馬鈴薯提取物對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡、增殖的影響及機(jī)制探討

馬鈴薯提取物對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡、增殖的影響及機(jī)制探討

姚星宇1，石有2，賈麗秋3，趙鵬偉3，孫鵬3，房啟林4，王桂卿4，楊麗敏3

(1呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021400；2內(nèi)蒙古蒙健生物科技有限公司；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)；4呼倫貝爾市人民醫(yī)院)

摘要：目的探討馬鈴薯提取物對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抑制作用及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的影響。方法培養(yǎng)A549細(xì)胞，分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。觀察組分別加入5.0、12.5、25.0、50.0 μL的馬鈴薯提取物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。對(duì)照組不加入馬鈴薯提取物。各組干預(yù)24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察A549細(xì)胞凋亡情況。采用MTT法檢測各組492 nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。采用RT-PCR法檢測各組Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果熒光顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞生長旺盛，分布稠密，形態(tài)飽滿呈梭形，觀察組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的凋亡現(xiàn)象。同時(shí)間點(diǎn)，馬鈴薯提取物濃度高者細(xì)胞增殖抑制率較高(P均<0.05)；馬鈴薯提取物同一濃度時(shí)，干預(yù)時(shí)間長者細(xì)胞增殖抑制率較高(P均<0.05)。觀察組不同濃度馬鈴薯提取物干預(yù)后，Bax mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，Bcl-2 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 馬鈴薯提取物可促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；非小細(xì)胞肺癌；A549細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Bcl-2基因；Bax基因

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.005

中圖分類號(hào)：R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳重大課題資助項(xiàng)目(2013150103000119)。

作者簡介：第一姚星宇(1973-)，女，碩士學(xué)位，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樯窠?jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療。E-mail:2412602429@qq.com

作者簡介：通信楊麗敏(1960-)，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幪崛　⒉≡⑸锛懊庖?。E-mail:2412602429@qq.com

收稿日期：(2015-03-20)

Effects of potato extracts on apoptosis and proliferation of non-small-cell

lung cancer cells and its mechanism

YAOXing-yu1, SHI You, JIA Li-qiu, ZHAO Peng-wei, SUN Peng, FANG Qi-lin,

WANGGui-qing,YANGLi-min

(1Sino-MongolianHospitaloftheHulunbuir,Hulunbuir021000,China)

Abstract:Objective To investigate the inhibitory effect of potato extracts on non-small-cell lung cancer (NSCLC) A549 cells and the influence on apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2. MethodsThe cultured A549 cells were divided into the control group and observation group. Different concentrations of potato extracts (5.0, 12.5, 25.0 and 50.0 μL) were added into the A549 cells of the observation group, and then the A549 cells were cultured for 24, 48 and 72 h (3 holes were set in each concentration). The control group was not added with any potato extract. The apoptosis was observed after 24 h of treatment by inverted fluorescence microscope. And the inhibition rate was obtained by OD value in 492nm by MTT method. The Bax and Bcl-2 mRNA expression was detected by RT-PCR. Results Under the fluorescence microscope, the cells were growing strong, the distribution was dense and the shape of the cells was spindle. The cells in the observation group showed apoptosis at different time points. Meanwhile, the cell inhibition rate in the group with high concentration of potato extracts was higher (all P<0.05). The cell inhibition rate was also higher in the group with the same concentration but longer intervention time (all P<0.05). Bax mRNA expression in each observation groups was higher than that of the control group. However, Bcl-2 expression was lower than that of the control group (all P<0.05). ConclusionPotato extracts can promote the apoptosis of A549 cells and inhibit the cell proliferation, whose mechanism may be related to up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2 expression.

Key words: potatoes; non-small-cell lung cancer; A549 cells; apoptosis; Bcl-2 gene; Bax gene

