環(huán)磷腺苷葡胺對骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化的誘導(dǎo)作用及其機制探討

·論著·

環(huán)磷腺苷葡胺對骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化的誘導(dǎo)作用及其機制探討

李丹1，張金國1，尉希清1，劉巖松2

(1濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濟寧272029；2山東省腫瘤醫(yī)院)

摘要：目的探討環(huán)磷腺苷葡胺(MCA)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)向心肌細胞分化的機制。方法體外培養(yǎng)BMSCs，將第3代BMSCs接種于96孔板中，分為對照組、MCA組、MCA+LY294002組。MCA組加入1×10-3 mmol/L的MCA，MCA+LY294002組加PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002預(yù)處理30 min后，再加入1×10-3 mmol/L的MCA，兩組均誘導(dǎo)3 d后換為普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。對照組不做任何處理。培養(yǎng)4周后，采用熒光定量PCR法檢測心肌特異性基因GATA結(jié)合蛋白4(GATA-4)、縫隙連接蛋白43(CX43) mRNA，采用Western blot法檢測PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化叉形頭轉(zhuǎn)錄因子的O亞型(p-Foxo3a)、DOK家族蛋白(DOK5)]的表達。結(jié)果MCA組、MCA+LY294002組GATA-4、CX43 mRNA表達均高于對照組(P均<0.01)，MCA+LY294002組GATA-4、CX43 mRNA表達均低于MCA組(P均<0.01)。MCA組PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5表達均高于對照組及MCA+LY294002組(P均<0.01)。結(jié)論MCA可誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細胞，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：環(huán)磷腺苷葡胺；骨髓間充質(zhì)干細胞；心肌細胞；細胞分化

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.001

中圖分類號：R329.2文獻標志碼：A

基金項目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2013WSB34007)。

作者簡介：第一李丹(1986-)，女，在讀研究生，主要研究方向為心血管疾病。E-mail： 527843619@qq.com

作者簡介：通信張金國(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為心血管疾病 。E-mail： cck112000@aliyun.com

收稿日期：(2015-07-20)

Induction of meglumine adenosine cyclophosphate on bone marrow mesenchymal

stem cells differentiating into cardiomyocytes and the mechanism

LIDan1, ZHANG Jin-guo, WEI Xi-qing, LIU Yan-song

(1AffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity,Jining272029,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the mechanism of meglumine adenosine cyclophosphate (MCA) inducing the bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) differentiating into cardiomyocytes. MethodsBMSCs were cultured in vitro, and the third generation of BMSCs were inoculated into 96 hole boards, which were then divided into the control group, MCA group and MCA + LY294002 group. The MCA group was added with 1×10-3 mmol/L MCA , the MCA + LY294002 group was added with PI3K/AKT signaling pathway specific inhibitor 30 min pretreated with LY294002, and then was added with 1×10-3 mmol/L MCA. After induction for 3 days, the conventional culture medium was used in the two groups to continue the culture. The control group was not treated. After 4 weeks, the mRNA expression of myocardial specific GATA gene binding protein 4 (GATA-4) and gap junction protein 43 (Cx43) was detected by fluorescence quantitative PCR. The expression of PI3K/AKT pathway related proteins in each group, including phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), serine/threonine protein kinase (Akt), a forked head transcription factor O subtype (p-Foxo3a) and the DOK family proteins (DOK5), was detected by Western blotting. ResultsThe expression of GATA-4 and CX43 mRNA in the MCA group and MCA + LY294002 group was higher than that of the control group (all P<0.01), the expression of GATA-4 and CX43 mRNA in the MCA + LY294002 group was lower than that in the MCA group (all P<0.01). The expression of PI3K, p-AKT, p-Foxo3a and DOK5 in the MCA group was higher than that in the control group and MCA + LY294002 group (all P<0.01). ConclusionMCA can induce BMSCs differentiating into cardiomyocytes, and its mechanism may be related to the activation of PI3K/AKT signaling pathway.

Key words: meglumine adenosine cyclophosphate; bone marrow mesenchymal stem cells; myocardial cells; cell differentiation

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下可以分化為骨、軟骨、神經(jīng)、心肌等細胞[1～4]，成為誘導(dǎo)分化的理想細胞。研究證實，BMSCs誘導(dǎo)分化后的細胞可用于治療慢性缺血性心力衰竭，改善患者的生存收益，提示BMSCs具有向心肌細胞分化的潛能[5]。環(huán)磷腺苷葡胺(MCA)可誘導(dǎo)BMSCs向心肌細胞分化[6,7]。但MCA誘導(dǎo)BMSCs向心肌細胞分化的機制尚不明確。磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)是與細胞增殖、分化有關(guān)的細胞內(nèi)經(jīng)典信號通路。2015年1～6月，我們應(yīng)用MCA誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細胞，檢測心肌細胞PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達，探討MCA誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細胞的機制。

1材料與方法

1.1動物及試劑清潔健康SD大鼠1只，體質(zhì)量80 g左右，雌雄不限，由濟寧魯抗生物技術(shù)有限公司提供。DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(TaKaRa公司)，單克隆兔抗大鼠磷酸化AKT/蘇氨酸蛋白(p-AKT)抗體、磷酸化叉形轉(zhuǎn)錄因子的O亞型(p-Foxo3a)抗體(CST公司)，單克隆兔抗大鼠DOK家庭蛋白(DOK5)抗體(Abcom公司)

