• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    1,25-二羥維生素D3對人系膜細胞增殖作用的影響

    2016-01-11 12:15:45楊銳,尹璇,張昊
    中國全科醫(yī)學 2015年35期
    關鍵詞:胎牛系膜腎小球

    ·論著·

    1,25-二羥維生素D3對人系膜細胞增殖作用的影響

    楊銳,尹璇,張昊,陳建平,馬莉,張春江,楊曉萍

    作者單位:832000新疆石河子市,石河子大學(楊銳,尹璇,張昊,陳建平,馬莉);石河子大學第一附屬醫(yī)院腎病科(張春江,楊曉萍)

    通信作者:楊曉萍,832000新疆石河子市,石河子大學第一附屬醫(yī)院腎病科;E-mail:sbkyxp@163.com

    【摘要】目的通過觀察1,25-二羥維生素D3〔1,25(OH)2D3〕對Ki-67抗原表達的影響,探討其對人系膜細胞增殖的抑制作用。方法體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞,隨機分為正常對照組、表皮生長因子(EGF)組、1,25(OH)2D3組及EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組,培養(yǎng)48 h后,應用免疫熒光技術和熒光定量PCR(RT-PCR)檢測Ki-67抗原及其mRNA的表達。結果正常對照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細胞熒光強度分別為(35.958±2.563)、(49.872±2.745)、(22.415±2.277)和(36.567±2.270),4組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=123.429,P<0.05)。其中,EGF組熒光強度高于正常對照組,1,25(OH)2D3組熒光強度低于正常對照組(P<0.05);1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組熒光強度低于EGF組(P<0.05)。以正常對照組為基準,EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量分別為(2.479±0.150)、(0.584±0.031)和(1.176±0.017),4組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=51.107,P<0.05)。其中,EGF組Ki-67 mRNA相對表達量高于正常對照組,1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量低于正常對照組(P<0.05);1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量低于EGF組(P<0.05)。結論1,25(OH)2D3可抑制人腎小球系膜細胞的增殖,并降低EGF對人腎小球系膜細胞增殖的促進作用。

    【關鍵詞】人腎小球系膜細胞;1,25-二羥維生素D3;Ki-67抗原;表皮生長因子;細胞增殖

    基金項目:國家自然科學基金資助項目(81160090)

    【中圖分類號】R 692.31

    收稿日期:(2015-03-12;修回日期:2015-08-29)

    楊銳,尹璇,張昊,等.1,25-二羥維生素D3對人系膜細胞增殖作用的影響[J].中國全科醫(yī)學,2015,18(35):4330-4332.[www.chinagp.net]

    Yang R,Yin X,Zhang H,et al.Effect of 1,25(OH)2D3on the proliferation of human glomerular mesangial cells[J].Chinese General Practice,2015,18(35):4330-4332.

    Effect of 1,25(OH)2D3on the Proliferation of Human Glomerular Mesangial CellsYANGRui,YINXuan,ZHANGHao,etal.MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China

    Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3〔1,25(OH)2D3〕 on Ki-67 antigen expression in human glomerular mesangial cells and its inhibitive effect on human glomerular mesangial cell proliferation.MethodsGlomerular mesangial cells were cultured in vitro and divided into normal control group,epidermal growth factor group(EGF group),1,25(OH)2D3group and combined group of EGF and 1,25(OH)2D3.After culture for 48 hours,the expression and the mRNA expression of Ki-67 antigen were measured using immunofluorescence technique and RT-PCR.ResultsThe cell fluorescence intensity was (35.958±2.563),(49.872±2.745),(22.415±2.277) and (36.567±2.270) for normal control group,EGF group,1,25(OH)2D3group and combined group respectively,with significant difference among them(F=123.429,P<0.05).EGF was higher than normal control group in fluorescence intensity(P<0.05),and 1,25(OH)2D3group was lower than normal control group in fluorescence intensity(P<0.05);1,25(OH)2D3group and combined group were lower than EGF group in fluorescence intensity(P<0.05).With normal control group as standard,the relative expression levels of EGF group,1,25(OH)2D3group and combined group were(2.479±0.150),(0.584±0.031)and(1.176±0.017)respectively,with significant difference among them(F=51.107,P<0.05).EGF group was higher than normal control group in the mRNA relative expression level of Ki-67 antigen(P<0.05),1,25(OH)2D3group was lower than normal control group in the mRNA relative expression level(P<0.05);1,25(OH)2D3group and combined group were lower than EGF group in the mRNA relative expression level(P<0.05).Conclusion1,25(OH)2D3can inhibit the proliferation of human glomerular mesangial cell proliferation and reduce the facilitation of EGF for human glomerular mesangial cell proliferation.

