·論著·
1,25-二羥維生素D3對人系膜細胞增殖作用的影響
楊銳,尹璇,張昊,陳建平,馬莉,張春江,楊曉萍
作者單位:832000新疆石河子市,石河子大學(楊銳,尹璇,張昊,陳建平,馬莉);石河子大學第一附屬醫(yī)院腎病科(張春江,楊曉萍)
通信作者:楊曉萍,832000新疆石河子市,石河子大學第一附屬醫(yī)院腎病科;E-mail:sbkyxp@163.com
【摘要】目的通過觀察1,25-二羥維生素D3〔1,25(OH)2D3〕對Ki-67抗原表達的影響,探討其對人系膜細胞增殖的抑制作用。方法體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞,隨機分為正常對照組、表皮生長因子(EGF)組、1,25(OH)2D3組及EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組,培養(yǎng)48 h后,應用免疫熒光技術和熒光定量PCR(RT-PCR)檢測Ki-67抗原及其mRNA的表達。結果正常對照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細胞熒光強度分別為(35.958±2.563)、(49.872±2.745)、(22.415±2.277)和(36.567±2.270),4組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=123.429,P<0.05)。其中,EGF組熒光強度高于正常對照組,1,25(OH)2D3組熒光強度低于正常對照組(P<0.05);1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組熒光強度低于EGF組(P<0.05)。以正常對照組為基準,EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量分別為(2.479±0.150)、(0.584±0.031)和(1.176±0.017),4組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=51.107,P<0.05)。其中,EGF組Ki-67 mRNA相對表達量高于正常對照組,1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量低于正常對照組(P<0.05);1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量低于EGF組(P<0.05)。結論1,25(OH)2D3可抑制人腎小球系膜細胞的增殖,并降低EGF對人腎小球系膜細胞增殖的促進作用。
【關鍵詞】人腎小球系膜細胞;1,25-二羥維生素D3;Ki-67抗原;表皮生長因子;細胞增殖
基金項目:國家自然科學基金資助項目(81160090)
【中圖分類號】R 692.31
收稿日期:(2015-03-12;修回日期:2015-08-29)
楊銳,尹璇,張昊,等.1,25-二羥維生素D3對人系膜細胞增殖作用的影響[J].中國全科醫(yī)學,2015,18(35):4330-4332.[www.chinagp.net]
Yang R,Yin X,Zhang H,et al.Effect of 1,25(OH)2D3on the proliferation of human glomerular mesangial cells[J].Chinese General Practice,2015,18(35):4330-4332.
Effect of 1,25(OH)2D3on the Proliferation of Human Glomerular Mesangial CellsYANGRui,YINXuan,ZHANGHao,etal.MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China
Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3〔1,25(OH)2D3〕 on Ki-67 antigen expression in human glomerular mesangial cells and its inhibitive effect on human glomerular mesangial cell proliferation.MethodsGlomerular mesangial cells were cultured in vitro and divided into normal control group,epidermal growth factor group(EGF group),1,25(OH)2D3group and combined group of EGF and 1,25(OH)2D3.After culture for 48 hours,the expression and the mRNA expression of Ki-67 antigen were measured using immunofluorescence technique and RT-PCR.ResultsThe cell fluorescence intensity was (35.958±2.563),(49.872±2.745),(22.415±2.277) and (36.567±2.270) for normal control group,EGF group,1,25(OH)2D3group and combined group respectively,with significant difference among them(F=123.429,P<0.05).EGF was higher than normal control group in fluorescence intensity(P<0.05),and 1,25(OH)2D3group was lower than normal control group in fluorescence intensity(P<0.05);1,25(OH)2D3group and combined group were lower than EGF group in fluorescence intensity(P<0.05).With normal control group as standard,the relative expression levels of EGF group,1,25(OH)2D3group and combined group were(2.479±0.150),(0.584±0.031)and(1.176±0.017)respectively,with significant difference among them(F=51.107,P<0.05).EGF group was higher than normal control group in the mRNA relative expression level of Ki-67 antigen(P<0.05),1,25(OH)2D3group was lower than normal control group in the mRNA relative expression level(P<0.05);1,25(OH)2D3group and combined group were lower than EGF group in the mRNA relative expression level(P<0.05).Conclusion1,25(OH)2D3can inhibit the proliferation of human glomerular mesangial cell proliferation and reduce the facilitation of EGF for human glomerular mesangial cell proliferation.
