亞硝基化修飾是一種在生物界中廣泛存在的氧化還原修飾類型,是由一氧化氮對(duì)蛋白質(zhì)中Cys巰基(-SH)氧化而產(chǎn)生的。盡管S-巰基化修飾和S-亞硝基化修飾是通過不同的反應(yīng)途徑形成的,但它們都涉及到Cys殘基的修飾,并且都可以影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),S-巰基化和S-亞硝基化修飾通常出現(xiàn)在同一Cys殘基上的相同位點(diǎn),而這兩種修飾對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響顯示出截然相反的作用,S-亞硝基化的結(jié)果是“覆蓋”Cys殘基,S-巰基化修飾增加Cys的親核性和反應(yīng)性,因此,S-亞硝基化修飾通常抑制蛋白質(zhì)的功能,而S-巰基化修飾激活酶的活性[49,50]。例如:甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)的Cys150位點(diǎn),可同時(shí)發(fā)生S-巰基化和S-亞硝基化修飾,S-巰基化修飾增強(qiáng)GAPDH的糖酵解活性高達(dá)7倍,而S-亞硝基化修飾抑制其活性[51]。E3泛素連接酶parkin的同一Cys位點(diǎn)能同時(shí)被S-巰基化和S-亞硝基化修飾,S-巰基化修飾增強(qiáng)Parkin促進(jìn)泛素化和毒蛋白的清除活性,而在帕金森病中發(fā)現(xiàn),Parkin的Cys殘基被S-亞硝基化,抑制了這種催化活性,并導(dǎo)致了引起神經(jīng)毒性的相關(guān)蛋白質(zhì)的聚集[22]。在TNF-a處理細(xì)胞后,H2S對(duì)P65的S-巰基化修飾先出現(xiàn),引起相應(yīng)的啟動(dòng)子的激活,發(fā)揮抗凋亡的作用,隨后,iNOS產(chǎn)生的NO對(duì)P65進(jìn)行S-亞硝基化修飾,并逆轉(zhuǎn)S-巰基化修飾引起的激活作用[21]。除此之外,S-巰基化和S-亞硝基化修飾均會(huì)被硫氧還蛋白系統(tǒng)逆轉(zhuǎn),這種可逆性在體內(nèi)研究中已經(jīng)得到證實(shí)。

    Table 1 Involvement of protein sulfhydration in regulating different proteins

    研究表明,S-巰基化比S-亞硝基化水平更高,在肝中有10%~25%的蛋白質(zhì)被S-巰基化修飾,而被S-亞硝基化修飾的只有1%~2%[49]。H2S對(duì)蛋白質(zhì)的S-巰基化修飾發(fā)生時(shí),除了調(diào)節(jié)S-亞硝基化修飾外,也影響其他幾種翻譯后修飾的水平,例如羰基化修飾,亞磺?;揎椇蚐-谷光甘肽化修飾等,這些修飾共同調(diào)節(jié)機(jī)體生理或病理過程[17][52]。

    2 S-巰基化修飾反應(yīng)

    近年來,隨著H2S S-巰基化修飾關(guān)鍵蛋白質(zhì)隨著研究的不斷深入,其反應(yīng)機(jī)制也逐漸清晰。總的來說,H2S S-巰基化修飾主要有以下5個(gè)類型的反應(yīng):(1)H2S不能直接和蛋白質(zhì)巰基發(fā)生S-巰基化修飾反應(yīng);(2) H2S可與Cys二硫鍵(-S-S)發(fā)生S-巰基化修飾反應(yīng);(3) H2S可與被氧化的Cys巰基發(fā)生S-巰基化修飾反應(yīng);(4) H2S可與Cys次磺酸發(fā)生S-巰基化修飾反應(yīng);(5)H2S可與S-氮化的Cys發(fā)生S-巰基化修飾反應(yīng)生成HSNO或HNO[53](Fig.1)。

    Fig.1 The reactions of sulfhydration (A) H2S can’t directly react with protein Cysteine. (B) H2S can react with Cys disulfide bonds (-S-S). (C) H2S can react with oxidized Cys thiols. (D) H2S can react with Cys sulfonic acid. (E) H2S can react with S-nitrosated Cys to generate HSNO or HNO

