帕立骨化醇聯(lián)合氯沙坦治療糖尿病腎病大鼠的實驗研究

帕立骨化醇聯(lián)合氯沙坦治療糖尿病腎病大鼠的實驗研究*

蘭凱張光偉常遠(yuǎn)武曉慧張渭民宮博文

(西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院， 陜西 西安 710021)

【摘要】目的觀察維生素D類似物帕立骨化醇聯(lián)合氯沙坦對糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠腎組織中腎素水平以及血漿中高敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity-C response protein,hs-CRP)的影響。方法采用鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射的方法構(gòu)建DN大鼠動物模型，將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為帕立骨化醇組(P組)、氯沙坦治療組(T組)、帕立骨化醇+氯沙坦聯(lián)合治療組(L組)、DN組(D組)，每組10只；并設(shè)置健康對照組(N組)10只。給藥12周后檢測24小時尿蛋白定量、血漿hs-CRP及血生化指標(biāo)，通過ELISA法檢測腎組織中腎素和血管緊張素Ⅱ(angio- tensinⅡ，AngⅡ)濃度變化。結(jié)果與D組相比，P、T、L組24小時尿蛋白定量水平較低，L組24小時尿蛋白定量顯著低于P組、T組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。與D組相比，P、T、L組、腎素及AngⅡ、hs-CRP水平降低，L組顯著低于P組、T組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論帕立骨化醇聯(lián)合氯沙坦治療糖尿病腎病大鼠可更好地保護(hù)糖尿病腎病大鼠的腎功能，其機(jī)制可能與通過抑制腎素，降低hs-CRP水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】糖尿病腎病； 帕立骨化醇； 腎素； 高敏C反映蛋白

【中圖分類號】R 587.2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項目：陜西省教育廳科技基金計劃項目(14JK1625)

收稿日期：( 2015-01-15； 編輯： 張文秀)

Effects of paricalcitol and losartanin on treatment of diabetic nephropathy ratsLAN Kai, ZHANG Guangwei, CHANG Yuan,etal

(DepartmentofClinicalMedicine,Xi＇anMedicalUniversity,Xi＇an710021,China)

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of 1,25- (OH)2 D3 analogs Paricalcitol and Lonsartan on the level of renin, high sensitivity-C response protein in the kidney of diabetic nephropathy (DN) rats and its possible mechanism. MethodsDN model rats were established by intraperitoneal injection with streptozotocin(STZ). All the DN rats were randomly divided into the paricalcitol group (group P), the losartan group (group T), the combination of paricalcitol and losartan group (group L), the DN group (group D) and the health control (group N). 24-h urinary protein and hs-CRP and serum biochemical indicators were examined after 12 weeks. ELISA methods were applied to detect the concentration change of renin and AngⅡ in the kidney. ResultsCompared with Group D, 24-h urinary protein of Group P, T and L were markedly decreased, Group L was significantly lower than Group P and Group T in 24-h urinary protein (P<0.05). Compared with Group D renin and AngⅡand hs-CRP of Group P, T and L were markedly decreased, Group L was significantly lower than Group P and Group T in renin and AngⅡand hs-CRP (P<0.05). ConclusionCombined therapy with Paricalcitol and Lonsartan could better improve the renal function of diabetic nephropathy rats,the decrease of rennin and CRP may be involved.

【Key words】Diabetic nephropathy； Proteinuria； Renin；High sensitivity-C response protein

