miRNA-181a/b通過(guò)血清反應(yīng)因子調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型 *

*國(guó)家自然科學(xué)基金(31260015)

miRNA-181a/b通過(guò)血清反應(yīng)因子調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型*

侯雪1，魏曉星1*，張振明2，藺梟2，吳瓊2

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部青海 西寧 810001；2.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100084)

摘要目的研究miR-181a/b通過(guò)血清反應(yīng)因子(SRF，serum response factor )對(duì)血管平滑肌細(xì)胞向合成型表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞增殖遷移能力的調(diào)控作用。方法將miR-181a/b 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HAoSMCs)中，用實(shí)時(shí)定量PCR、CCK-8檢測(cè)方法和transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)平滑肌細(xì)胞的表型標(biāo)記基因的表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力和遷移能力的變化。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-181a/b直接靶向血清反應(yīng)因子的3’UTR(非編碼區(qū))，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、western blot及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分別驗(yàn)證。結(jié)果實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表示在HAoSMCs中過(guò)表達(dá)miR-181a/b能夠抑制收縮表型標(biāo)記基因的表達(dá)，促進(jìn)合成表型標(biāo)記基因的表達(dá)，CCK-8與transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-181a/b可增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和遷移能力。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)與western blot結(jié)果表明，miR-181a/b能夠直接作用SRF，抑制SRF的蛋白表達(dá)。結(jié)論miR-181a/b通過(guò)直接作用血清反應(yīng)因子的3’UTR促進(jìn)平滑肌細(xì)胞由收縮型表型向合成型表型轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞miRNA-181a/b血清反應(yīng)因子血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

通訊作者侯雪(1991~)，女，漢族，山東籍，2012級(jí)在讀碩士研究生. *：，研究生導(dǎo)師，Email：flemingo@126.com

中圖分類號(hào)R34

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.005

AbstractObjectiveTo investigate the roles of miR-181a/b in the smooth muscle cells(SMC)phenotypic switch from contractile phenotype to synthetic phenotype through serum response factor(SRF).Methods miR-181a/b mimics or inhibitors were transiently transfected into Human Aortic Smooth Muscle Cells(HAoSMCs)，the expression of SMC phenotype marker gene were detected by quantitative real time PCR(qRT-PCR)，the proliferation and migration ability of HAoSMCs were measured by CCK-8 assay and transwell assay，respectively.In addition，miR-181a/b was indicated as directly targeting at 3’UTR of SRF based on bioinformatic analysis and identified by qRT-PCR，western blot assay and dual-luciferase assay.Results The results of qRT-PCR showed that miR-181a/b could down-regulate the expression level of SMC contractile marker genes and up-regulate the expression level of SMC synthetic marker genes.The results of CCK-8 assay and transwell assay showed that miR-181a/b could enhance the proliferation and migration ability of HAoSMCs，respectively.The results of Dual-luciferase assay and western blot assay showed that miR-181a/b could directly target 3’UTR of SRF and inhibit the protein expression level of SRF.Conclusion miR-181a/b regulates the shift of SMCs from contractile phenotype to synthetic phenotype through targeting at 3’UTR of SRF.

KeywordsmiRNA-181a/bSerum response factorVessel smooth muscle cellsPhenotype modulation

收稿日期2015-03-03

miRNA-181a/b REGULATES PHENOTYPES OF VESSEL SMOOTH

MUSCLE CELLS THROUGH SERUM RESPONSE FACTOR*

Hou Xue1，Wei Xiaoxing1*，Zhang Zhenming2，Lin Xiao2，Wu Qiong2

(1.Department of Basic Medical sciences，Qinghai University Medical College，Xining 810016，China；

2.School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084，China)

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SRF是miR-181a/b可能的靶基因，因此我們假定miR-181a/b可能能通過(guò)靶向SRF調(diào)控平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化(圖 1A)。本研究結(jié)果表明，miR-181a/b使平滑肌細(xì)胞收縮表型標(biāo)記基因表達(dá)下調(diào)，使平滑肌細(xì)胞合成型表型標(biāo)記基因表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究表明，miR-181a/b可以直接靶向SRF的3’UTR并且調(diào)控SRF的mRNA和蛋白表達(dá)水平。綜上所述，我們首次證明了miR-181a/b可通過(guò)直接靶向SRF進(jìn)而調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型。