    3 S-巰基化修飾的化學(xué)檢測(cè)方法

    目前,檢測(cè)S-巰基化的化學(xué)方法主要有:馬來酰亞胺法(Maleimide assay),改良生物素轉(zhuǎn)換法(Modified biotin switch assay)和標(biāo)記轉(zhuǎn)換法(Tag-switch assay)等。3種方法檢測(cè)S巰基化修飾的共同原理是基于-SH和-SSH基團(tuán)的物理和化學(xué)性質(zhì)的不同,將這3種方法的特點(diǎn)比較詳見下表(Table 2)[53]。

    3.1 馬來酰亞胺法

    馬來酰亞胺法是由約翰霍普金斯大學(xué)的Snyder教授及其團(tuán)隊(duì)在2012年提出,其為一項(xiàng)較為靈敏的用于測(cè)定蛋白質(zhì)S-巰基化的技術(shù)。當(dāng)H2S對(duì)靶蛋白進(jìn)行S-巰基化修飾后,形成的-SSH,由Alexa Fluor 680結(jié)合C2 N-乙酰馬來酰亞胺熒光探針標(biāo)記靶蛋白中Cys上的-SH后,二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)處理可崩解二硫鍵,使-SSH中的-SH脫落,導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱,通過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印或點(diǎn)印跡法直接轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,凝膠成像儀對(duì)紅色熒光條帶進(jìn)行檢測(cè),最終根據(jù)熒光條帶是否減弱來判斷H2S是否對(duì)靶蛋白進(jìn)行了S-巰基化修飾(Fig.2)[21]。

    Fig.2 Schematic diagram of malamide assay for detecting sulfhydration In this assay, sulfhydrated (-SSH) and unsulfhydrated (-SH) protein Cys is immunoprecipitated and allowed to react with Alexa Fluor? 680 C2 maleimide. After remove the excess maleimide, DTT split the disulfide bonds in sulfhydrated (-SSH) but not unsulfhydrated protein, thus resulting in a loss of the fluorescent signal from sulfhydrated (-SSH) protein, The samples were separated by SDS-PAGE, dot-blot or transferred to PVDF membrane, and the fluorescent signal in the membrane was detected. Finally, determination of target protein sulfhydration based on the weakening of fluorescence bands

    該方法使用不同顏色的熒光探針同時(shí)檢測(cè)S-巰基化和S-亞硝基化,但是由于S-亞硝基化的存在和H2S與含亞磺酸蛋白質(zhì)等的非特異性反應(yīng),削弱了其檢測(cè)S-巰基化的可信度。此外,馬來酰亞胺會(huì)與胺類反應(yīng),因此,當(dāng)S-巰基化修飾水平過低時(shí),廣泛的標(biāo)記會(huì)產(chǎn)生較高的背景,從而淹沒其信號(hào)強(qiáng)度的變化,使檢測(cè)靈敏度降低[53]。另外,該方法在最后的信號(hào)檢測(cè)環(huán)節(jié),需要用到檢測(cè)熒光的凝膠成像系統(tǒng),而一般實(shí)驗(yàn)室配備的凝膠成像系統(tǒng)只有檢測(cè)紫外和化學(xué)發(fā)光信號(hào)的功能,建議進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前檢查儀器配備是否符合要求。

    Table 2 Comparison of three detection methods of sulfhydration

    本文先前的研究揭示,H2S通過S-巰基化抗體調(diào)節(jié)抗體補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫反應(yīng),研究發(fā)現(xiàn),H2S通過S-巰基化修飾切斷免疫球蛋白(IgG)結(jié)構(gòu)中的二硫鍵,使其喪失功能,進(jìn)而抑制IgG介導(dǎo)的免疫反應(yīng), 提示H2S可能用于某些體液免疫疾病的治療(Fig.3)[54]。作者在S-巰基化修飾方法積累了一些的經(jīng)驗(yàn),總結(jié)方法步驟見Fig.4。