    【Key words】Human mesangial cells;1,25-Dihydroxyvitamin D3;Ki-67 antigen;Epidermal growth factor;Cell proliferation

    系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)為臨床常見的原發(fā)性腎小球腎炎之一,其特征為系膜細胞(MC)的增殖和基質積聚,最終導致終末期腎病。探討MsPGN的發(fā)病機制及相應的治療措施,對改善患者的預后極為重要[1]。有研究表明,增殖的或非增殖的腎小球均有Ki-67抗原、增殖細胞核抗原(PCNA)和拓撲異構酶Ⅱ α等增殖標志物表達[2]。其中,與細胞核增殖相關的Ki-67抗原可在神經干細胞、腫瘤細胞、系膜細胞等多種細胞中表達,是被廣泛用于細胞增殖標志物的蛋白質[3-4]。新近研究表明,1,25-二羥維生素D3〔1,25(OH)2D3〕可抑制腎小球細胞增殖,調節(jié)系膜細胞免疫機制,拮抗Thy-1.1大鼠腎炎模型炎癥浸潤,誘導相應的凋亡反應,促進腎功能修復[5]。本研究探討1,25(OH)2D3對人腎小球系膜細胞增殖及Ki-67抗原表達的影響,為1,25(OH)2D3臨床的廣泛應用提供理論依據。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1細胞株人腎小球系膜細胞株(4200)購于湘雅醫(yī)學院中心實驗室。

    1.1.2試劑及儀器低糖DMEM、胰蛋白酶購于美國Gibco公司;胎牛血清購于杭州四季青生物有限公司;青鏈霉素混合液、DMSO購于北京索萊寶生物科技有限公司;1,25(OH)2D3、表皮生長因子(EGF)購于美國Sigma公司;小鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人Ki-67抗原單克隆抗體購于Cell Signaling公司;山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司;SybrGreen PCR Master Mix購于美國 ABI公司;Zeiss LSM510-META共聚焦顯微鏡購于德國蔡司公司;定量PCR儀購于瑞士羅氏公司。

    1.2方法

    1.2.1細胞培養(yǎng)及分組用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基復蘇人腎小球系膜細胞,取傳代培養(yǎng)至第3~8代細胞用于實驗,采用隨機數字表法將其分為正常對照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組。正常對照組加含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,EGF組加10 μg/L的EGF培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基),1,25(OH)2D3組加10-8mol/L的1,25(OH)2D3培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基),EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組加10 μg/L 的EGF及10-8mol/L的1,25(OH)2D3培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基),48 h后收集細胞。

    1.2.2細胞免疫熒光技術檢測Ki-67抗原表達將細胞種于蓋玻片上,置于6孔培養(yǎng)板,按照實驗分組方法培養(yǎng)細胞,取出蓋玻片,吸棄培養(yǎng)液,4%多聚甲醛固定30 min,3‰ Triton破膜20 min,封閉后加一抗,置濕盒入4 ℃冰箱過夜,加熒光二抗避光孵育1 h,除封閉外,其余各步均需用0.01 mol/L PBS洗3次,每次5 min,甘油封固,激光共聚焦顯微鏡觀察并采圖,測定熒光強度。實驗重復3次。

