阿魏酸鈉通過(guò)MEK/ERK/P90RSK信號(hào)通路減輕MCAO大鼠缺血后腦損傷效果分析

阿魏酸鈉通過(guò)MEK/ERK/P90RSK信號(hào)通路減輕MCAO大鼠缺血后腦損傷效果分析

劉俊杰李建民趙雅寧徐繼偉

(華北理工大學(xué)河北唐山063000)

[摘要]①目的觀察阿魏酸鈉(SF)對(duì)腦缺血的防治作用，分析其可能的保護(hù)機(jī)制。②方法采用線栓法阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈的方法制造大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)動(dòng)物模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO組、SF+假手術(shù)、SF+MCAO組，于造模前1h經(jīng)尾靜脈給予SF 100mg/kg和等劑量的生理鹽水，24h后斷頭取腦，原位缺口末端標(biāo)記法(TUNLE)檢測(cè)凋亡神經(jīng)細(xì)胞。Western bolt檢測(cè)Raf-MEK-ERK通路及其下游的P90RSK、Bad蛋白磷酸化水平。③結(jié)果與模型組相比，SF干預(yù)組梗死灶的面積明顯減小(P<0.05)，且凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，MCAO組磷酸化的Raf-1、MEK1/2、ERK1/2、P90RSK、Bad較假手術(shù)組明顯減少(P<0.05)，SF干預(yù)組磷酸化的Raf-1、MEK1/2、ERK1/2P90RSK、Bad較MCAO組均顯著增加(P<0.05)。④結(jié)論SF可能通過(guò)MEK-ERK-P90RSK-Bad信號(hào)通路抑制MCAO后的神經(jīng)元凋亡。

[關(guān)鍵詞]腦缺血阿魏酸鈉MAPKERK

[中圖分類號(hào)]R 74[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

【基金項(xiàng)目】河北省科技支撐課題(編號(hào)：20276112D)；河北省教育廳自然

【作者簡(jiǎn)介】劉俊杰(1990-)，男，在讀碩士研究生，醫(yī)師。研究方向：腦損傷與腦保護(hù)研究。

【通訊作者】李建民。

Ferulic acid attenuates down-regulation of MEK/ERK/P90RSK signaling pathway in focal cerebral ischemic injuryLIUJunjie,LIJianmin,ZHAOYaning,etal(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ABSTRACT[]ObjectiveFerulic acid provides neuroprotective effects against a middle cerebral artery occlusion (MCAO)-induced cerebral ischemia.Mitogen-activated protein kinases can regulate extensive intracellular processes including cell differentiation,growth,and death.This study further investigated whether ferulic acid modulates a protective mechanism through the activation of Raf-MEK-ERK and its downstream targets,including 90 ribosomal S6 kinase (p90RSK) and Bad during cerebral ischemic injury.MethodsMale Sprague-Dawley rats were treated with ferulic acid (100 mg/kg) or vehicle befor the onset of MCAO and brain tissues were collected 24 h after MCAO.ResultsThese results indicated that ferulic acid decreases the volume of the infarct area and the number of cells positive in terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining. Although MCAO injury induces a decrease in the phosphorylation of Raf-1,MEK1/2,and ERK1/2,ferulic acid treatment prevents the injury-induced decrease in these phosphorylation levels.Ferulic acid also attenuates the injury-induced decrease in p90RSK and Bad phosphorylation levels.ConclusionThese findings suggest that ferulic acid prevents MCAO-induced neuronal cell death and that the MEK-ERK-p90RSK-Bad signaling pathway is involved in these neuroprotective effects.

[KEYWORDS]Brain ischemia.Ferulic acid.MAPK.ERK

腦缺血加之氧化應(yīng)激和能量代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腦功能受損[1]。多酚類，如阿魏酸鈉(sodium ferulate,SF)，又名當(dāng)歸素，主要存在于植物中，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中起著重要的作用[2]。研究已經(jīng)證實(shí)，SF還可以對(duì)阿爾茲海默病、腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病起到保護(hù)作用，其可通過(guò)抗氧化作用及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而減輕腦缺血后的損傷[3]。筆者前期研究報(bào)道SF可通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)屬于絲/蘇蛋白激酶家族，P44/P42 MAPK(ERK1/2)信號(hào)通路是溝通細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的重要通路，比如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞分裂素信號(hào)的傳遞[4]。已有研究報(bào)道SF和ERK信號(hào)通路存在一定關(guān)系，SF可通過(guò)激活A(yù)kt和ERK信號(hào)通路來(lái)阻止由于輻射導(dǎo)致的氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞凋亡。此外，ERK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)SF的抗氧化作用[5,6]。雖然研究已經(jīng)明確SF有神經(jīng)保護(hù)作用，但其在大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)的具體保護(hù)機(jī)制尚不明確。本研究旨在探明SF是否可以通過(guò)激活Raf-MEK-ERK及其下游的靶蛋白P90RSK和Bad來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1材料雄性SD大鼠，220～230g，40只，購(gòu)置于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(京)2009-003)，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度控制在25℃,明暗交替循環(huán)，自由進(jìn)食水。40只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、SF+Sham組、MCAO組、SF+MCAO組。手術(shù)前1h尾靜脈給SF，給藥劑量為100mg/kg，對(duì)照組給予等劑量的生理鹽水。