【Key words】Human mesangial cells;1,25-Dihydroxyvitamin D3;Ki-67 antigen;Epidermal growth factor;Cell proliferation
系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)為臨床常見的原發(fā)性腎小球腎炎之一,其特征為系膜細胞(MC)的增殖和基質積聚,最終導致終末期腎病。探討MsPGN的發(fā)病機制及相應的治療措施,對改善患者的預后極為重要[1]。有研究表明,增殖的或非增殖的腎小球均有Ki-67抗原、增殖細胞核抗原(PCNA)和拓撲異構酶Ⅱ α等增殖標志物表達[2]。其中,與細胞核增殖相關的Ki-67抗原可在神經干細胞、腫瘤細胞、系膜細胞等多種細胞中表達,是被廣泛用于細胞增殖標志物的蛋白質[3-4]。新近研究表明,1,25-二羥維生素D3〔1,25(OH)2D3〕可抑制腎小球細胞增殖,調節(jié)系膜細胞免疫機制,拮抗Thy-1.1大鼠腎炎模型炎癥浸潤,誘導相應的凋亡反應,促進腎功能修復[5]。本研究探討1,25(OH)2D3對人腎小球系膜細胞增殖及Ki-67抗原表達的影響,為1,25(OH)2D3臨床的廣泛應用提供理論依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1細胞株人腎小球系膜細胞株(4200)購于湘雅醫(yī)學院中心實驗室。
1.1.2試劑及儀器低糖DMEM、胰蛋白酶購于美國Gibco公司;胎牛血清購于杭州四季青生物有限公司;青鏈霉素混合液、DMSO購于北京索萊寶生物科技有限公司;1,25(OH)2D3、表皮生長因子(EGF)購于美國Sigma公司;小鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人Ki-67抗原單克隆抗體購于Cell Signaling公司;山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司;SybrGreen PCR Master Mix購于美國 ABI公司;Zeiss LSM510-META共聚焦顯微鏡購于德國蔡司公司;定量PCR儀購于瑞士羅氏公司。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng)及分組用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基復蘇人腎小球系膜細胞,取傳代培養(yǎng)至第3~8代細胞用于實驗,采用隨機數字表法將其分為正常對照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組。正常對照組加含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,EGF組加10 μg/L的EGF培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基),1,25(OH)2D3組加10-8mol/L的1,25(OH)2D3培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基),EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組加10 μg/L 的EGF及10-8mol/L的1,25(OH)2D3培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基),48 h后收集細胞。
1.2.2細胞免疫熒光技術檢測Ki-67抗原表達將細胞種于蓋玻片上,置于6孔培養(yǎng)板,按照實驗分組方法培養(yǎng)細胞,取出蓋玻片,吸棄培養(yǎng)液,4%多聚甲醛固定30 min,3‰ Triton破膜20 min,封閉后加一抗,置濕盒入4 ℃冰箱過夜,加熒光二抗避光孵育1 h,除封閉外,其余各步均需用0.01 mol/L PBS洗3次,每次5 min,甘油封固,激光共聚焦顯微鏡觀察并采圖,測定熒光強度。實驗重復3次。
1.2.3熒光定量PCR檢測Ki-67抗原表達按照實驗分組培養(yǎng)細胞,提取總RNA,反轉錄cDNA,引物序列:上游:5′-CCCCATTCACCCACCTTG-3′,下游:5′-TGATGTCACCTGGCTCCC-3′。β-actin內參基因引物序列:上游:5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′,下游:5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR參數:95 ℃變性3 min,95 ℃退火15 s,60 ℃延伸40 s,共進行40個循環(huán)。采用相對定量法計算Ki-67 mRNA相對表達量=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(待測組目的基因Ct值-待測組內參基因Ct值)-(基準組目的基因Ct值-基準組內參基因Ct值)。