1材料與方法

1.1　細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HAoSMCs)使用VascuLife SMC medium(Lifeline Cell Technology，美國(guó))在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)。

PDGF誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為10 ng/mL的PDGF，在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。

miR-181a/b類似物(mimics)/抑制劑(inhibitor)或陰性對(duì)照(吉瑪，上海，中國(guó))通過(guò)使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，美國(guó))瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HAoSMCs中。pGL3-SRF或pGL3質(zhì)粒使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen，美國(guó))瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HAoSMCs中。

1.2　RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

HAoSMCs的總RNA使用miRcute miRNA分離提取試劑盒(天根，北京，中國(guó))根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明進(jìn)行提取。mRNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用FastQuant反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根)進(jìn)行，miRNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(天根)進(jìn)行。miR-181a/b表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)以U6作內(nèi)參，使用miRcute miRNA qPCR 檢測(cè)試劑盒(天根)進(jìn)行，平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)記基因表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)以GAPDH作內(nèi)參，使用SuperReal PreMix(SYBR Green)檢測(cè)試劑盒(天根)。

1.3　蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

HAoSMCs的蛋白質(zhì)樣品制備使用RIPA裂解液(華興博創(chuàng)，北京，中國(guó))裂解，并加入蛋白酶抑制劑(華興博創(chuàng))。將蛋白質(zhì)樣品在12%的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，獲得的分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PDVF膜(Millipore，紐約，美國(guó))上，并在5%的脫脂牛奶中封閉1 h。一抗使用 SRF兔單克隆抗體(CST，波士頓，美國(guó))，4 ℃過(guò)夜孵育，二抗使用HRP-羊抗兔第二抗體(Sigma-Aldrich，密蘇里州，USA)室溫孵育2 h，最后使用化學(xué)發(fā)光劑ECL觀察。

1.4　雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)

將SRF的3’UTR克隆到pGL3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(SRF-pGL3)(青蘭，蘇州，中國(guó))中。將pGL3報(bào)告質(zhì)粒與miR-181a/b mimics共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后使用Dual-Luciferase報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)(Promega BioSciences，美國(guó))檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5　細(xì)胞增殖及遷移檢測(cè)

1.5.1CCK-8實(shí)驗(yàn)

HAoSMCs以每孔約2000個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中，分別轉(zhuǎn)染miR-181a/b mimics、miR-181a/b inhibitor和陰性對(duì)照物至細(xì)胞中，72 h后使用CCK-8試劑盒(碧云天，江蘇，中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。每孔培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8溶液，用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)孵育1 h后，多功能讀數(shù)儀檢測(cè)450 nm處吸光值。

1.5.2Transwell實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖能力在含有8 μm孔徑的聚碳酸酯膜的24孔transwell細(xì)胞培養(yǎng)體系(Corning，紐約，美國(guó))中進(jìn)行。分別轉(zhuǎn)染miR-181a/b mimics、miR-181a/b inhibitor及陰性對(duì)照物至HAoSMCs中36~48 h后，將約15，000個(gè)細(xì)胞接種至transwell內(nèi)室中，外室加入含20% FBS的培養(yǎng)基，37 ℃誘導(dǎo)12 h。遷移至transwell內(nèi)室膜外側(cè)的細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后在倒置顯微鏡下觀察。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用t檢驗(yàn)的方法。P<0.05、P<0.01分別代表顯著性差異及極顯著性差異。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果

2.1　miR-181a/b在增殖的HAoSMCs中表達(dá)上調(diào)(圖1)

(A)miR-181a/b通過(guò)血清反應(yīng)因子調(diào)控血管平滑肌表型示意圖；(B)與對(duì)照細(xì)胞相比，倒置顯微鏡下(200×)觀察的PDGF誘導(dǎo)的HAoSMCs增殖能力增強(qiáng)；(C)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示在PDGF誘導(dǎo)的HAoSMCs中，miR-143/145、miR-21(收縮型平滑肌細(xì)胞的生物標(biāo)記)的表達(dá)水平明顯降低，miR-181a和miR-181b的表達(dá)水平明顯升高.*：P<0.05，**：P<0.01.n=6，U6作為內(nèi)參

