水飛薊賓抑制NF-κB活化下調(diào)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞iNOS表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

水飛薊賓抑制NF-κB活化下調(diào)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞iNOS表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

武艷強(qiáng)王慧娟馮社軍袁芳李鶴飛馮強(qiáng)侯?lèi)?ài)軍申玉良

(邯鄲市中心醫(yī)院， 河北 邯鄲 056001)

【摘要】目的探討水飛薊賓(SIL)對(duì)H2O2誘導(dǎo)狀態(tài)下H9C2心肌細(xì)胞iNOS的調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)的分子機(jī)制。方法將大鼠心肌H9C2細(xì)胞分為對(duì)照組(Control組)、水飛薊賓+H2O2組 (SIL+H2O2組)和H2O2組三組。在200μM的H2O2干預(yù)6小時(shí)后使用RT-PCR法和western blot法對(duì)H9C2心肌細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，使用western blot法對(duì)H9C2心肌細(xì)胞NF-κB磷酸化水平(Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果與對(duì)照組相比較，在H2O2干預(yù)6小時(shí)后 H9C2心肌細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)水平和NF-κB p65活化水平均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；但與H2O2組相比較水飛薊賓+H2O2組iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)及NF-κB p65磷酸化水平的增加更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和損傷過(guò)程中水飛薊賓可能可以通過(guò)抑制NF-κB p65的活化下調(diào)iNOS的表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】水飛薊賓； H9C2心肌細(xì)胞； 過(guò)氧化氫(H2O2)； 誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)； NF-κB

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 965.2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目：河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(20130359)

收稿日期：( 2014-08-07； 編輯： 張文秀)

Down-regulates iNOS expression of silibinin by inactivation of NF-κB in H2O2-induced H9C2 cardiomyocytes WU Yangqiang, WANG Huijuan，F(xiàn)ENG Shejun，etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the role of silibinin (SIL) on the regulation of iNOS expression in H2O2-induced injury, and its potential mechanism in rat H9C2 cardiomyocytes. MethodsH9C2 cardiomyocytes were divided into three groups, Control group, SIL+H2O2 group and H2O2 group. After 6 hours H2O2 stimulation, RT-PCR was used to measure the mRNA expression of iNOS. Meanwhile, western blot was performed to analyze the protein expression of iNOS and the ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65. ResultsAfter 6 hours H2O2 stimulation, the mRNA and protein expression of iNOS was significantly enhanced, and the ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65 was largely increased. Moreover, H2O2-induced the up-regulation of iNOS and the enhanced level of NF-κB p65 were both inhibited by silibinin in rat H9C2 cardiomyocytes. ConclusionsSilibinin down-regulates iNOS expression possibly via inactivation of NF-κB p65 in H9C2 cardiomyocytes after H2O2 stimulation.

【Key words】Silibinin; H9C2 cardiomyocytes; H2O2; iNOS; NF-κB

水飛薊賓(silibinin, SIL)屬于水飛薊素(silymarin)的一種，是藥用菊科植物水飛薊主要的活性成分之一[1-3]。目前藥理研究證實(shí)水飛薊賓具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激、抗纖維化、促進(jìn)細(xì)胞再生和促進(jìn)脂代謝等較為廣泛的生物活性和藥理價(jià)值[1-5]。目前臨床上廣泛應(yīng)用于肝硬化、肝炎及中毒等疾病的治療[1-5]。進(jìn)一步的研究顯示水飛薊賓的藥理作用和生物活性與調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)的活化水平密切相關(guān)[6, 7]。本研究的目的是探討水飛薊賓對(duì)H2O2誘導(dǎo)狀態(tài)下H9C2心肌細(xì)胞iNOS的調(diào)節(jié)作用，及其相關(guān)的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料大鼠H9C2心肌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；水飛薊賓購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司；總RNA抽提試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；兔抗鼠iNOS抗體、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗體、兔抗鼠NF-κB p65和兔抗鼠β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia公司)，DMSO (二甲基亞砜，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)大鼠H9C2心肌細(xì)胞常規(guī)接種在含15%胎牛血清，100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37℃，5 % CO2，孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每72h換液、傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。H9C2心肌細(xì)胞分為對(duì)照組(Control組)、水飛薊賓+H2O2組 (SIL+H2O2組)和H2O2組，共3組。其中對(duì)照組細(xì)胞加入PBS；H2O2組和水飛薊賓+H2O2組加入H2O2(200μM)；水飛薊賓+H2O2組加入100μM的水飛薊賓進(jìn)行干預(yù)。

1.3細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)檢測(cè)干預(yù)6h后，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。引物：iNOS正義5′-TCTGTGCCTTTGCTGATGAC-3′，反義5′-CATGGTGAACACGTTCTTGG -3′和β-actin正義：5′- ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，反義：5′-GCCGCTGGGGAAGATGTGCT-3′。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)介紹進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描分析。用與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為iNOS mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)和NF-κB活化水平干預(yù)6h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗鼠iNOS抗體 (1∶800)、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗體(1∶1000)、兔抗鼠NF-κB p65抗體(1∶1000)和兔抗鼠β-actin 抗體(1∶1500)，4 °C孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。使用iNOS/β-actin和Phospho- NF-κB p65/total NF-κB p65顯影強(qiáng)度比值進(jìn)行蛋白表達(dá)量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)在干預(yù)6h后，使用RT-PCR法和western blot法對(duì)H9C2心肌細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比較，H9C2心肌細(xì)胞在H2O2刺激后iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。但與H2O2組相比較，水飛薊賓+H2O2組iNOS的表達(dá)增加水平更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)圖1和表1。

