唐古特白刺果多糖對免疫受抑小鼠IFN-γ及T/NK細胞亞群的影響

秀仁杰(1990～)，女，蒙古族，青海籍，2012級科學班研究生.* ：通信作者，教授，E-mail：gampl2003@aliyun.com

唐古特白刺果多糖對免疫受抑小鼠IFN-γ及T/NK細胞亞群的影響

秀仁杰1，索有瑞2，耿排力1*

(1.青海大學醫(yī)學院 青海 西寧 810001；

2.中國科學院西北高原生物研究所藏藥研究中心 青海 西寧 810001 )

摘要目的本研究采用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制模型，探討唐古特白刺果(NTB)多糖對免疫受抑小鼠IFN-γ及T/NK細胞亞群的影響。方法以光學顯微鏡觀察各組小鼠脾臟組織結構的變化；以雙抗體夾心法(ELISA)觀察NTB多糖對免疫受抑小鼠血清中IFN-γ的影響；以RT-PCR法觀察IFN-γ的mRNA表達；以流式細胞術檢測CD3、CD4、CD8及NK(CD49b)細胞在內的T/NK細胞亞群的變化。結果模型+NTB多糖組淋巴濾泡增加明顯；NTB多糖使免疫受抑小鼠血清IFN-γ的含量顯著增加，其mRNA的表達增強。模型+NTB多糖組， CD3`+、CD4`+、CD8`+、NK(CD49b)細胞顯著升高。結論NTB多糖可使免疫受抑小鼠脾臟組織中淋巴細胞數量增多且結構明顯改善；能夠明顯增強免疫受抑小鼠血清IFN-γ的含量并增強IFN-γ mRNA的表達；NTB多糖能使參與細胞免疫的CD3、CD4、CD8及NK(CD49b)細胞數量增加。

關鍵詞NTB多糖免疫受抑模型IFN-γT/NK細胞亞群

中圖分類號R392.5

文獻標識碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.007

AbstractObjectiveTo explore the effect of Nitraria tangutorum Bobr(NTB)polysaccharide on interferon-γ(IFN-γ)and T/NK subsets in immunosuppressed mice model induced by cyclophosphamide.Method The amount of spleen cells and the structure of spleen were observed by light microscope；The contents of IFN-γ were determined by enzyme linked immunoabsorbent assay(ELISA)in serum and the expression of IFN-γ mRNA were observed by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)in immunosuppressed mice ；the function and the quantity of CD3，CD4，CD8 and NK(CD49b) cells which participating in cellular immunology were detected by Flow Cytometry(FCM).Result Lymphoid follicles in model + NTB polysaccharide group increased significantly； and the serum IFN-γ content was significantly increased，and the expression of IFN-γ mRNA enhanced as well.CD3`+，CD4`+，CD8`+ and NK(CD49b)cells were significantly increased in model+NTB polysaccharide group.Conclusion NTB polysaccharide can increase the spleen lymphocytes and improve the structure of thymus and spleen in immunosuppressed mice.The NTB polysaccharide can significantly increase serum IFN-γ and IFN-γmRNA expression； it can also increase the number of CD3，CD4，CD8 and NK(CD49b)cells which involving cellular immunity.

KeywordsNitraria tangutorum BobrImmunosuppressed mice modelIFN-γT/NK subsets

收稿日期2015-01-05

EFFECT OF NITRARIA TANGUTORUM BOBR POLYSACCHARIDE

ON IFN-γ AND T/NK SUBSETS IN IMMUNOUSUPPRESSED MICE

Xiu Renjie1，Suo Yourui2，Geng Paili1

(1.Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai 810001；

2.Research center for Tibetan medicine，Institute of northwestern Plateau，Chinese Academy of science，

Xining，Qinghai 810001)

唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr，NTB)為蒺藜科(Zygophyllceae)白刺屬(Nitraria)植物?，F代藥理學研究表明它具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗疲勞、抗菌[1-3]等作用。索有瑞等[4]研究發(fā)現白刺果實具有調節(jié)免疫作用。本研究擬通過環(huán)磷酰胺建立免疫抑制模型，探討唐古特白刺果(NTB)多糖對免疫功能的影響。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1藥品及試劑

