E2F1及EGR-1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

論著

E2F1及EGR-1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

丁家寶王亞軒李景東高栩王志勝郭紹衛(wèi)滕志海韓振偉常學(xué)良黎瑋

作者單位： 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科

E-mail:wangyaxuan87@126.com

【摘要】目的探討轉(zhuǎn)錄因子E2F1、早期生長反應(yīng)基因-1(EGR-1)在人腎透明細(xì)胞癌(RCCC)組織中的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測48例RCCC、28例癌旁腎組織中E2F1和EGR-1蛋白的表達(dá)情況。分析E2F1和EGR-1與患者臨床病理特征的關(guān)系。RT-PCR方法檢測34例RCCC、15例癌旁腎組織中E2F1和EGR-1的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果免疫組織化學(xué)方法顯示:E2F1在RCCC組織中陽性表達(dá)率為明顯高于癌旁腎組織(P<0.05)。EGR-1在RCCC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁腎組織(P<0.05)；E2F1與EGR-1蛋白在RCCC中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.533，P<0.01)，與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)，而與RCCC組織學(xué)分級及臨床分期有關(guān)(P<0.05)。RT-PCR方法顯示：E2F1在RCCC組織和癌旁腎組織中積分吸光度比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。EGR-1在RCCC組織和癌旁腎組織中積分吸光度比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論在RCCC組織中，高表達(dá)的E2F1和EGR-1可能與RCCC的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】E2F1;EGR-1;腎細(xì)胞癌;RT-PCR;免疫組化

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.001

通訊作者：王亞軒，050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科;

【中圖分類號】R 737.11

收稿日期：(2015-03-09)

The expression and significance of E2F1 and EGR-1 in renal clear cell carcinomaDINGJiabao,WANGYaxuan,LIJingdong,etal.DepartmentofUrology,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of E2F1 and EGR-1 in renal clear cell carcinoma (RCCC).MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression levels of E2F1 protein and EGR-1 protein in 48 cases of RCCC tissue and 28 cases of cancer adjacent tissues.The correlation between the expressions of E2F1, EGR-1and clinicopathological characteristics of RCCC was analyzed. RT-PCR was used to detect the expression levels of E2F1 and EGR-1mRNA in 34 cases of RCCC tissues and 15 cases of cancer adjacent tissues.ResultsImmunohistochemistry results showed that the positive expression rate of E2F1 in RCCC tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues (75% vs 32.1%, P<0.05). The positive expression rate of EGR-1 in RCCC tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues (79.2% vs 35.7%,P<0.05). The expression of E2F1 was positively correlated to that of EGR-1 protein in RCCC tissues (r=0.533,P<0.01),which was not related with patient’s sex and age (P>0.05),however,which was closely correlated to histological grade and clinical stage of RCCC (P<0.05). RT-PCR results showed that there was a significant difference in the integral absorbance ratio of E2F1 between RCCC tissues and cancer adjacent tissues (0.2628±0.0656 vs 0.1225±0.0237,P<0.05),moreover, there was a significant difference in the integral absorbance ratio of EGR-1 between RCCC tissues and cancer adjacent tissues (0.2788±0.0893 vs 0.1279±0.02660,P<0.05).ConclusionThe high expressions of E2F1 and EGR-1 in RCCC may be closely correlated to the pathogenesis, development,infiltration and metastasis of RCCC.

【Key words】 E2F1;EGR-1; renal cell carcinoma;RT-PCR; immunohistochemistry

腎細(xì)胞癌占成人惡性腫瘤的2%～3%，其中腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)是腎細(xì)胞癌中最常見的惡性腫瘤[1]。25%患者就診時已轉(zhuǎn)移，并且轉(zhuǎn)移性腎癌患者對放化療均不敏感，免疫治療和分子靶向治療[2]有效率也較低。本文旨在研究E2F1、早期生長反應(yīng)基因-1(EGR-1)在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，為RCCC的治療提供新靶點。

1資料與方法

1.1一般資料收集2013年4月至2014年8月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科手術(shù)患者的腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本48例(經(jīng)病理學(xué)證實)，其中男31例，女17例；年齡45～76歲。同時選取28例癌旁正常腎組織(為癌旁4 cm以外腎組織，經(jīng)病理學(xué)證實)。根據(jù)1997年Fuhrman分級進(jìn)行病理組織分級，高分化10例，中分化19例，低分化19例；根據(jù)國際2010年AJCC腎癌 TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期18例、Ⅲ期16例和Ⅳ期4例。手術(shù)前所有患者均未行放療、化療、細(xì)胞因子及靶向等治療。所有標(biāo)本分為兩份，一份經(jīng)10%的中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片；另一份置于-80℃冰箱中保存。