圖1miR-181a/b在PDGF誘導(dǎo)的HAoSMCs中表達(dá)上調(diào)圖

Figure 1miR-181a/b expression level increased in PDGF-treated HAoSMCs

PDGF(Platelet-derived growth factor，血小板源生長(zhǎng)因子)是一種抑制平滑肌收縮表型標(biāo)記基因表達(dá)，促使平滑肌細(xì)胞向合成型轉(zhuǎn)化并促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的一種生長(zhǎng)因子。體外培養(yǎng)的HAoSMCs使用PDGF誘導(dǎo)24 h后使用倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)HAoSMCs的增殖能力明顯增強(qiáng)(圖1B)。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-181a和miR-181b的表達(dá)水平明顯升高(圖 1C)，miR-143、miR-145和miR-21的表達(dá)水平明顯降低(圖1C)。其中miR-143/145簇對(duì)于維持平滑肌細(xì)胞收縮表型有著重要意義[1，2]。MiR-21在平滑肌細(xì)胞收縮表型標(biāo)記基因的表達(dá)中起著關(guān)鍵作用[3，4]。

2.2　miR-181a/b調(diào)控HAoSMCs表型標(biāo)記基因的表達(dá)(圖2)

平滑肌細(xì)胞由收縮型表型向合成型表型轉(zhuǎn)化會(huì)改變細(xì)胞的增殖遷移能力以及平滑肌表型標(biāo)記基因的表達(dá)[5]。一些在平滑肌細(xì)胞特定表達(dá)的基因作為收縮表型的標(biāo)記基因包括SM22α(smooth muscle 22 alpha)[6]、SM-MHC(smooth muscle myosin heavy chain，平滑肌肌球蛋白重鏈)[7]、α-SMA(α-smooth muscle actin，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，ACTA2)[8]、calponin(鈣調(diào)蛋白)[9]、smoothelin[10]。與之相對(duì)應(yīng)的CRBP-1(cellular retinol binding protein，細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白)[11]、moesin(膜突蛋白)[12]、smemb(smooth muscle embryonic myosin heavy chain，平滑肌胚胎型肌球蛋白重鏈)[13]、OPN(osteopontin，骨橋蛋白)[14]、MGP(matrix Gla protein，細(xì)胞基質(zhì)Gla蛋白)[15]是平滑肌細(xì)胞合成型標(biāo)記基因。

為了揭示miR-181a/b對(duì)平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)記基因表達(dá)的調(diào)控作用，將miR-181a/b或抑制劑分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HAoSMCs內(nèi)。72 h后檢測(cè)平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)記基因的表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)miR-181a/b的HAoSMCs中收縮表型基因表達(dá)水平下調(diào)(圖 2A)，合成表型標(biāo)記基因表達(dá)水平上調(diào)(圖2B)。與之相反的是在HAoSMCs中抑制miR-181a/b的表達(dá)水平使細(xì)胞中的平滑肌收縮表型標(biāo)記基因表達(dá)上調(diào)(圖2C)，合成型標(biāo)記基因表達(dá)水平下調(diào)(圖2D)。

SRF是一種平滑肌收縮基因表達(dá)的重要調(diào)控因子[16]。在HAoSMCs中利用siSRF沉默SRF的表達(dá)(圖2E-F)，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，平滑肌收縮表型基因表達(dá)水平降低(圖 2G)，而合成型基因表達(dá)水平升高(圖 2H)。

181a/b在HAoSMCs中過(guò)表達(dá)使收縮型標(biāo)記基因(SM-MHC，α-SMA，SM22α，smoothelin，calponin)表達(dá)下調(diào)(A)，合成型標(biāo)記基因(moesin，MGP，CRBP-1，smemb，OPN)表達(dá)上調(diào)(B).抑制miR-181a/b的表達(dá)會(huì)促進(jìn)收縮型標(biāo)記基因的表達(dá)(C)，抑制合成型標(biāo)記基因的表達(dá)(D).使用siSRF敲除HAoSMCs的SRF后，SRF的mRNA(E)和蛋白表達(dá)(F)水平都明顯下調(diào)，收縮型標(biāo)記基因表達(dá)降低(G)，合成型標(biāo)記基因表達(dá)升高(H).*：P<0.05，**：P<0.01，n=6，GAPDH 作為內(nèi)參