唐古特白刺果(采自青海省德令哈市天然白刺林場，經中國科學院西北高原生物研究所索有瑞研究員鑒定為柴達木產唐古特白刺果正品，共4000 g，烘干后粉碎，冷藏備用)；環(huán)磷酰胺[FCM，批號14022425，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(每瓶0.2g)]；石油醚(沸程 30℃～60℃)、正丁醇、生理鹽水(0.9%)、無水乙醇(國產分析純)；FITC-CD3、PE-CD4、ECY5-CD8、NK(CD49b)(美國BD公司產品)；肝素抗凝劑、紅細胞裂解液、Elisa(IFN-γ)檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；Trizol試劑、逆轉試劑盒、2*TAQpcrmix、5*TAE(天根生化科技有限公司)。引物由華大基因生物工程公司合成。

1.1.2主要儀器

超微細粉碎機(上海泰斯特儀器)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；R-201旋轉蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司)；Cary300型紫外可見分光光度計(美國Varian公司)；78HW-1定時恒溫磁力攪拌器(金壇市正基儀器有限公司)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；BIO-RAD Smartspec3000紫外可見分光光度計(BIO-RAD公司)；酶標儀(BIO-RAD公司)；PCR儀(杭州博日科技有限公司)。

1.2　方法

提取唐古特白刺果的多糖成分，觀察其對免疫受抑小鼠脾細胞數量及脾臟組織結構的影響；測定血清γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)含量及IFN-γmRNA的表達；以流式細胞儀檢測各組參與免疫應答的淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8以及自然殺傷細胞(Natural Killer，NK )細胞的變化。

1.2.1NTB多糖提取及其多糖含量的測定

NTB果實多糖提取工藝流程：NTB干果→清潔粉碎→加4倍體積石油醚除脂→濾渣揮干加10倍體積80%乙醇85 ℃回流提取2次→濾渣中加入5倍體積蒸餾水→ 90 ℃提取3次，每次60 min →水提液減壓蒸餾濃縮→雙氧水氧化法脫色→Sevag法去蛋白→乙醇沉淀→有機溶劑脫水→冷凍干燥→NTB多糖。其多糖含量測定時用標準葡萄糖溶液，以苯酚-硫酸法測定。建立回歸方程為y=0.0094x-0.0256，R2=0.9986。測得多糖含量為47.78%。

1.2.2動物及分組

昆明種小鼠36只，清潔級，質量(25±2)g，雌雄各半；購自青海省地方病研究所，合格證號：2014009。隨機分為三組，每組12只，設正常對照組、模型組及模型+NTB多糖組。模型組腹腔注射環(huán)磷酰胺(80mg/kg)，連續(xù)5 d。模型+NTB多糖組腹腔注射環(huán)磷酰胺(80mg/kg)，連續(xù)5 d，造模成功后腹腔注射NTB多糖(3.6g/kg)[6]，連續(xù)10 d。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水。末次給藥24 h后斷頸采血，稱取脾臟和胸腺，取外周血測定IFN-γ、CD3、CD4、CD8及NK(CD49b)的含量。

1.2.3脾臟、胸腺免疫器官及脾臟組織結構觀察

末次給藥24 h后，斷頸處死各組小鼠，無菌取出脾臟和胸腺，小心清除脾臟及胸腺附著的結蹄組織，用生理鹽水清洗，吸水紙吸干水分后用分析天平稱重，計算脾臟指數和胸腺指數。脾臟稱重后固定做石蠟切片，HA染色，40倍顯微鏡下觀察淋巴濾泡及其結構。

1.2.4脾細胞IFN-γ的mRNA提取

按上述方法取出脾臟后制成脾細胞懸液，采用Trizol試劑盒按說明書操作提取總RNA。所提RNA溶于DEPC處理水(50 μL)溶解，用5 μL在紫外分光光度計下檢測RNA的純度以及定量，總RNA-80 ℃保存?zhèn)溆?，其?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5逆轉錄(RT-PCR)合成