    1.2.3熒光定量PCR檢測Ki-67抗原表達按照實驗分組培養(yǎng)細胞,提取總RNA,反轉錄cDNA,引物序列:上游:5′-CCCCATTCACCCACCTTG-3′,下游:5′-TGATGTCACCTGGCTCCC-3′。β-actin內參基因引物序列:上游:5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′,下游:5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR參數:95 ℃變性3 min,95 ℃退火15 s,60 ℃延伸40 s,共進行40個循環(huán)。采用相對定量法計算Ki-67 mRNA相對表達量=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(待測組目的基因Ct值-待測組內參基因Ct值)-(基準組目的基因Ct值-基準組內參基因Ct值)。

    2結果

    2.1人腎小球系膜細胞形態(tài)及生長情況正常對照組細胞胞體透亮,形態(tài)呈梭形、不規(guī)則星形、樹枝狀,胞質較清楚;EGF組細胞形態(tài)與正常對照組比較無明顯改變,但細胞數目增多;1,25(OH)2D3組呈現一定程度的細胞凋亡,胞核皺縮,形態(tài)不清晰,數目較正常對照組明顯減少;EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細胞形態(tài)及生長情況、數目與正常對照組大致相同。

    2.2細胞免疫熒光技術檢測Ki-67抗原表達正常對照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細胞熒光強度分別為(35.958±2.563)、(49.872±2.745)、(22.415±2.277)和(36.567±2.270),4組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=123.429,P<0.05)。其中,EGF組熒光強度高于正常對照組,1,25(OH)2D3組熒光強度低于正常對照組(P<0.05);1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組熒光強度低于EGF組(P<0.05,見圖1)。

    2.3Ki-67 mRNA相對表達量以正常對照組為基準,EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量分別為(2.479±0.150)、(0.584±0.031)和(1.176±0.017),4組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=51.107,P<0.05)。其中,EGF組Ki-67 mRNA相對表達量高于正常對照組,1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量低于正常對照組(P<0.05);1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對表達量低于EGF組(P<0.05)。

    注:A為正常對照組,B 為EGF組,C為1,25(OH)2D3組,D為EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組

    圖1各組細胞Ki-67抗原表達的免疫熒光染色結果(×400)

    Figure 1Results of immunofluorescent staining of the expression of Ki-67 antigen of each group

    3討論

    Ki-67抗原是細胞增殖的生物標志物,存在于除有絲分裂G0期之外的細胞周期各階段,其陽性表達預示細胞增殖進入細胞周期[8]。研究發(fā)現,在乳腺癌、賁門癌患者中Ki-67抗原表達增高,而抑制Ki-67 抗原的表達可改善患者預后[8-10]。因此,Ki-67抗原的轉錄和表達水平可反映1,25(OH)2D3對細胞增殖的抑制作用。本研究結果顯示,與正常對照組比較,經1,25(OH)2D3干預的人腎小球系膜細胞細胞核Ki-67抗原及其mRNA表達降低,提示1,25(OH)2D3不僅可從蛋白水平抑制Ki-67抗原的表達,也可從核酸水平抑制Ki-67抗原的表達,從而抑制人腎小球系膜細胞的增殖。

    EGF在體內外對多種組織細胞有強烈促分裂作用。Kumar等[11]研究發(fā)現,EGF可刺激系膜細胞的增殖。本研究采用EGF誘導人腎小球系膜細胞增殖的微環(huán)境,并用1,25(OH)2D3進行干預,進一步觀察在EGF誘導系膜細胞增殖的情況下,1,25(OH)2D3是否能抑制系膜細胞的生長與增殖。結果顯示,與EGF組比較,1,25(OH)2D3聯(lián)合EGF組人腎小球系膜細胞細胞核Ki-67抗原及其mRNA表達降低,1,25(OH)2D3可以抑制EGF作用下的人腎小球系膜細胞中的Ki-67抗原的表達。

    綜上所述,1,25(OH)2D3可抑制人腎小球系膜細胞的增殖,并降低EGF對人腎小球系膜細胞增殖的促進作用。本研究為體外實驗,1,25(OH)2D3影響人腎小球系膜細胞增殖的具體機制有待進一步研究。

    參考文獻

    [1]Liu X,Lv Y,Xie Y,et al.Change of MAX interactor 1 expression in an anti-Thy1 nephritis model and its effect on mesangial cell proliferation[J].Cell Physiol Biochem,2011,27(3/4):391-400.