圖2miR-181a/b 調(diào)控HAoSMCs表型標(biāo)記基因的表達(dá)圖

Figure 2miR-181a/b regulates expressions of HAoSMCs phenotype marker genes

2.3　miR-181a/b促進(jìn)HAoSMCs的增殖及遷移能力(圖3)

CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明miR-181a/b促進(jìn)HAoSMCs的增殖(A)，miR-181a/b抑制劑(inhibitor)抑制HAoSMCs 的增殖(B).*：P<0.05，**：P<0.01，n=6.(C)使用transwell檢測(cè)法檢測(cè)HAoSMCs的遷移能力變化，倒置顯微鏡下觀察(200×)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-181a/b細(xì)胞組遷移能力明顯增強(qiáng)，而抑制miR-181a/b細(xì)胞組細(xì)胞遷移能力明顯降低

圖3miR-181a/b對(duì)HAoSMCs的增殖及遷移能力的作用圖

Figure 3Effect of miR-181a/b on proliferation and migration of HAoSMCs

為了確定miR-181a/b是否對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移能力有調(diào)控作用，miR-181a/b mimics或inhibitors分別被轉(zhuǎn)染至HAoSMCs內(nèi)72 h。HAoSMCs的增殖能力的檢測(cè)使用CCK-8試劑盒進(jìn)行，細(xì)胞遷移能力檢測(cè)利用transwell系統(tǒng)進(jìn)行。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-181a/b 能夠促進(jìn)HAoSMCs的增殖能力(圖 3A)，miR-181a/b inhibitor能夠抑制HAoSMCs的增殖能力(圖 3B)。transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-181a/b明顯地促進(jìn)HAoSMCs的遷移能力，而miR-181a/b inhibitor能夠減弱HAoSMCs的遷移能力(圖 3C)。

2.4　miR-181a/b直接靶向HAoSMCs 中的SRF的3’UTR(圖4)

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果表明miR-181a/b能夠直接降低SRF的熒光活性(A，B).過(guò)表達(dá)miR-181a/b的細(xì)胞中SRF的mRNA表達(dá)水平(C)抑制miR-181a/b的細(xì)胞中的SRF表達(dá)水平(D).miR-181a/b抑制HAoSMCs中的SRF的蛋白表達(dá)水平(E)，而抑制miR-181a/b的表達(dá)促進(jìn)SRF的蛋白表達(dá)(F).*：P<0.05

圖4miR-181a/b直接靶向SRF并降低SRF的表達(dá)圖

Figure 4miR-181a/b directly binds to SRF and down-regulates the SRF level

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)被用來(lái)確定miR-181a/b是否直接靶向HAoSMCs中的SRF的3’UTR。miR-181a或miR-181b與SRF-pGL3共轉(zhuǎn)染至HAoSMCs中，24 h后檢測(cè)熒光素酶的熒光活性。結(jié)果顯示miR-181a/b能夠直接抑制SRF-pGL3質(zhì)粒的熒光活性(圖 4A-B)，表明miR-181a/b能夠直接靶向HAoSMCs中的SRF的3’UTR。

為進(jìn)一步確定miR-181a/b對(duì)SRF的表達(dá)的調(diào)控作用，將miR-181a/b類似物或抑制劑分別轉(zhuǎn)染入HAoSMCs內(nèi)，72 h后分別利用實(shí)時(shí)定量PCR和western blot檢測(cè)SRF的基因及蛋白的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)miR-181a/b的HAoSMCs中SRF的表達(dá)水平下調(diào)，而在抑制miR-181a/b的HAoSMCs中SRF的表達(dá)水平上調(diào)(圖4C-D)。western blot結(jié)果顯示，SRF的蛋白表達(dá)水平能夠被miR-181a/b抑制(圖 4E)，被miR-181a/b inhibitor促進(jìn)(圖 4F)。