反應合成cDNA 取上述mRNA溶液10 μL，按照逆轉錄試劑盒操作進行cDNA 擴增，反應產物即cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?引物序列見表1)。

表1　IFN-γPCR擴增引物序列

1.2.6PCR擴增

以上述cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系總體積為50 μL。逆轉錄反應：42 ℃ 50 min；接著95 ℃ 5 min滅活逆轉錄酶。PCR反應循環(huán)參數設置：變性溫度85 ℃ 1 min；退火溫度54 ℃ 1 min；延伸溫度72 ℃ 2 min；共40個循環(huán)。72 ℃保溫7 min。

1.2.7PCR產物定量

取PCR擴增產物20 μL用5%瓊脂糖凝膠進行電泳；1% Gel Green顯色后用Bio Rad mycycler凝膠掃描儀對電泳凝膠中的PCR產物條帶進行密度掃描，以β-actin作為RT-PCR的質控，計算IFN-γ mRNA與其對應的β-actin峰面積的比值，從而得出NTB多糖對免疫受抑小鼠IFN-γmRNA 表達的影響。

1.2.8小鼠血清IFN-γ的測定

用外周血(0.5mL)分離血清，采用雙抗體夾心法(ELISA)測定血清IFN-γ含量。取50 μL血清稀釋3倍后加入酶標板內，具體操作步驟按ELISA試劑盒說明進行。

1.2.9T/NK細胞亞群分析

各組外周血T淋巴細胞亞群及NK細胞的檢測：取血約0.5 mL用肝素抗凝，取200 μL抗凝血加入單克隆抗體CD3、CD4、CD8和NK(CD49b)熒光標記單克隆抗體20 μL中充分混勻，避光孵育20～35 min，標記樣品中分別加入紅細胞裂解液，白細胞(WBC)穩(wěn)定劑及細胞膜固定劑處理后用流式細胞儀進行檢測。

1.2.10統(tǒng)計學處理

2結果

2.1　NTB多糖對免疫受抑小鼠脾臟及胸腺重量及指數的影響(表2)

表2　NTB多糖對免疫受抑小鼠脾臟及胸腺重量、指數的影響( ± s)

Table 2　Effect of NTB polysaccharedes on the weight of spleen and thymus in immunosuppressed mice( ± s)

表2　NTB多糖對免疫受抑小鼠脾臟及胸腺重量、指數的影響( ± s)

組別n體重(g)胸腺重量(mg)胸腺指數脾臟重量(mg)脾臟指數正常對照組1227.38±3.9169.20±4.042.52±0.1694.14±8.493.41±0.21模型組1223.25±2.75*20.07±3.66*0.12±0.04*45.00±5.5*1.73±0.17*模型+NTB多糖組1227.07±3.63▲26.05±4.27*▲0.17±0.04*▲81.56±4.38*▲3.18±0.03▲F 5.287 539.491 2351.042 193.045 404.152P <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

注：*表示與正常對照組比較P<0.05；▲表示與模型組比較P<0.05.Notes：*compared with normol groupP<0.05；▲compared with model groupP<0.05.

表2顯示，模型組與正常對照組相比，胸腺及脾臟重量均下降，差異顯著(P<0.05)；模型+NTB多糖組與模型組相比其胸腺及脾臟重量均顯著上升，有明顯差異(P<0.05)。

2.2　NTB多糖對免疫受抑小鼠脾臟組織結構的影響(圖1)

1 正常對照組2 模型組3 模型+NTB多糖組

1 Normal Group2 Model Group3 Model+NTB polysaccharide Group

圖1各組小鼠脾臟組織結構變化圖

Figure 1Changes of the spleen structure in the three groups

圖1顯示，模型組淋巴濾泡及淋巴小結消失，模型組與正常組相比有明顯差異；模型+NTB多糖組與模型組差異明顯，模型+NTB多糖組的淋巴濾泡及淋巴小結恢復。

2.3　NTB多糖對免疫受抑小鼠脾細胞IFN-γ mRNA表達的影響(表3，圖2)

表3　NTB多糖對免疫受抑小鼠脾細胞IFN-γmRNA表達的影響( ± s)