    [2]Yang AH,Chen JY,Chen BF.The dysregulated glomerular cell growth in Denys-Drash syndrome[J].Virchows Arch,2004,445(3):305-314.

    [3]Nam SM,Kim JW,Yoo DY,et al.Physical exercise ameliorates the reduction of neural stem cell,cell proliferation and neuroblast differentiation in senescent mice induced by D-galactose[J].BMC Neurosci,2014,15(1):116.

    [4]Takagi M,Nishiyama Y,Taguchi A,et al.Ki67 antigen contributes to the timely accumulation of protein phosphatase 1gamma on anaphase chromosomes[J].J Biol Chem,2014,289(33):22877-22887.

    [5]Panichi V,Migliori M,Taccola D,et al.Effects of 1,25(OH)2D3in experimental mesangial proliferative nephritis in rats[J].Kidney Int,2001,60(1):87-95.

    [6]Liaudat AC,Bohl LP,Tolosa de Talamoni NG,et al.Oxidative stress,cell cycle arrest and differentiation contribute toward the antiproliferative action of BSO and calcitriol on Caco-2 cells[J].Anticancer Drugs,2014,25(7):810-818.

    [7]Ramos-Martínez E,Villaseor-Cardoso MI,López-Vancell MR,et al.Effect of 1,25(OH)2D3on BALB/c mice infected with Leishmania mexicana[J].Exp Parasitol,2013,134(4):413-421.

    [8]Sundara Rajan S,Hanby AM,Horgan K,et al.The potential utility of geminin as a predictive biomarker in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2014,143(1):91-98.

    [9]董躍華,魏玉磊,王大偉,等.新輔助化療賁門癌患者Ki-67和VEGF蛋白表達與預后的影響[J].中國臨床醫(yī)生,2014(3):44-46.

    [10]Urata YN,Lyra EC,Katayama ML,et al.Calcitriol supplementation effects on Ki67 expression and transcriptional profile of breast cancer specimens from post-menopausal patients[J].Clin Nutr,2014,33(1):136-142.

    [11]Kumar D,Bhaskaran M,Alagappan L,et al.Heme oxygenase-1 modulates mesangial cell proliferation by p21 Waf1 upregulation[J].Ren Fail,2010,32(2):254-258.

    (本文編輯:吳立波)