1.2實驗試劑及儀器鼠E2F1單克隆抗體購自于美國Santa Cruz Biotechnology公司，鼠EGR-1單克隆抗體購自于美國Santa Cruz Biotechnology公司，瓊脂糖購自于西班牙公司，PCR反應(yīng)體系、cDNA Synthesis Kit、RNAiso Plus、DL2000 DNA Marker均購自于Takara公司，ABC免疫組化試劑盒購自于Vector Laboratories公司。E2F1上游引物為：5'-CTACGTGACGTGTCAGGACC-3'；下游引物為：5'-GGTGGGGAAAGGCTGATGAA-3'；EGR-1上游引物為：5'-CCCGTTCGGATCCTTTCCTC-3'；下游引物為：5'-GCGGCCAGTATAGGTGATGG-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物為：5'-GACCACAGTCCATGCCATCA-3'；下游引物為： 5'-GAGATTCAGTGTGGTGGGGG-3 '。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)方法:將實驗標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后復(fù)染，脫水封片，以PBS液替代一抗作陰性對照。

1.3.2RT-PCR:應(yīng)用Trizol法在加入RNAiso Plus的溶液中提取組織總RNA，紫外分光光度計260、280 nm及320 nm處讀取OD值，然后測定RNA的純度及含量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依照大連Takara公司cDNA合成試劑盒說明書操作。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在美國PE基因擴增儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴增產(chǎn)物放于含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記，電泳后經(jīng)紫外透射儀觀察、數(shù)碼相機照相以及采用Quantity One凝膠圖象分析軟件對目的電泳條帶分析后，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，最后采用兩者積分吸光度比值表示結(jié)果。

1.3.3結(jié)果評定:免疫組化結(jié)果判定方法：染色強度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。高倍鏡下隨機觀察5個視野，應(yīng)用雙盲半定量法取陽性細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率，百分率≤9%為0分；10%～29%為1分；30%～49%為2分；50%～75%為3分；>75%為4分。總分取染色強度分?jǐn)?shù)與陽性細(xì)胞染色百分率分?jǐn)?shù)的乘積，總分:0～3分為陰性，4～7分為陽性，8～12分為強陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，比較腎透明細(xì)胞癌及癌旁正常腎組織中E2F1及EGR-1蛋白陽性表達(dá)率之間的差異，分析二者陽性表達(dá)率與臨床病理特征的關(guān)系，應(yīng)用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗；E2F1與EGR-1相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析；E2F1和EGR-1的積分吸光度比值以表示，采用t檢驗進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示E2F1蛋白表達(dá)主要分布于細(xì)胞核中，在RCCC組織中陽性表達(dá)率為75%(36/48)，明顯高于癌旁組32.1%(9/28)(P<0.05)。EGR-1蛋白表達(dá)主要分布于細(xì)胞核中，在RCCC組織中陽性表達(dá)率為79.2%(38/48)，明顯高于癌旁組35.7%(10/28)(P<0.05)。兩者在48例RCCC中的表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.533，P<0.01)。E2F1在48例RCCC組織中的表達(dá)，在Ⅲ～Ⅳ期中的表達(dá)高于在Ⅰ～Ⅱ期中的表達(dá)(r=0.390，P<0.01)，在低分化組中的表達(dá)高于在中、高分化組中的表達(dá)(r=0.369，P<0.05)。EGR-1在48例RCCC組織中的表達(dá)，在Ⅲ～Ⅳ期中的表達(dá)高于在Ⅰ～Ⅱ期中的表達(dá)(r=0.330，P<0.05)，在低分化組中的表達(dá)高于在中、高分化組中的表達(dá)(r=0.415，P<0.01)。在RCCC中E2F1、EGR-1的表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)。見表1～3,圖1～2。

表1　E2F1與EGR-1蛋白表達(dá)的關(guān)系　例

表2　RCCC患者E2F1蛋白與臨床病理特征的關(guān)系　例

表3　RCCC患者EGR-1蛋白與臨床病理特征的關(guān)系　例

2.2RT-PCR結(jié)果顯示E2F1在癌旁正常腎及RCCC組織中的mRNA相對表達(dá)量分別為(0.1225±0.0237)、(0.2628±0.0656)，腎癌組明顯高于癌旁組(P<0.05)；EGR-1在癌旁正常腎及RCCC組織中的

圖1　不同組織中E2F1的表達(dá)(SP×400)