Table 3　Effects of NTB polysaccharedes on IFN-γ mRNA expression in Immunosuppressed mice( ± s)

表3　NTB多糖對免疫受抑小鼠脾細胞IFN-γmRNA表達的影響( ± s)

組別nIFN-γ/β-actin血清IFN-γ(pg·mL-1)正常對照組120.564±0.132723.66±6.99模型組120.267±0.225*505.56±4.45*模型+NTB多糖組120.545±0.227▲886.64±4.28*▲F 8.322 15131.033P <0.05 <0.05

注：*表示與正常對照組比較P<0.05；▲表示與模型組比較P<0.05.Notes：*compared with normol groupP<0.05；▲compared with model groupP<0.05.

表3顯示，模型+NTB多糖組與模型組相比，IFN-γ顯著升高，差異顯著(P<0.05)。

1模型+NTB多糖組2模型組3正常對照組

1 Model+NTB polysaccharide Group2 Model Group3 Normal Group

圖2RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 2RT-PCR agarose gel electrophoresis

圖2顯示，半定量分析NTB對小鼠脾細胞中IFN-γ mRNA表達的影響，其目的條帶與內參(β-actin)相比較，模型+NTB組可明顯增強IFN-γ mRNA的表達(P<0.05)，并使免疫受抑小鼠模型IFN-γ的mRNA表達接近正常對照組水平。

2.4　NTB多糖對外周血T/NK細胞亞群的影響(表4，圖3～5)

表4　NTB多糖對外周血淋巴細胞/NK細胞亞群的影響( ± s)

Table 4　Impact of NTB polysaccharides on peripheral blood lymphocytes and NK subsets( ± s)

表4　NTB多糖對外周血淋巴細胞/NK細胞亞群的影響( ± s)

組別nCD3+(%)CD4++(%)CD8+(%)NK(%)正常對照組1266.2±16.3633.1±3.0619.3±1.4022.5±0.29模型組1238.6±8.24*13.5±9.07*11.1±8.86*10.8±2.04*模型+NTB多糖組1267.4±13.06▲32.6±2.30▲17.6±6.42▲21.7±1.03▲F 18.881 46.382 5.542 289.835P <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

注：*表示與正常對照組比較P<0.05；▲表示與模型組比較P<0.05.Notes：*compared with normol groupP<0.05；▲compared with model groupP<0.05.

圖3　正常對照組CD3、CD4、CD8及NK細胞比值

圖4　模型組CD3、CD4、CD8及NK細胞比值

圖5　模型+NTB多糖組CD3、CD4、CD8及NK細胞比值

表4及圖3～5可見，與模型組相比，模型+NTB組CD3+、CD4+、CD8+、NK(CD49b)細胞顯著升高(P<0.05)，說明NTB多糖對免疫受抑小鼠T細胞亞群及NK細胞具有保護和促進作用。

3討論

近年來，國內外學者對中藥多糖從不同角度進行了大量研究，并逐步闡明其化學、生理學和藥理學等多方面的性質[5-6]。

本研究在索有瑞等前期工作基礎上，利用NTB多糖對小鼠免疫受抑模型進行干預，觀察其免疫器官及細胞因子、淋巴細胞亞群、NK細胞在內的多項指標。實驗結果表明，NTB多糖對免疫受抑小鼠模型受損的脾、胸腺具有保護作用。這與張樂萃等以復方中藥多糖，張曉冬用大棗和地黃多糖觀察其對免疫器官影響的研究結果有相同之處[7-8]。