    猜你喜歡
    胎牛系膜腎小球
    細胞貼壁效應是評價胎牛血清質量的重要因素
    白藜蘆醇改善高糖引起腎小球系膜細胞損傷的作用研究
    2021年本刊一些常用詞匯可直接用縮寫(一)
    腹腔鏡下直腸癌系膜全切除和盆腔自主神經的關系
    中西醫(yī)治療慢性腎小球腎炎80例療效探討
    Estimation of boundary-layer flow of a nanofluid past a stretching sheet: A revised model*
    胎牛血清對人內皮細胞HMEC-1體外成血管實驗影響的觀察△
    北方藥學(2016年8期)2016-08-09 02:20:45
    腎小球系膜細胞與糖尿病腎病
    多種不同指標評估腎小球濾過率價值比較
    大鼠子宮壁及子宮系膜微循環(huán)的觀察方法
    亚洲精品在线观看二区| 亚洲人成电影免费在线| 欧美激情在线99| www国产在线视频色| 亚洲五月天丁香| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲国产看品久久| av天堂在线播放| 日韩人妻高清精品专区| 日本黄大片高清| av天堂中文字幕网| 啦啦啦韩国在线观看视频| 制服人妻中文乱码| 日本黄色片子视频| 免费在线观看亚洲国产| 男插女下体视频免费在线播放| 色播亚洲综合网| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 99国产综合亚洲精品| 国产精品精品国产色婷婷| 综合色av麻豆| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产成人福利小说| 久久香蕉国产精品| 久久久国产精品麻豆| 视频区欧美日本亚洲| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 十八禁网站免费在线| avwww免费| 男女下面进入的视频免费午夜| 一级a爱片免费观看的视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产三级在线视频| 午夜a级毛片| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 亚洲黑人精品在线| 成在线人永久免费视频| 午夜福利免费观看在线| 亚洲中文av在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲 国产 在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品一区二区精品视频观看| 白带黄色成豆腐渣| 久久精品国产综合久久久| 成人欧美大片| 国产亚洲精品av在线| 免费观看精品视频网站| 国产探花在线观看一区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 成人欧美大片| 亚洲av片天天在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲无线观看免费| 超碰成人久久| av福利片在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 国产99白浆流出| 国产黄片美女视频| 国内精品美女久久久久久| 好男人电影高清在线观看| 欧美在线黄色| 欧美午夜高清在线| 88av欧美| 成年女人永久免费观看视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 99国产综合亚洲精品| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 免费在线观看影片大全网站| 老汉色∧v一级毛片| 午夜视频精品福利| 91av网一区二区| 免费看a级黄色片| 少妇人妻一区二区三区视频| 91字幕亚洲| avwww免费| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产黄色小视频在线观看| 国产成人影院久久av| 麻豆成人午夜福利视频| 久久久国产成人精品二区| 99热这里只有是精品50| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品1区2区在线观看.| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品久久久av美女十八| 国产高清视频在线观看网站| 偷拍熟女少妇极品色| 99riav亚洲国产免费| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲成av人片在线播放无| 午夜福利在线在线| 99国产综合亚洲精品| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美激情久久久久久爽电影| 深夜精品福利| xxxwww97欧美| 欧美日韩综合久久久久久 | 久久久国产成人精品二区| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜精品在线福利| 成人一区二区视频在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 日本一二三区视频观看| 中文字幕久久专区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 舔av片在线| 女人被狂操c到高潮| 日本熟妇午夜| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一进一出抽搐动态| 在线国产一区二区在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 1000部很黄的大片| 淫秽高清视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 黄色成人免费大全| 亚洲av免费在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲国产看品久久| 久久久久九九精品影院| 国产激情欧美一区二区| 午夜影院日韩av| 两个人视频免费观看高清| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 九色成人免费人妻av| 麻豆国产av国片精品| 中文字幕高清在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产一区二区三区视频了| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日本a在线网址| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 嫩草影视91久久| 免费观看人在逋| 国产精品一区二区三区四区久久| 麻豆av在线久日| 日本a在线网址| 亚洲人与动物交配视频| svipshipincom国产片| 韩国av一区二区三区四区| 国产极品精品免费视频能看的| 国产不卡一卡二| 舔av片在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品永久免费网站| 国产亚洲精品一区二区www| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久久久久久久黄片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲国产中文字幕在线视频| 成人永久免费在线观看视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 天堂√8在线中文| 性色avwww在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 在线看三级毛片| 白带黄色成豆腐渣| 哪里可以看免费的av片| 女人被狂操c到高潮| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费看日本二区| 午夜两性在线视频| 久久久久久大精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 悠悠久久av| 18禁美女被吸乳视频| 国产 