產(chǎn)油霉菌油脂提取方法的研究

謝瑩 霍秋娟 吳彥雙 張震 劉爽 吳辰宇

摘要：以產(chǎn)油霉菌雅致小克銀漢霉為例進(jìn)行了前處理及油脂提取方法的研究，采用了酸熱法、反復(fù)凍融法以及超聲波和酶結(jié)合法破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂以及乙醚、石油醚索氏抽提法直接提取油脂。結(jié)果表明，超聲波和酶結(jié)合使用破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂的效果較好；索式抽提法采用石油醚為提取劑效果較好。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測油脂脂肪酸組成為棕櫚酸25.10%，油酸25.17%，亞油酸20.99%，硬脂酸4.78%。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)油霉菌 細(xì)胞破碎 提取 油脂得率

中圖分類號： Q819 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號1672-3791（2015）08（b）-0000-00

開發(fā)利用微生物進(jìn)行油脂的生產(chǎn)已經(jīng)成為當(dāng)今的一大熱點(diǎn)，不但可以作為動植物油脂的必要補(bǔ)充，在促進(jìn)人類保健方面起著越來越重要的作用，還可以作為生產(chǎn)生物柴油的油源，對解決當(dāng)今世界各國油脂原料供應(yīng)問題、促進(jìn)生物柴油的推廣使用、解決環(huán)境問題和人類能源問題等都具有重要的意義[1-2]。由于不同種類的微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同，如霉菌有堅(jiān)韌 的細(xì)胞壁，使我們不能直接獲得油脂或者只能獲得少量油脂，因此，提取前用前處理方法破壞菌體細(xì)胞就顯得非常必要[3]。本研究主要以產(chǎn)油霉菌雅致小克銀漢霉為例進(jìn)行了前處理及油脂提取方法的研究，為今后大規(guī)模生產(chǎn)微生物油脂奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

雅致小克銀漢霉菌株：中國工業(yè)菌種保藏中心購買。

1.2培養(yǎng)基及主要試劑

（1）PDA固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂16 g，蒸餾水1000mL，115 ℃滅菌20 min。

（2）限氮培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，（NH4）2SO4 1.5 g/L，KNO3 0.5 g，KH2PO4 7 g/L，NaH2PO4 2 g/L，蒸餾水1000 mL，115 ℃滅菌20 min。

（3）各種試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 雅致小克銀漢霉菌株的培養(yǎng)

將PDA固體培養(yǎng)基斜面低溫保存的雅致小克銀漢霉菌株接入到限氮培養(yǎng)基中，于28 ℃，180 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)5 d；離心收集菌體，用于油脂提取研究。

1.3.2 油脂提取方法

采用酸熱法[4]、反復(fù)凍融法[5]以及超聲波和酶結(jié)合法[6]破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂[7]以及乙醚、石油醚索氏抽提法[8]直接提取油脂。

1.3.3油脂脂肪酸成分分析

稱取油脂0.5 g，加1%硫酸-甲醇20 mL與70 ℃水浴加熱30 min，加入20 mL正己烷提取甲酯化產(chǎn)物，取出上清，再用10 mL正己烷清洗一次，合并上清，放入瓶中。用GC-MS-2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測油脂成分。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸熱法提取油脂的研究

用不同濃度的鹽酸溶液對菌株進(jìn)行細(xì)胞破碎，用甲醇-氯仿溶液萃取，計(jì)算油脂得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 鹽酸濃度對油脂得率的影響

結(jié)果表明，油脂得率與鹽酸濃度有關(guān)，在一定的濃度范圍內(nèi)，得率隨濃度的增加而增加，超過這個范圍后，得率隨濃度的增加而減小，可能由于鹽酸濃度過高，會水解油脂，使收率降低。

2.2 反復(fù)凍融法提取油脂的研究

使用凍融法對菌株進(jìn)行破碎，甲醇-氯仿提取油脂?？疾觳煌瑑鋈诖螖?shù)對油脂提取的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 凍融次數(shù)對油脂得率的影響

隨著凍融次數(shù)的增加，油脂得率增加，但增加的不明顯。此方法破碎細(xì)胞，提取的油脂量較低。反復(fù)凍融法是通過溫度的突然變化，在細(xì)胞內(nèi)形成冰粒， 發(fā)生溶脹破碎，由于耗時(shí)較長，部分細(xì)胞產(chǎn)生了自溶使油脂含量減少。

2.3 超聲波與酶結(jié)合法提取油脂的研究

先用纖維素酶處理菌體細(xì)胞壁，然后改變超聲次數(shù)破碎菌體，用甲醇-氯仿提取油脂，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲次數(shù)對油脂得率的影響

該法采用了酶法和機(jī)械法相結(jié)合，酶作用后大部分細(xì)胞壁裂解，再利用超聲波產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動作用使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使細(xì)胞破。結(jié)果表明，破碎后測得的油脂含量隨超聲次數(shù)的增加而增大，當(dāng)達(dá)到一定次數(shù)時(shí)，油脂得率趨于穩(wěn)定，此方法提取的油脂量與其它方法相比最高，油脂得率達(dá)24%。

2.4 索式抽提法

分別以乙醚和石油醚為溶劑，在相同條件下用索式抽提法提取油脂，測得的油脂得率分別為12%和14.8%，表明石油醚的抽提效果較乙醚好。選擇石油醚為提取劑，測定不同時(shí)間的油脂得率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 抽提時(shí)間對油脂得率的影響

上圖表明抽提時(shí)間越長，油脂得率越高，在抽提9 h到10 h時(shí)，油脂得率升高明顯。

2.5 油脂脂肪酸成分分析

使用GC-MS-2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測油脂成分，結(jié)果如表1所示。經(jīng)過分析測定該菌株油脂的成分主要是棕櫚酸、油酸、亞油酸、硬脂酸，與植物脂肪酸的成分相似，可作為生物柴油的原料。

表1 菌株的脂肪酸組成

名稱

分子量

脂肪酸組成%

油酸甲酯

296

26.23

棕櫚酸甲酯

270

25.45

亞油酸甲酯

294

19.79

硬脂酸甲酯

298

5.67

3 結(jié)論

（1）分別研究了酸熱法、反復(fù)凍融法以及超聲波和酶結(jié)合法破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂以及乙醚、石油醚索氏抽提法直接提取油脂，將幾種方法相比較，結(jié)果表明超聲波和酶結(jié)合使用破碎細(xì)胞，甲醇-氯仿提取油脂的效果較好；索式抽提法采用石油醚為提取劑效果較好。

（2）對提取的油脂進(jìn)行了成分的分析，其中棕櫚酸甲酯占25.10%，亞油酸甲酯占20.99%，油酸甲酯占25.17%，硬脂酸甲酯占4.78%，與植物油相似。

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