3討論

血管平滑肌細(xì)胞的表型異常轉(zhuǎn)變引發(fā)的過(guò)度增殖和遷移是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、術(shù)后再狹窄等血管疾病的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[17-19]。影響平滑肌表型轉(zhuǎn)化的因素多種多樣，包括細(xì)胞外基質(zhì)、血管受損、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子[20-22]。

SRF在平滑肌細(xì)胞的分化過(guò)程中可結(jié)合至平滑肌細(xì)胞基因啟動(dòng)子區(qū)的CArG區(qū)從而激活基因的轉(zhuǎn)錄[23-24]。SRF在血管中的作用可被共因子myocardin和ELK1調(diào)控。多種miRNAs(miR-21[25]、miR-143[26]和miR-145[27]等)參與調(diào)控平滑肌細(xì)胞的分化及去分化過(guò)程。

MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物及病毒中的長(zhǎng)約18~22個(gè)核苷酸序列的非編碼RNA，通過(guò)靶向基因的3’非編碼區(qū)(3’UTR)調(diào)控基因表達(dá)[28，29]。miRNAs在胚胎發(fā)育[30]、細(xì)胞分化[31]、增殖[32]、凋亡[33]、造血[34]及癌癥治療[35-36]等方面有調(diào)控作用。另外miRNAs可以調(diào)控一些血管相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞行為，如血小板聚集、平滑肌增殖等[37]。miRNA作為一類重要的調(diào)控因子，在不同的病理生理狀態(tài)下表達(dá)情況會(huì)發(fā)生改變，可對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。所以，可以利用這一特性研究miRNA在血管疾病的靶基因及作用機(jī)制。

越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明，miR-181家族參與調(diào)控血管的生理和病理過(guò)程。miR-181家族有四個(gè)成員：miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d，它們分別有不同的靶基因調(diào)控不同的通路[38]。miR-181a和miR-181b是miR-181家族中研究較為清楚且在基因上成簇存在。miR-181家族廣泛參與調(diào)控急性骨髓白血病致癌過(guò)程[39]、免疫系統(tǒng)代謝調(diào)控[40]、血管炎癥反應(yīng)[38]、淋巴細(xì)胞發(fā)育及穩(wěn)態(tài)[41]。其中miR-181a通過(guò)靶向NOX4調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖，通過(guò)調(diào)控骨橋蛋白(osteopontin，OPN)表達(dá)參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的形成[42，43]。miR-181b通過(guò)靶向NF-κB信號(hào)通路中的importin-α3調(diào)節(jié)血管炎癥[44]。miR-181c是CD4(+)T 細(xì)胞的負(fù)調(diào)控因子[45]，miR-181d調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞的急性應(yīng)激反應(yīng)[46]。

本研究選取miR-181a/b作為切入點(diǎn)，研究了miR-181a/b在平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的功能。結(jié)果表明，平滑肌細(xì)胞由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化后，miR-181a/b表達(dá)明顯上調(diào)。miR-181a/b抑制收縮表型基因的表達(dá)，促進(jìn)合成表型基因的表達(dá)，同時(shí)能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖能力。而miR-181a/b inhibitor的作用與miR-181a/b的作用相反。

除此之外，在平滑肌細(xì)胞中沉默SRF的表達(dá)用來(lái)驗(yàn)證其功能，SRF沉默后抑制平滑肌收縮基因的表達(dá)，促進(jìn)合成基因的表達(dá)，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的維持平滑肌收縮功能一致。

通過(guò)生物信息學(xué)分析，SRF可能是miR-181a/b的靶基因，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-181a/b可以直接靶向SRF的3’-UTR序列。western blot結(jié)果表明miR-181a/b明顯降低SRF的蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示miR-181a/b降低SRF的mRNA表達(dá)。

本研究首次證明了在HAoSMCs中SRF是miR-181a/b的靶基因，miR-181a/b通過(guò)直接靶向SRF調(diào)控平滑肌細(xì)胞向合成表型轉(zhuǎn)化，是對(duì)miRNA調(diào)控血管系統(tǒng)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的補(bǔ)充。本研究結(jié)果為血管疾病治療提供途徑和方法。

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