一区 欧美 日韩| 成人国产一区最新在线观看| 日韩高清综合在线| 黑人操中国人逼视频| 亚洲片人在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 老司机深夜福利视频在线观看| 宅男免费午夜| x7x7x7水蜜桃| av天堂中文字幕网| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美中文综合在线视频| 午夜福利高清视频| 日韩av在线大香蕉| 亚洲 欧美一区二区三区| av国产免费在线观看| 后天国语完整版免费观看| 宅男免费午夜| 狂野欧美激情性xxxx| 精品国产亚洲在线| 国产精品av久久久久免费| 亚洲第一电影网av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 嫁个100分男人电影在线观看| 91九色精品人成在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品一区二区三区视频在线 | 日本黄色视频三级网站网址| 狠狠狠狠99中文字幕| 天堂网av新在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜福利18| 夜夜爽天天搞| 国产午夜精品论理片| 色吧在线观看| 色av中文字幕| 国产男靠女视频免费网站| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 最近最新免费中文字幕在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产三级黄色录像| 午夜成年电影在线免费观看| www.自偷自拍.com| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲自拍偷在线| 免费观看的影片在线观看| 香蕉久久夜色| 长腿黑丝高跟| 天堂影院成人在线观看| 国产三级在线视频| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 国产乱人伦免费视频| 1024香蕉在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产乱人伦免费视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜福利视频1000在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品精品国产色婷婷| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品亚洲av一区麻豆| 我的老师免费观看完整版| 免费搜索国产男女视频| 亚洲av片天天在线观看| 天堂动漫精品| 午夜久久久久精精品| 日本与韩国留学比较| 青草久久国产| 在线观看免费视频日本深夜| 两个人视频免费观看高清| 99国产精品99久久久久| 国产私拍福利视频在线观看| 国产激情久久老熟女| 日本五十路高清| 亚洲欧美日韩高清专用| 小说图片视频综合网站| а√天堂www在线а√下载| 一级毛片高清免费大全| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品永久免费网站| 精华霜和精华液先用哪个| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产视频一区二区在线看| 18禁美女被吸乳视频| 看黄色毛片网站| 岛国视频午夜一区免费看| 人妻久久中文字幕网| 成人国产一区最新在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 日本黄色视频三级网站网址| 男女视频在线观看网站免费| 岛国在线观看网站| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产成人系列免费观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 嫩草影视91久久| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品福利观看| 夜夜爽天天搞| 欧美日韩精品网址| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 精品乱码久久久久久99久播| a在线观看视频网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩精品青青久久久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品福利观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品福利观看| 长腿黑丝高跟| www国产在线视频色| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美3d第一页| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 麻豆国产97在线/欧美| 国产单亲对白刺激| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲中文字幕日韩| 久久久国产精品麻豆| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国内精品美女久久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产高清视频在线观看网站| 男女之事视频高清在线观看| 久久久精品大字幕| 此物有八面人人有两片| 国产一区二区在线观看日韩 | av天堂中文字幕网| 88av欧美| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 观看美女的网站| 国内精品久久久久精免费| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品久久视频播放| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲,欧美精品.| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产一区二区三区视频了| 免费观看人在逋| 国产高清videossex| 国产乱人视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 日韩大尺度精品在线看网址| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 怎么达到女性高潮| 婷婷精品国产亚洲av在线| 老鸭窝网址在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲美女视频黄频| 国产成人av教育| 欧美不卡视频在线免费观看| 哪里可以看免费的av片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲五月天丁香| 在线国产一区二区在线| 国产精品,欧美在线| 三级毛片av免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 黑人操中国人逼视频| 少妇丰满av| 国产成人精品久久二区二区91| 久久中文字幕一级| 啦啦啦韩国在线观看视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 国产精品 国内视频| 亚洲无线观看免费| 十八禁网站免费在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久久人人人人人| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲中文日韩欧美视频| 色吧在线观看| 国产真实乱freesex| av天堂中文字幕网| 九色成人免费人妻av| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩欧美 国产精品| 久久久久久久精品吃奶| 真人做人爱边吃奶动态| 草草在线视频免费看| x7x7x7水蜜桃| 欧美三级亚洲精品| 