1.2BMSCs提取、培養(yǎng)將1只大鼠脫臼處死，取雙側(cè)股骨及脛骨，采用周榮等[7]報道的方法，通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法建立BMSCs體外培養(yǎng)體系。

1.3細胞分組及干預(yù)將第3代BMSCs細胞接種于96孔板中，分為對照組、MCA組、MCA+LY294002組。MCA組加入1×10-3mmol/L的MCA，誘導(dǎo)3 d后換為普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。MCA+LY294002組加入PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002預(yù)處理30 min后，再加入1×10-3mmol/L的MCA，誘導(dǎo)3 d后換為普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。對照組不做任何處理。共培養(yǎng)4周。

1.4心肌特異基因表達檢測4周后，采用熒光定量PCR法檢測心肌特異基因GATA結(jié)合蛋白4(GATA-4)、縫隙連接蛋白43(CX43)mRNA的表達。提取細胞總RNA，配制相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。采用2-ΔΔCT計算GATA-4、CX43 mRNA的相對表達量。

1.5PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達檢測采用Western blot法檢測各組PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5的表達。通過化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影凝膠系統(tǒng)成像，利用Image J軟件通過比較條帶灰度值的方法計算各蛋白的相對表達量。

2結(jié)果

2.1各組心肌特異基因表達比較MCA組、MCA+LY294002組GATA-4、CX43 mRNA表達均高于對照組(P均<0.01)，MCA+LY294002組GATA-4、CX43 mRNA表達均低于MCA組(P均<0.01)。詳見表1。

表1　各組心肌特異基因表達比較 ± s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與MCA+LY294002組比較，#P<0.01。

2.2各組PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達比較MCA組PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5表達均高于MCA+LY294002組及對照組(P均<0.01)。詳見表2。

表2　各組PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達比較

注：與MCA組比較，*P<0.01。

3討論

心臟疾病是嚴重危害患者健康的重大疾病，由于壞死后的心肌細胞不能再生，對患者的治療及預(yù)后均存在較大影響。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可被誘導(dǎo)分化為心肌細胞，為心臟疾病的治療帶來了新的曙光[8]。MSCs移植治療可改善缺血性心肌病患者的左室收縮功能，且臨床主要不良事件發(fā)生較少[5]。目前可以通過化學(xué)藥物、細胞因子、模擬體內(nèi)微環(huán)境等作用方式誘導(dǎo)干細胞向心肌細胞分化，其中化學(xué)藥物應(yīng)用廣泛，如二甲基亞砜(DMSO)可誘導(dǎo)小鼠胚胎性癌細胞P19衍生的P19CL6細胞系分化為心肌細胞，5-氮胞苷可誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為心肌細胞[9～11]。而DMSO、5-氮胞苷等藥物雖可誘導(dǎo)干細胞分化為心肌細胞，但誘導(dǎo)率最高僅30%，而且對細胞的毒性較大，尚不能應(yīng)用于體內(nèi)研究[12]。MCA是環(huán)磷腺苷的衍生物，為非洋地黃類強心藥物，由環(huán)磷腺苷與葡甲胺結(jié)合而成，具有較強的脂溶性，易于透過脂溶性細胞膜進入心肌內(nèi)發(fā)揮作用[13]。周榮等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在采用1×10-3mmol/L的MCA誘導(dǎo)3 d的條件下，可以發(fā)揮最佳的誘導(dǎo)BMSCs向心肌細胞分化的效果。并且，MCA具有良好的生物相容性，細胞毒性較小，可以應(yīng)用于人體疾病的治療。但目前對MCA誘導(dǎo)BMSCs向心肌細胞分化的機制尚不明確。

PI3K/AKT是參與細胞增殖、分化、凋亡等多種功能調(diào)節(jié)的經(jīng)典信號通路，廣泛存在于細胞中。 DOK家族蛋白是一類接頭分子，作為多種蛋白酪氨酸激酶的底物，參與了不同的信號傳導(dǎo)通路，在心肌細胞的生長、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。DOK5在神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌和心肌中高表達，提示在神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)的發(fā)育過程中具有重要作用。Wen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在用DMSO誘導(dǎo)P19CL6細胞向心肌細胞分化時，PI3K/AKT通路在分化早期階段被激活，使Foxo3a被AKT磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子滯留在細胞質(zhì)，失去了對與心肌中表達下游靶基因DOK5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，從而使DOK5表達上調(diào)，促進心肌細胞的分化和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，MCA組心肌特異蛋白GATA-4、CX43 mRNA及PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5表達均高于對照組，提示MCA誘導(dǎo)BMSCs后細胞內(nèi)心肌特異蛋白表達增高，MCA誘導(dǎo)BMSCs向心肌細胞分化成功，MCA可能通過激活PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白，從而發(fā)揮促進BMSCs向心肌細胞分化的作用；MCA+LY294002組心肌特異蛋白GATA-4、CX43 mRNA及PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5表達均低于MCA組，提示LY294002可能通過特異性抑制PI3K/AKT信號通路，抑制PI3K、p-AKT、p-Foxo3a、DOK5的表達，抑制了BMSCs向心肌細胞分化的過程，證實MCA誘導(dǎo)BMSCs向心肌細胞分化的作用可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

綜上所述，MCA可誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細胞，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

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