1.2藥品及試劑注射用SF(0.1g)(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)，批號(hào)：201451678)；p-Raf、p-MEK、p-ERK、p-p90RSK、p-Bad，一抗，美國(guó)SCt公司；二抗，TUNEL染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。TTC染色劑，sigma公司。

1.3動(dòng)物模型制造參考Longa[7]的方法，制造MCAO模型，10mg/kg水合氯醛常規(guī)麻醉，頸部正中做切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。4/0號(hào)縫合線從頸內(nèi)動(dòng)脈插入，栓塞大腦中動(dòng)脈。24h后4%多聚甲醛灌注取腦。Sham進(jìn)行同樣的操作，不進(jìn)行大腦中動(dòng)脈栓塞。

1.4形態(tài)學(xué)檢測(cè)腦組織視交叉水平冠狀位切成2mm厚，2%的2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)， 37℃孵育20min，染色，測(cè)量其梗死面積。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL法) 標(biāo)本多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟切片,按TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作,DAB顯色,蘇木精復(fù)染。陽(yáng)性率的定量分析:每個(gè)標(biāo)本取4張切片,每張切片在梗死區(qū)隨機(jī)選取4個(gè)視野,在200倍光鏡下應(yīng)用目鏡網(wǎng)格測(cè)試系統(tǒng),計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,取均值。

1.5免疫印跡法測(cè)定磷酸化Raf、MEK、ERK、P90RSK和Bad大鼠處死后，迅速斷頭取腦，取大腦右側(cè)梗死區(qū)域皮層組織0.6g，4℃磷酸鹽溶液(PBS)充分洗滌，加入3倍體積的4℃全細(xì)胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心5min，3000r/min，取上清?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)各樣本的蛋白含量(南京建成生物有限公司)，樣本貯存于-80℃?zhèn)溆?。蛋白樣?0μg與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10min，10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉液室溫下震蕩2～3h，加入一抗(p-Raf、p-MEK、p-ERK1/2、p-p90RSK、P-Bad,濃度均為1:1000;β-actin,1:1000)，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜，標(biāo)記的二抗(1:5000)，37℃孵育1h，PBS洗膜，ECL顯色，圖象分析儀(Amersham Pharmacia Biotech)測(cè)定光密度。

2結(jié)果

2.1大體形態(tài)結(jié)果MCAO組出現(xiàn)明顯的梗死灶，梗死體積(33.51±3.76)，SF+MCAO組梗死灶體積明顯縮小，(15.98±3.21)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A：Sham組；B:SF+Sham組；C： MCAO組；D:SF+MCAO組 圖1 各組大鼠腦組織梗死面積

注：A：Sham組；B:SF+Sham組；C： MCAO組；D:SF+MCAO組 圖2　各組大鼠損傷區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞(TUNEL，×400)

2.2各組大鼠梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)表現(xiàn)為核固縮，棕黃色，可見(jiàn)凋亡小體，核碎片。與Sham組相比，MCAO組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多(P<0.05)；與MCAO組相比，SF+MCAO組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2，圖3。

表1　各組大鼠缺血病灶區(qū)相關(guān)蛋白的表達(dá)量比較

注：與Sham組相比，*P<0.05；與MCAO組相比，**P<0.05

圖3　各組大鼠損傷區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞比較(*P<0.05)

2.3Western blot結(jié)果MCAO模型組P-Raf和P-MEK蛋白含量較Sham組明顯降低(P<0.05),SF干預(yù)組P-Raf和P-MEK蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；模型組P-ERK1/2水平較Sham組下降(P<0.05)，SF干預(yù)組較模型組上調(diào)(P<0.05)，模型組P-p90RSK和P-Bad蛋白水平較Sham組明顯下降(P<0.05)，SF干預(yù)組較模型組上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖4。

圖4　各種大鼠損傷區(qū)相關(guān)蛋白Western blot結(jié)果

3討論

已有研究報(bào)道，SF可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8,9]。本研究結(jié)果顯示，SF可明顯減小梗死面積，減少M(fèi)CAO后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與其他研究結(jié)果一致[10,11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)， SF干預(yù)后Raf和MEK、ERK磷酸化水平較MCAO模型組有顯著上升。提示SF對(duì)Raf/MEK/ERK信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用，可以使該信號(hào)通路激活。MAPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的關(guān)鍵酶，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞分裂素可激活Raf ，Raf是MAP上游重要的蛋白，通過(guò)Raf的磷酸化激活MEK1/2，磷酸化的MEK1/2激活下游的ERK1/2[12,13]。許清秀[14]研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號(hào)通路激活可以減少錐體細(xì)胞的損傷，從而起到腦保護(hù)作用。筆者推測(cè)Raf/MEK/ERK信號(hào)通路是SF參與腦保護(hù)作用的一條重要的通路。SF可能通過(guò)MEK/ERK/P90RSK信號(hào)級(jí)聯(lián)放大作用于某些下游分子來(lái)發(fā)揮MCAO損傷后神經(jīng)保護(hù)功能。