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一，一旦發(fā)展到終末期腎病必須依靠腎臟替代治療來維持，故早期治療非常重要。微量蛋白尿是糖尿病腎病的早期標(biāo)志，蛋白尿是影響腎功能的獨立危險因素，在此時進(jìn)行有效的干預(yù)治療，可以起到早期腎保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)腎素、血漿hs-CRP水平與糖尿病腎病的嚴(yán)重程度及預(yù)后顯著相關(guān)?；钚跃S生素D具有獨立于甲狀旁腺激素調(diào)節(jié)作用[3]，可以減少糖尿病腎病大鼠的尿蛋白及腎損傷，但具體機(jī)制尚不清楚，可能與抑制腎素水平有關(guān)。本研究擬通過帕立骨化醇聯(lián)合氯沙坦對糖尿病腎病大鼠腎組織中腎素水平以及血漿hs-CRP的影響，探討其干預(yù)蛋白尿形成及腎保護(hù)的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動物模型的建立與分組清潔2級封閉群雄性SD大鼠50只(浙江大學(xué)動物中心提供)，體質(zhì)量(220±20)g。40只大鼠造模，10只為健康對照組(N組)。大鼠禁食10小時后，單次無菌腹腔注射65mg/kg體質(zhì)量鏈脲菌素(STZ，美國Sigma)。72h后取尾靜脈血測空腹血糖(FBG)，F(xiàn)BG≥16.65mmol/L確定為糖尿病大鼠，3周后尿蛋白量(24h)≥30mg確認(rèn)DN大鼠模型制備成功；健康對照組注射等量的檸檬酸緩沖液。造模成功的DN大鼠隨機(jī)分為：帕立骨化醇治療組10只(P組)，予帕立骨化醇膠囊溶于丙二醇，以0．4μg/kg劑量每周灌胃3次；氯沙坦治療組10只(T組)予氯沙坦片溶于蒸餾水，以10mg/kg的劑量每天灌胃；聯(lián)合治療組(L組)10只予帕立骨化醇0.4μg/kg每周灌胃3次 +氯沙坦10mg/kg每天灌胃；糖尿病腎病組10只(D組)。D組與N組給予等量丙二醇和蒸餾水灌胃，連續(xù)12周。12周后收集24小時尿及4~5ml動脈血。

1.2一般指標(biāo)檢測24小時尿蛋白定量，hs-CRP、血肌酐(Scr)、FBG、血鈣、血磷和甲狀旁腺激素(PTH)。

1.3腎素和AngⅡ測定將腎組織剪碎、加預(yù)冷的0.05mol/L PBS(10ml/g)，組織勻漿，離心(4000r/min×20min，4℃)，取上清液,-70℃凍存?zhèn)溆?，用ELISA方法測定腎素和AngⅡ(美國Genzyme公司試劑盒)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般指標(biāo)變化實驗期間糖尿病腎病造模大鼠出現(xiàn)明顯多飲多尿以及消瘦,動作遲緩，皮毛萎黃無光澤；各組造模大鼠中，藥物干預(yù)的3組大鼠一般情況好于D組。第12周時P組、T組、L組、D組24小時尿蛋白、肌酐和尿素氮水平均顯著高于N組(均P<0.05)；與D組相比，P組、T組、L組24小時尿蛋白定量水平較低，L組24小時尿蛋白定量顯著低于P組、T組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　治療12周后各組大鼠指標(biāo)比較 ± s)

注：與D組相比，aP<0.05;與L組相比，bP<0.05

2.2各組大鼠腎組織腎素和AngⅡ改變P組、T組、L組、D組腎素、AngⅡ濃度高于N組(均P<0.05)；P組、T組腎素、AngⅡ濃度高于L組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

Tab.2The concentration change of renin and AngⅡ in the renal tissue after 12w therapy

組別鼠數(shù)(只)腎素(μg/mg)AngⅡ(pg/mg)N組103.74±0.33ab18.44±2.26abP組105.77±0.38ab25.86±3.99abT組107.34±0.41ab24.86±3.26abL組105.53±0.34a23.72±4.01aD組1010.02±0.61b37.23±3.87b

注：與D組相比，aP<0.05;與L組相比，bP<0.05

2.3各組hs-CRP變化情況P組、T組、L組、D組hs-CRP高于N組(均P<0.05)；P組、T組hs-CRP濃度高于L組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