肺癌已成為導(dǎo)致患者死亡最常見的惡性腫瘤類型[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型。NSCLC的治療以化療為主[2]。但NSCLC對(duì)化療藥物的敏感度低，易產(chǎn)生耐藥性，消化道反應(yīng)及腎毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生率高[3]。因此，尋找高效、安全的抗腫瘤藥物已成為NSCLC治療研究的熱點(diǎn)。Bax、Bcl-2分別為最主要的促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的蛋白，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4]。馬鈴薯具有抗氧化、降低膽固醇及抗氧化等多種作用[5]。但馬鈴薯的抗腫瘤作用尚不明確。2013年9月～2014年10月，我們觀察了馬鈴薯提取物對(duì)人NSCLC A549細(xì)胞體外增殖和凋亡的作用，探討馬鈴薯提取物的抗腫瘤作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑NSCLC A549細(xì)胞株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。馬鈴薯提取物由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病原微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，采用低溫冷凍離心法提取，所得提取物中氨基酸含量為6.8 g/L。DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青鏈霉素雙抗、MTT、DMSO、胰蛋白酶均購自Sigma公司。PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的雙抗DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為觀察組及對(duì)照組，培養(yǎng)12 h后，待細(xì)胞生長至貼壁鋪滿后，接種于96孔板中，每孔100 μL懸液。觀察組分別加入5.0、12.5、25.0、50.0 μL的馬鈴薯提取物，每孔最終總體積均為200 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、飽和濕度下分別培養(yǎng)24、48、72 h。對(duì)照組不加入馬鈴薯提取物，分別培養(yǎng)24、48、72 h。

1.3細(xì)胞凋亡情況觀察各組干預(yù)后24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察A549細(xì)胞凋亡形態(tài)變化。

1.4細(xì)胞增殖情況觀察采用MTT法，各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT溶液15 μL，4 h后去掉上清，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀測492 nm處吸光度值(A492值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(觀察組A492-對(duì)照組A492)/對(duì)照組A492]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.5Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)檢測采用RT-PCR法。根據(jù)MTT結(jié)果，選取12.5、25.0及50.0 μL馬鈴薯提取物作用于觀察組細(xì)胞培養(yǎng)48 h。對(duì)照組不加入馬鈴薯提取物，培養(yǎng)48 h。TRIzol法提取兩組總RNA，Bax、Bcl-2反應(yīng)條件均為94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s共30個(gè)循環(huán)，72 ℃退火8 min。用1%瓊脂糖凝膠行電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，測定目的RNA擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH的積分光密度值(IOD)，計(jì)算兩者的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1馬鈴薯提取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響熒光顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞生長旺盛，分布稠密，形態(tài)飽滿呈梭形。觀察組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的凋亡，細(xì)胞分布稀疏，細(xì)胞體積明顯縮小，多數(shù)細(xì)胞呈圓形，核質(zhì)比例明顯增大，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，此變化隨馬鈴薯提取物濃度的升高更為明顯。

2.2馬鈴薯提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響同時(shí)間點(diǎn)，馬鈴薯提取物濃度高者細(xì)胞增殖抑制率較高(P均<0.05)；同一馬鈴薯提取物濃度時(shí)，干預(yù)時(shí)間長者細(xì)胞增殖抑制率較高(P均<0.05)。見表1。

表1　觀察組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較 ± s)

注：與同時(shí)間點(diǎn)較低一級(jí)濃度時(shí)比較，*P<0.05；與同一濃度時(shí)前一時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.3各組Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)比較觀察組不同濃度馬鈴薯提取物干預(yù)后，Bax mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，Bcl-2 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見表2。