為了進(jìn)一步探討SF對(duì)MCAO的腦保護(hù)機(jī)制，筆者又檢測(cè)了MAPK下游相關(guān)蛋白P90RSK和Bad，P90RSK可以被磷酸化的ERK激活，Bad又可被激活的P90RSK激活，而p-Bad可以抑制細(xì)胞的凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示， SF干預(yù)后可明顯提高P90RSK和Bad磷酸化水平，提示SF可能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路活化P90RSK、Bad。Wong等[16]研究發(fā)現(xiàn)活化的ERK1/2調(diào)節(jié)下游的P90RSk、轉(zhuǎn)錄因子Elk-1等，磷酸化的P90RSk進(jìn)一步導(dǎo)致下游的Bad磷酸化，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡被抑制。Bad是Bcl-2家族成員，p-Bad是抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的異二聚體，主要參與對(duì)抗細(xì)胞的凋亡[17]。前期研究發(fā)現(xiàn)，SF可以上調(diào)MCAO損傷后p-Akt及其下游靶蛋白p-Bad,p-GSK-3β的水平，通過(guò)調(diào)節(jié)Akt通路，來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果， SF可能通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路,從而提高P90RSK和Bad信號(hào)蛋白磷酸化水平，減少腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮MCAO后的腦保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Allen C L, Bayraktutan U. Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke[J]. Int J Stroke, 2009, 4(6): 461-70

[2]劉春杰.阿魏酸鈉抗炎分子機(jī)制及對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎療效初步觀察[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué), 2013

[3]周紅偉, 章軍建, 熊麗. 慢性腦缺血大鼠海馬PARP、MDA的表達(dá)及阿魏酸鈉的抗氧化作用[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志, 2005, (03): 213-215

[4]Ulu N, Henning R H, Guner S, et al. Intracellular transactivation of epidermal growth factor receptor by alpha1A-adrenoceptor is mediated by phosphatidylinositol 3-kinase independently of activation of extracellular signal regulated kinases 1/2 and serine-threonine kinases in Chinese hamster ovary cells[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2013, 347(1): 47-56

[5]Ma Z C, Hong Q, Wang Y G, et al. Ferulic acid induces heme oxygenase-1 via activation of ERK and Nrf2[J]. Drug Discov Ther, 2011, 5(6): 299-305

[6]Jin Y, Yan E Z, Fan Y, et al. Neuroprotection by sodium ferulate against glutamate-induced apoptosis is mediated by ERK and PI3 kinase pathways[J]. Acta Pharmacol Sin, 2007, 28(12): 1881-90

[7]E.Z. Longa, P.R. Weinstein, S. Carlson,et al.Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in rat[J]. Stroke,1989, 20: 84-91

[8]Cheng C Y, Su S Y, Tang N Y, et al. Ferulic acid inhibits nitric oxide-induced apoptosis by enhancing GABA(B1) receptor expression in transient focal cerebral ischemia in rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 2010, 31(8): 889-99

[9]Cheng C Y, Su S Y, Tang N Y, et al. Ferulic acid provides neuroprotection against oxidative stress-related apoptosis after cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting ICAM-1 mRNA expression in rats[J]. Brain Res, 2008, 1209: 136-50

[10]周禮俊, 楊拯, 邱有波, 等. 阿魏酸鈉治療腦梗死的匯總分析[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2012, (19): 4130-4133

[11]朱海勇, 徐海燕, 劉素芝, 等. 阿魏酸鈉聯(lián)合阿斯匹林治療急性腦梗死臨床觀察[J]. 實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床, 2006, (05): 7-8P

[12]Hwang J H, Byun M R, Kim A R, et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation[J]. PLoS One, 2015, 10(8): e0135519

[13]Ghasemi R, Moosavi M, Zarifkar A, et al. The Interplay of Akt and ERK in Abeta Toxicity and Insulin-Mediated Protection in Primary Hippocampal Cell Culture[J]. J Mol Neurosci, 2015[Epub]

[14]許清秀.ERK通路與丙泊酚后處理大鼠的腦保護(hù)作用[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué),2014

[15]Lee Y S, Jun H S. Anti-diabetic actions of glucagon-like peptide-1 on pancreatic beta-cells[J]. Metabolism, 2014, 63(1): 9-19

[16]Wong W R, Chen Y Y, Yang S M, et al. Phosphorylation of PI3K/Akt and MAPK/ERK in an early entry step of enterovirus 71[J]. Life Sci, 2005, 78(1): 82-90

[17]Jeong J W, Lee W S, Go S I, et al. Pachymic Acid Induces Apoptosis of EJ Bladder Cancer Cells by DR5 Up-Regulation, ROS Generation, Modulation of Bcl-2 and IAP Family Members[J]. Phytother Res, 2015,7(8):72-76

(王一伊編輯)

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