IFN-γ是諸多細胞因子的一種，它能對宿主免疫細胞活性產生影響，如對巨噬細胞、T細胞、B細胞和NK細胞等均有調節(jié)作用[9]。本實驗中我們觀察到，NTB多糖能增強免疫受抑小鼠脾細胞中IFN-γ的mRNA表達，亦能增加血清中IFN-γ含量。

T細胞亞群按其CD抗原主要分為三類，其中CD3主要代表成熟T細胞，而CD4則代表輔助性T細胞(Th)，CD8代表抑制性T細胞(Ts)[10]。臨床上，通過檢測外周血T細胞亞群及Th/Ts比值了解患者的免疫狀態(tài)。可以說，Th和Ts亞群是免疫應答的核心樞紐。本實驗中，NTB多糖可上調由免疫抑制劑環(huán)磷酰胺導致的T細胞亞群數量降低，對免疫系統(tǒng)呈現有效的保護作用。NK細胞作為天然免疫系統(tǒng)的重要效應細胞，通過介導細胞毒性免疫反應，分泌細胞因子等途徑發(fā)揮免疫監(jiān)視、免疫調節(jié)的重要功能。本實驗中，NTB多糖亦能提高低下的NK(CD49b)，這說明對以NK為代表的非特異性免疫也有較強的調整作用。朱彩平、張聲華報道，枸杞多糖對肝癌H22荷瘤鼠的T淋巴細胞和NK細胞活性具有增強作用[11]。譚周進、謝大憑和Ims A等也有類似的報道[12-13]。

NTB多糖的特殊結構可能有利于宿主免疫系統(tǒng)的識別，不僅能提高機體的非特異性免疫，還能夠提高特異性免疫。至于其提高和調整免疫功能詳細機制有待進一步研究。

參考文獻

[1]索有瑞，王洪倫，汪漢卿.柴達木盆地唐古特白刺果實降血脂和抗氧化作用研究[J].天然產物研究與開發(fā)，2004，16(1)：54-58.

[2]朱利娜，強偉，史俊友，等.唐古特白刺果粉的抗氧化作用研究[J].中國野生植物資源，2010，29(2)：41-44.

[3]馬挺軍，徐藝青.西伯利亞白刺籽油的抗疲勞活性[J].中國實驗動物學報，2012，20(5)：77-79.

[4]索有瑞，李玉林，王洪倫，等.柴達木盆地唐古特白刺果實調節(jié)免疫、抗疲勞和耐寒冷作用研究[J].天然產物研究與開發(fā)，2005，17(6)：717-721.

[5]常改，楊溢，霍飛，等.植物多糖的研究進展及保健功能[J].中國公共衛(wèi)生，2003，19(11)：1394-1395.

[6]陶遵威，鄭奪，邸明磊，等.植物多糖的研究進展[J].藥物評價研究，2010，33(2)：148-152.

[7]張樂萃，王金寶，孫月平，等.復方中藥多糖對雞免疫器官形態(tài)學的影響[J].中國獸醫(yī)科技，1998，28(8)：26-28.

[8]張曉冬.兩種中藥多糖對小鼠性腺及免疫器官的影響[J].中國保健營養(yǎng)(中旬刊)，2013，10：42-44.

[9]B. Wei，S.Baker，J.Wieckiewicz，et al.IFN-γ Triggered STAT1-PKB/AKT Signalling Pathway Influences the Function of Alloantigen Reactive Regulatory T Cells[J].American Journal of Transplantation，2010，10(1)：69-80.

[10]Marik Jutel，Cezim A. Akdis.T Cell Subset Regulation in Atopy[J].Current Allergy and Asthma Reports，2011，11(2)：139-145.

[11]朱彩平，張聲華.枸杞多糖對肝癌H22荷瘤鼠的抑瘤和免疫增強作用[J].營養(yǎng)學報，2006，28(2)：182-183.

[12]譚周進，謝大憑. 多糖的研究進展[J].食品科技，2002，(3)：10-12.

[13]Ims A，Kim K，Lee CK.Immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Salicornia herbacea[J].Int Immunopharmcol，2006，6(9)：1451-1458.