圖1H9C2心肌細(xì)胞iNOS表達(dá)的RT-PCR和western blot結(jié)果

Figure 1The RT-PCR and western blot results of iNOS in H9C2 cardiomyocytes

Table 1The mRNA and protein expression of iNOS, and the phosphorylation level of NF-κB p65 in H9C2 cardiomyocytes

組別iNOSmRNAiNOS蛋白Phospho-NF-κBp65/totalNF-κBp65Control組0.21±0.050.19±0.040.22±0.05H2O2組0.92±0.09①0.94±0.11①0.97±0.05①水飛薊賓+H2O2組0.51±0.17①②0.46±0.14①②0.53±0.12①②

注：①與Control組相比較P<0.05；②與H2O2組相比較P<0.05

2.2NF-κB p65的活化水平在H2O2干預(yù)6h后，使用western blot法對(duì)H9C2心肌細(xì)胞NF-κB p65磷酸化水平(Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，H9C2心肌細(xì)胞在H2O2干預(yù)后Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但與H2O2組相比較，水飛薊賓+H2O2組Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值增加水平更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2和表1。

圖2H9C2心肌細(xì)胞NF-κB p65活化的western blot結(jié)果

Figure 2The western blot results of the phosphorylation of NF-κB p65 in H9C2 cardiomyocytes

3討論

冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病(coronary arteriosclerotic heart disease, CAD)簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病。是由血脂血糖異常增高等多種因素導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)的慢性損傷，致血小板和泡沫細(xì)胞聚集，脂質(zhì)斑塊形成，最終導(dǎo)致血管腔部分或完全阻塞而引起血供相應(yīng)區(qū)域心肌細(xì)胞缺血缺氧壞死的臨床綜合征[8-11]。血流變學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示冠心病業(yè)已成為導(dǎo)致人類(lèi)死亡的頭號(hào)疾病[8-11]。心肌保護(hù)(cardiomyocytes protection)即通過(guò)減輕和抑制心肌炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激減少心肌細(xì)胞的死亡和凋亡，在冠心病尤其是急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndromes, ACS)是CAD治療中扮演著重要的角色[8-11]。

研究表明ACS導(dǎo)致過(guò)度的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死和凋亡的重要原因，抑制并減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可以有效減緩心肌細(xì)胞的死亡及損失的范圍[8-12]。水飛薊素(silymarin)是中藥菊科植物水飛薊的有效活性成分，包括水飛薊賓(silibinin)、異水飛薊賓(isosilybin)、水飛薊寧(silydianin)和水飛薊亭(silychristin)等多種化合物的總稱(chēng)[1-7]。研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓的藥理作用最顯著，具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激、促進(jìn)糖代謝和脂代謝、抑制器官纖維化和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等的作用。水飛薊賓還具有抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成等生物活性[1-7]。在炎癥狀態(tài)下，水飛薊賓可以有效的抑制LPS誘導(dǎo)的人HMC-1肥大細(xì)胞組胺的釋放，以及炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6和IL-8的合成[13]。水飛薊賓紫外線誘導(dǎo)的小鼠成纖維L929細(xì)胞凋亡和自噬具有保護(hù)作用[14]，可以有效抑制卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥[15]。誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)在氧化應(yīng)激反應(yīng)中扮演著重要的角色，在氧化應(yīng)激過(guò)程中iNOS表達(dá)上調(diào)，使NO合成增加[16, 17]。NO具有多種生物活性，低劑量即生理狀態(tài)下時(shí)可作為第一信號(hào)分子，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張；但在炎癥狀態(tài)和氧化應(yīng)激狀態(tài)下NO作為強(qiáng)氧化劑可以直接損傷心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和壞死[16, 17]。

近期的研究表明水飛薊賓的抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的藥理作用與抑制調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)的活化水平密切相關(guān)[13, 15, 18]。NF-κB作為重要的且廣泛表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，在多種生理和病理狀態(tài)下扮演著重要的角色[19, 20]。NF-κB活化后形成二聚體，經(jīng)細(xì)胞核膜表明的核孔轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的κB序列結(jié)合，調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄活性[19, 20]。大量研究顯示抑制NF-κB的活化對(duì)于減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)鍵作用[19, 20]。Tao Zhu等人的研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可以通過(guò)抑制NF-κB活化減輕LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)[20]。NF-κB對(duì)iNOS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)具有關(guān)鍵調(diào)控作用[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水飛薊賓對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞NF-κB活化有顯著的抑制作用。

4結(jié)論

在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和損傷過(guò)程中水飛薊賓可能可以通過(guò)抑制NF-κB p65的活化下調(diào)iNOS的表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

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