3討論

糖尿病腎病是糖尿病患者臨床常見慢性微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病最常見病因之一。微量蛋白尿是糖尿病腎病的早期標(biāo)志，也是糖尿病腎病進(jìn)展的獨立危險因素。目前蛋白尿發(fā)生的確切機(jī)制尚不清楚，有研究結(jié)果顯示與腎小球濾過屏障密切相關(guān)，其蛋白結(jié)構(gòu)的改變可能與糖尿病腎病時RAS系統(tǒng)激活有關(guān)[1-3]。腎臟系膜細(xì)胞AngⅡ合成增多，局部AngⅡ活性增高，可誘發(fā)腎小球內(nèi)壓增大，引起尿蛋白排泄增加。糖尿病腎病患者體內(nèi)細(xì)胞炎性因子如IL-1、TNF-α、CRP、血小板活化因子等的合成增多，炎性因子具有促進(jìn)腎小球動脈硬化及細(xì)胞增生的作用，且炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度與糖尿病腎病腎臟損傷程度具有相關(guān)性[4-6]。CRP 是臨床常用的炎性因子，對糖尿病腎病的嚴(yán)重程度及預(yù)后有重要的預(yù)測意義。本研究顯示，糖尿病腎病組較正常對照組腎素、AngⅡ及CRP水平均有升高，提示這些指標(biāo)與糖尿病患者腎臟損傷密切相關(guān)。

表3　治療12周后各組大鼠血漿hs-CRP水平比較

注：與D組相比，aP<0.05;與L組相比，bP<0.05

活性維生素D即1，25-(OH)2D3是維生素D的活性形式，帕立骨化醇是維生素D類似物，具有與活性維生素D相似的生物學(xué)活性。它通過細(xì)胞內(nèi)特異的維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)介導(dǎo)發(fā)揮其生物學(xué)活性。近年來隨著對活性維生素D研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有獨立于鈣磷代謝以外的腎臟保護(hù)作用[7，8]。DN時活性維生素D水平與血漿腎素活性和血管緊張素Ⅱ呈負(fù)相關(guān)[9，10]。通過轉(zhuǎn)基因動物模型研究RAS和活性維生素D的相互關(guān)系發(fā)現(xiàn)，VDR基因敲除小鼠腎臟的腎素mRNA和蛋白水平表達(dá)均增加[11，12]。在給予野生型小鼠飲食添加鍶，以抑制活性維生素D生物合成后，其腎臟腎素mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，而經(jīng)注射維生素D活性物后，腎素表達(dá)下調(diào)，提示活性維生素D可抑制腎素的生物合成，是腎素表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)子[13]。活性維生素D可能通過調(diào)節(jié)抑制腎素合成基因表達(dá)的環(huán)腺苷酸(cAMP)信號通路，部分阻斷cAMP與cAMP反應(yīng)原件結(jié)合區(qū)對腎素基因啟動子的活化，抑制腎素基因轉(zhuǎn)錄的啟動，以減少腎素的合成[14]。

4結(jié)論

血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)能降低糖尿病腎病患者的蛋白尿，但不是所有患者對這項治療有反應(yīng)。在許多病例中，由于RAS的不完全阻斷，可引起代償性激活腎臟球旁器分泌腎素，使血漿腎素活性出現(xiàn)代償性升高， ARB阻滯RAS的作用減弱，出現(xiàn)血管緊張素Ⅱ和醛固酮逃逸現(xiàn)象[15]。而活性維生素D能通過抑制循環(huán)及腎臟局部組織RAS活性而對腎臟具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用不依賴細(xì)胞外鈣磷水平的變化，活性維生素D抑制腎素基因轉(zhuǎn)錄這一發(fā)現(xiàn)為使用維生素D類似物來補(bǔ)償性抑制腎素增高提供了一個良好的理論基礎(chǔ)?；谶@個原理，我們的研究結(jié)果證明用ARB和維生素D類似物的聯(lián)合治療，可協(xié)同抑制RAS系統(tǒng)，抵消腎素的代償性升高，降低炎性因子，起到更強(qiáng)的腎臟保護(hù)作用。

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