2結果
2.1人腎小球系膜細胞形態(tài)及生長情況正常對照組細胞胞體透亮,形態(tài)呈梭形、不規(guī)則星形、樹枝狀,胞質較清楚;EGF組細胞形態(tài)與正常對照組比較無明顯改變,但細胞數目增多;1,25(OH)2D3組呈現一定程度的細胞凋亡,胞核皺縮,形態(tài)不清晰,數目較正常對照組明顯減少;EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細胞形態(tài)及生長情況、數目與正常對照組大致相同。
2.2細胞免疫熒光技術檢測Ki-67抗原表達正常對照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細胞熒光強度分別為(35.958±2.563)、(49.872±2.745)、(22.415±2.277)和(36.567±2.270),4組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=123.429,P<0.05)。其中,EGF組熒光強度高于正常對照組,1,25(OH)2D3組熒光強度低于正常對照組(P<0.05);1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組熒光強度低于EGF組(P<0.05,見圖1)。
2.3Ki-67 mRNA相對表達量以正常對照組為基準,EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量分別為(2.479±0.150)、(0.584±0.031)和(1.176±0.017),4組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=51.107,P<0.05)。其中,EGF組Ki-67 mRNA相對表達量高于正常對照組,1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量低于正常對照組(P<0.05);1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量低于EGF組(P<0.05)。
注:A為正常對照組,B 為EGF組,C為1,25(OH)2D3組,D為EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組
圖1各組細胞Ki-67抗原表達的免疫熒光染色結果(×400)
Figure 1Results of immunofluorescent staining of the expression of Ki-67 antigen of each group
3討論
Ki-67抗原是細胞增殖的生物標志物,存在于除有絲分裂G0期之外的細胞周期各階段,其陽性表達預示細胞增殖進入細胞周期[8]。研究發(fā)現,在乳腺癌、賁門癌患者中Ki-67抗原表達增高,而抑制Ki-67 抗原的表達可改善患者預后[8-10]。因此,Ki-67抗原的轉錄和表達水平可反映1,25(OH)2D3對細胞增殖的抑制作用。本研究結果顯示,與正常對照組比較,經1,25(OH)2D3干預的人腎小球系膜細胞細胞核Ki-67抗原及其mRNA表達降低,提示1,25(OH)2D3不僅可從蛋白水平抑制Ki-67抗原的表達,也可從核酸水平抑制Ki-67抗原的表達,從而抑制人腎小球系膜細胞的增殖。
EGF在體內外對多種組織細胞有強烈促分裂作用。Kumar等[11]研究發(fā)現,EGF可刺激系膜細胞的增殖。本研究采用EGF誘導人腎小球系膜細胞增殖的微環(huán)境,并用1,25(OH)2D3進行干預,進一步觀察在EGF誘導系膜細胞增殖的情況下,1,25(OH)2D3是否能抑制系膜細胞的生長與增殖。結果顯示,與EGF組比較,1,25(OH)2D3聯(lián)合EGF組人腎小球系膜細胞細胞核Ki-67抗原及其mRNA表達降低,1,25(OH)2D3可以抑制EGF作用下的人腎小球系膜細胞中的Ki-67抗原的表達。
綜上所述,1,25(OH)2D3可抑制人腎小球系膜細胞的增殖,并降低EGF對人腎小球系膜細胞增殖的促進作用。本研究為體外實驗,1,25(OH)2D3影響人腎小球系膜細胞增殖的具體機制有待進一步研究。
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(本文編輯:吳立波)