表2　兩組Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，天然植物提取物在腫瘤治療和預(yù)防中具有積極作用，可以抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，減輕放化療的不良反應(yīng)，可改善人體對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥性。目前，喜樹堿、長春新堿、紫杉醇等天然植物提取物已廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，具有不良反應(yīng)小、療效好的優(yōu)勢(shì)，在治療腫瘤中具有重要作用[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯富含人類所需的8種必需氨基酸，包括谷類中含量較少的的賴氨酸和色氨酸、大量的膠原和黏液多糖等物質(zhì)，有助于保持人體動(dòng)脈血管的彈性及關(guān)節(jié)面和漿膜腔內(nèi)的潤滑，防止腎臟和肝臟的結(jié)締組織發(fā)生萎縮[5]。近年研究表明，馬鈴薯的多酚類成分原花青素具有強(qiáng)有力的抗氧化、清除自由基及改善體循環(huán)的特殊功效，并有防止心血管疾病、抗腫瘤、抗輻射、抗血小板聚集的作用[7,8]。本研究發(fā)現(xiàn)，熒光顯微鏡下觀察組A549細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的凋亡，觀察組馬鈴薯提取物濃度高者細(xì)胞增殖抑制率較高、干預(yù)時(shí)間長者細(xì)胞增殖抑制率較高，提示不同濃度的馬鈴薯提取物均可抑制A549細(xì)胞增殖，且隨著時(shí)間延長、抑制作用增強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的程序性死亡，是受多種凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控的復(fù)雜生化反應(yīng)。凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)及功能改變與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，是影響腫瘤治療效果的重要因素[9]。Bcl-2家族蛋白是目前研究最多的凋亡相關(guān)蛋白[10,11]。Bax、Bcl-2是最常見的Bcl-2家族蛋白成員。Bcl-2主要存在于細(xì)胞器膜上，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[12,13]。Bax是Bcl-2家族中最具代表性的促凋亡蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中，可與自身形成同源二聚體，或與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體。細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要取決于促凋亡與抑凋亡蛋白間的相對(duì)濃度[14]。當(dāng)Bc1-2濃度高于Bax時(shí)，細(xì)胞趨于存活；當(dāng)Bax濃度高于Bc1-2時(shí)，細(xì)胞則趨于凋亡[15～17]。此外，Bax可對(duì)Bcl-2的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞中Bax增加時(shí)，可促進(jìn)Bax同源二聚體的形成，拮抗Bcl-2的作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；反之，當(dāng)Bcl-2增多時(shí)，Bcl-2易于與Bax形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組不同濃度馬鈴薯提取物干預(yù)后，Bax mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，Bcl-2 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，提示馬鈴薯提取物抑制A549細(xì)胞增殖的作用可能與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Jemal A, SiegeI R, Xu J, et al. Cancer statistics,2010[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):133-134.

[2] 孫彬栩,楊佩穎.非小細(xì)胞肺癌多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的研究進(jìn)展[J]. 疑難病雜志2013,12(1):77-79.

[3] 姜彪,李積德,趙君慧,等.非小細(xì)胞肺癌治療進(jìn)展[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2012,10(9):10-12.

[4] 秦叔逵,黃勇,隋東虎,等.不同鉑類聯(lián)合紫杉類或長春瑞濱對(duì)非小細(xì)胞肺癌荷瘤裸鼠抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2011,16(3):206-210.

[5] 張秋燕,張福平.馬鈴薯品種的營養(yǎng)成分分析[J].中國食物與營養(yǎng),2010,21(6):75-77.

[6] 吳唐維,寧勇,陳衛(wèi)群.微RNA參與中藥抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2013,42(13): 1536-1538.

[7] Malencic D, Maksimovic Z, Popovic M, et al. Polyphonelcontents and antioxidant activity of soybean seed Extracts[J]. Bioresore Technol, 2008,99(14):6688-6691.

[8] 李敏,劉磊,郭玉蓉,等.馬鈴薯多酚氧化酶的特性研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,40(2):189-192.

[9] 趙彥超,顧耘.細(xì)胞凋亡通路研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2013,41(4):285-288.

[10] Gómez-Fernández JC. Functions of the C-terminal domains of apoptosis-related proteins of the Bcl-2 family[J]. Chem Phys Lipids, 2014,183(7):59-68.

[11] Tokar T, Ulicny J. The mathematical model of the Bcl-2 family mediated MOMP regulation can perform a non-trivial pattern recognition[J]. PLoS One, 2013,8(12):81-86.

[12] 李希波,趙健,王善政,等. Bcl-2/Bax基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)異常及其與吸煙的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥,2006,46(7):18-19.

[13] 陽諾,冼磊,陳銘伍,等.非小細(xì)胞肺癌患者Bc-l 2蛋白的表達(dá)及意義[J].廣西醫(yī)學(xué),2011,33(5):543-545.

[14] Martinou JC, Youle RJ. Mitochondria in apoptosis: Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J]. Dev cell, 2011,21(1):92-101.

[15] Otterson MF, Nie L, Schmidt JL, et al. EUK-207 protects human intestinal microvascular endothelial cells (HIMEC) against irradiation-induced apoptosis through the Bcl-2 pathway[J]. Life Sci, 2012,22(91):15-16.

[16] Kim J, Parrish AB, Kurokawa M, et al. Rsk-mediated phosphorylation and 14 -3 -3ε binding of Apaf -1 suppresses cytochrome c -induced apoptosis [J]. EMBO J, 2012,31(7):1279-1292.

[17] Golestani EB, Sanati MH. Expression and prognostic significance of bcl-2 and bax in the progression and clinical outcome of transitional bladder cell carcinoma[J]. Cell J, 2014,15(4):356-363.