    Fig.3 The S-sulfhydrationof IgG[54](Zhang Z, et al.Int Immunopharmacol.2019) (A) Schematic diagram of the method used for detection of IgG sulfhydration. (B) Maleimide-labelled IgG samples analyzed by SDS-PAGE. (C) Dot blot analysis of Maleimide-labelled IgG samples. (D) Densitometric analysis of the intensity of bands between IgG samples treated with or without NaHS. (E) Quantitative calculation of sulfhdrated IgG by H2S. Data are representative of four independent experiments and values are expressed in mean ± SE. *P < 0.05, ** P <0.01 vs. control

    Fig.4 Detection of sulfhydration by Malamide assay The author’s detailed steps and experience summarized during their research relate to sulfhydration detection by Malamide assay

    3.2 改良生物素轉(zhuǎn)換法

    生物素轉(zhuǎn)換法起初被用于S-亞硝基化的檢測(cè),2009年經(jīng)Mustafa等改良后被用于S-巰基化檢測(cè),并命名為改良生物素轉(zhuǎn)化法[55]。檢測(cè)原理及方法:(1)采用烷化劑S-甲基甲硫代磺酸鹽(methyl methanethiosulfonate,MMTS)封閉未被修飾的Cys巰基,隨后用丙酮移除MMTS;(2)應(yīng)用生物素-HPDP ( N-[6-(biotinamido)hexyl]-3’-(2’-pyridyldithio)propionamide, Biotin-HPDP) 標(biāo)記S-巰基化修飾過的Cys殘基-SSH;(3)利用相應(yīng)的生物素抗體識(shí)別被生物素-HPDP標(biāo)記的S-巰基化修飾蛋白質(zhì),通過使用鏈霉親和素偶聯(lián)物與被生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合,富集S-巰基化蛋白質(zhì);(4)Western 印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)的S-巰基化水平(Fig.5)[56]。

    Fig.5 Schematic diagram of modified biotin switch assay for detecting sulfhydration MMTS was firstly applied to block the unsulfhydrated (-SH) protein Cys, then MMTs was removed by acetone and the sulfhydrated (-SH) protein Cys was labeled with Biotin-HPDP. These labeled Cys are recognized by the corresponding biotin antibodies and enriched using streptavidin-conjugated agarose. Finally, the sulfhydration levels of the proteins are detected by Western blot

    一開始MMTS被認(rèn)為只封閉-SH,而不與-SSH發(fā)生反應(yīng),但是,2013年Carroll及同事發(fā)現(xiàn),MMTS不僅可以與小分子含-SSH的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)(例如GSSH),而且可以與大分子-SSH的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[57]。盡管存在這些問題,生物素改良方法仍舊被用于S-巰基化修飾的檢測(cè),并發(fā)現(xiàn)敲除CSE[47]和CBS[29]可以降低生物素-HPDP標(biāo)記/S-巰基化修飾水平,而給予H2S處理則升高生物素-HPDP標(biāo)記/S-巰基化修飾水平。那么,MMTS與-SH和-SSH均發(fā)生反應(yīng),卻還能檢測(cè)到S-巰基化修飾水平的變化?目前并不清楚,一種可能的解釋認(rèn)為MMTS與-SSH的反應(yīng)比-SH快,生成R-S-S-S-Me,進(jìn)一步與游離-SH發(fā)生反應(yīng)再次生成原始的-SH,最終的結(jié)果還是蛋白質(zhì)上的-SH被封閉,而-SSH被生物素-HPDP標(biāo)記,S-巰基化修飾得以被檢測(cè)。鑒于該方法的設(shè)計(jì)中涉及的化學(xué)反應(yīng)及選擇性較差等問題,加上S-巰基化修飾的背景高達(dá)25%,其中大部分容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[52]。因此,使用該方法還應(yīng)謹(jǐn)慎考慮。建議配合使用質(zhì)譜法有助于提高分析的可靠性,除此之外,可以通過使用敲除CSE/CBS來進(jìn)一步確定S-巰基化修飾水平。