圖2　不同組織中EGR-1的表達(dá)(SP×400)

mRNA相對表達(dá)量分別為(0.1279±0.0266)、(0.2788±0.0893)，腎癌組明顯高于癌旁組(P<0.05)。見圖3。

圖3RT-PCR腎癌及癌旁正常腎組織中的表達(dá)；1～7：腎癌組織，8～13：癌旁正常腎組織

3　討論

我國腎癌人群呈逐年上升趨勢，侵襲與轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，針對轉(zhuǎn)移性腎癌的術(shù)后輔助治療，不能明顯提高患者生存率[3]。因此，我們希望探索腎癌的發(fā)病機制，進(jìn)一步尋找腎癌治療的新途徑。

轉(zhuǎn)錄因子E2F1屬于細(xì)胞周期調(diào)控因子E2F家族中重要成員之一，與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb蛋白)以異二聚體形式結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物。在慢性炎癥或病毒感染等外界刺激下，cyclin-cdk-Rb通道被激活，釋放出游離的E2F1，被釋放的E2F1通過調(diào)控細(xì)胞周期G1→S期的轉(zhuǎn)變來控制細(xì)胞的增殖[4]，而G1→S期的轉(zhuǎn)變失調(diào)，是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為腫瘤細(xì)胞的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高表達(dá)的E2F1能夠促使細(xì)胞過度增殖并向惡性轉(zhuǎn)化，如在結(jié)腸癌中E2F1表達(dá)明顯增高，且與腫瘤分級分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[5]。另外，有研究表明，腎細(xì)胞癌中E2F1在蛋白及基因水平表達(dá)均明顯上調(diào)，應(yīng)用回歸分析顯示E2F1可作為腎癌的預(yù)后指標(biāo)，E2F1表達(dá)水平越高，腎癌患者預(yù)后越差[6]。

EGR-1不僅在細(xì)胞生長及分化中具有重要作用[7]，而且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演重要角色。EGR-1在許多腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并且可能作為預(yù)后指標(biāo)，通過測定EGR-1表達(dá)可能有助于評估胃癌患者的預(yù)后情況[8]。Tian等[9]發(fā)現(xiàn)，以EGR-1為接入點，在鼻咽癌細(xì)胞系中敲低EGR-1表達(dá)水平，肝細(xì)胞生長因子(HGF)表達(dá)減少，同時單克隆抗體(SAIT301)標(biāo)記甲硫氨酸的活性降低，聯(lián)合EGR-1和SAIT301可能成為治療鼻咽癌的一種新工具。但EGR-1在腎癌中的表達(dá)尚無有關(guān)報道。

本實驗結(jié)果顯示，E2F1、EGR-1蛋白及mRNA水平在腎癌組織表達(dá)均明顯高于在癌旁正常腎組織中的表達(dá)。E2F1、EGR-1表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)，與臨床分期及病理分級密切相關(guān)，且二者存在正相關(guān)關(guān)系。提示二者在RCCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中具有重要地位。有研究表明，E2F1、EGR-1在前列腺癌組織中呈高表達(dá)，且存在正相關(guān)關(guān)系，考慮高表達(dá)的E2F1可能通過NF-κB信號通路促進(jìn)EGR-1的表達(dá)，繼而影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[10]。E2F1、EGR-1在前列腺癌及RCCC中的表達(dá)情況相似，因此我們推測，在靜止細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白通過N端高度保守的結(jié)構(gòu)域與人核因子kB抑制蛋白(IkB)相結(jié)合形成NF-KB:IκB復(fù)合物，使NF-κB的核定位信號(NLS)被掩蓋，停留在胞漿內(nèi)處于非激活狀態(tài)[11]。在RCCC組織中，如果內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)改變，通過NF-κB經(jīng)典與非經(jīng)典信號通路，IkB被降解，NF-κB被釋放進(jìn)入核內(nèi)，高表達(dá)的E2F1與NF-κB蛋白相結(jié)合，增強NF-kB對EGR-1轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)能力，高表達(dá)的E2F1及EGR-1影響RCCC的發(fā)生及發(fā)展。通過對E2F1、EGR-1研究的不斷深入，希望能為今后RCCC的治療，提供新的介入點。

綜上所述并推測，E2F1、EGR-1在RCCC組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁正常腎組織，并且二者存在正相關(guān)關(guān)系，推測二者在RCCC的發(fā)生、發(fā)展中起到相互協(xié)同的作用；聯(lián)系并針對二者對RCCC的生物學(xué)效應(yīng)，希望能為RCCC臨床治療提供新靶點；在臨床病理活檢中檢測二者基因蛋白的表達(dá)，可能對RCCC患者預(yù)后的評估有一定意義。但是由于本實驗的樣本數(shù)較少，有待更多相關(guān)研究去驗證。

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