    3.3 標(biāo)記轉(zhuǎn)換法

    標(biāo)記轉(zhuǎn)換法是基于被S-巰基化修飾的Cys(含-SSH)被巰基封閉劑-甲基磺酰基苯并噻唑(methylsulfonyl benzothiazole,MSBT)烷基化,并形成的二硫鍵要比蛋白質(zhì)中存在的二硫鍵顯示出更強(qiáng)的親核性這一原理,通過應(yīng)用一個(gè)同時(shí)具有親核性和生物素報(bào)告分子作為標(biāo)記轉(zhuǎn)換試劑,只標(biāo)記被S-巰基化修飾的蛋白質(zhì),不與被封閉的-SH基團(tuán)發(fā)生結(jié)合反應(yīng),選擇性的檢測(cè)S-巰基化修飾。簡(jiǎn)單的反應(yīng)步驟為:第一步,MSBT或者它的水溶性類似物MSBT-A先用來封閉-SH和-SSH;第二步,應(yīng)用被生物素化的氰基乙酸甲酯衍生物作為親核試劑標(biāo)記與封閉劑結(jié)合的二硫鍵;第三步,采用鏈霉親和素磁珠與被標(biāo)記的二硫鍵上的生物素發(fā)生結(jié)合反應(yīng)并富集,最終利用Western 印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)的S-巰基化修飾水平(Fig.6)[58, 59]。

    該方法對(duì)S-巰基化修飾(-SSH)選擇性已經(jīng)被證明,研究初步表明,標(biāo)記轉(zhuǎn)換法對(duì)S-巰基化修飾的檢測(cè)是具備一定特異性的,由于該方法并不與谷胱甘肽化、亞磺?;⑽幢恍揎椀呐Q灏椎鞍踪|(zhì)等修飾發(fā)生反應(yīng)。次磺酸與氰基乙酸甲酯的反應(yīng)性是一個(gè)潛在干擾檢測(cè)的問題,解決這個(gè)問題可以通過在MSBT封閉-SH之前,用二甲酮封閉次磺酸來防止該非特異性反應(yīng)的發(fā)生。也有研究者建議,用雙甲酮提前處理細(xì)胞裂解物能避免潛在的交叉反應(yīng)[58]。

    一些研究者提出MSBT不能穿透細(xì)胞膜,不能檢測(cè)出活細(xì)胞內(nèi)S-巰基化修飾的水平。為提高檢測(cè)的靈敏性,Wedmann等人在2016年合成了2種氰基乙酸甲酯的衍生物,用BODIPY moiety (CN-BOT) 標(biāo)記細(xì)胞,Cy3-dye (CNCy3) 標(biāo)記細(xì)胞裂解物,進(jìn)一步改進(jìn)了標(biāo)記轉(zhuǎn)換法[57]。該方法為未來研究闡明H2S信號(hào)通路的真實(shí)分子機(jī)制和S-巰基化修飾的檢測(cè)開啟了一個(gè)新的起點(diǎn)。然而,該方法是否具有更高的特異性和靈敏性,仍需要更多的大量研究進(jìn)行驗(yàn)證。

    4 問題與展望

    盡管有多種檢測(cè)S-巰基化的方法用來研究S-巰基化修飾發(fā)揮的作用,但是S-巰基化修飾的研究仍處于初級(jí)階段,該領(lǐng)域需要研發(fā)特異性更高、選擇性更強(qiáng)并且能夠達(dá)到動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測(cè)S-巰基化修飾的方法。

    H2S介導(dǎo)的S-巰基化修飾靶蛋白廣泛存在于各組織/細(xì)胞中。但是,(1)是否存在更多未知的蛋白質(zhì)被S-巰基化修飾?(2)已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的S-巰基化修飾蛋白質(zhì)的具體Cys位點(diǎn)以及相應(yīng)的生理和病理作用是什么?(3)S-巰基化修飾蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律是什么?(4)在臨床中,有關(guān)S-巰基化修飾在疾病中有什么作用及意義?有待闡明。相信未來隨著S-巰基化修飾研究的逐步推進(jìn),S-巰基化修飾關(guān)鍵蛋白質(zhì)可能成為潛在的新靶點(diǎn),用于治療性干預(yù)和藥物設(shè)計(jì),將有助于促進(jìn)H2S相關(guān)藥物的發(fā)展和應(yīng)用。

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