制服丝袜大香蕉在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产又色又爽无遮挡免费看| x7x7x7水蜜桃| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久久精品大字幕| 久久亚洲精品不卡| xxxwww97欧美| 悠悠久久av| www.www免费av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 深夜精品福利| 两个人看的免费小视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品女同一区二区软件 | 日本一二三区视频观看| 757午夜福利合集在线观看| 色综合站精品国产| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本五十路高清| 麻豆国产av国片精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产成人啪精品午夜网站| www日本黄色视频网| 99久久国产精品久久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲中文av在线| 性色avwww在线观看| 精品日产1卡2卡| 村上凉子中文字幕在线| 日本黄色片子视频| ponron亚洲| 后天国语完整版免费观看| 黄色成人免费大全| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产乱人伦免费视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲一区二区三区不卡视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 在线播放国产精品三级| 亚洲国产精品999在线| 三级毛片av免费| 999久久久精品免费观看国产| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| a级毛片a级免费在线| 天堂网av新在线| 五月伊人婷婷丁香| 精品一区二区三区四区五区乱码| 两个人的视频大全免费| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av电影在线进入| 丁香六月欧美| 波多野结衣高清作品| 99久久成人亚洲精品观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美黄色淫秽网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 99热这里只有精品一区 | 国产主播在线观看一区二区| 两人在一起打扑克的视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 免费搜索国产男女视频| 不卡av一区二区三区| 我要搜黄色片| 亚洲av片天天在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 天堂网av新在线| 日韩欧美三级三区| 级片在线观看| 午夜a级毛片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久性生活片| 亚洲专区中文字幕在线| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲av第一区精品v没综合| 91九色精品人成在线观看| 九九热线精品视视频播放| 少妇的逼水好多| а√天堂www在线а√下载| 国产视频一区二区在线看| 可以在线观看的亚洲视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99在线人妻在线中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| 成人无遮挡网站| 国产高清视频在线播放一区| 成人鲁丝片一二三区免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩欧美免费精品| 午夜两性在线视频| 久久久久性生活片| 色综合亚洲欧美另类图片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 51午夜福利影视在线观看| 曰老女人黄片| 色播亚洲综合网| 欧美激情久久久久久爽电影| 观看美女的网站| 丁香六月欧美| 一进一出好大好爽视频| 最新美女视频免费是黄的| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人aa在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 嫁个100分男人电影在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久成人免费电影| 午夜成年电影在线免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 色视频www国产| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲精品一区av在线观看| 国产激情久久老熟女| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久午夜综合久久蜜桃| 深夜精品福利| 91老司机精品| 美女大奶头视频| 国产日本99.免费观看| 亚洲电影在线观看av| 男插女下体视频免费在线播放| 国产极品精品免费视频能看的| 麻豆成人午夜福利视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 操出白浆在线播放| 全区人妻精品视频| 国产成人精品久久二区二区91| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩欧美免费精品| 不卡av一区二区三区| 欧美zozozo另类| 国产精品一区二区精品视频观看| 嫩草影院入口| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品影院久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产不卡一卡二| 亚洲第一电影网av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 淫秽高清视频在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 观看美女的网站| 国产毛片a区久久久久| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成年版毛片免费区| 久久久久九九精品影院| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲人成电影免费在线| 精品人妻1区二区| 91麻豆av在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久热在线av| 长腿黑丝高跟| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 90打野战视频偷拍视频| 99久久精品一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| 黄色视频,在线免费观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 1024手机看黄色片| 午夜免费成人在线视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一级a爱片免费观看的视频| 精品久久久久久成人av| 久久99热这里只有精品18| 久久人妻av系列| 久久精品综合一区二区三区| 国产免费男女视频| 日本 欧美在线| 精品国产亚洲在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久国产乱子伦精品免费另类| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产私拍福利视频在线观看| 日日夜夜操网爽| 我要搜黄色片| 在线观看66精品国产| 国产欧美日韩一区二区精品| av天堂在线播放| 欧美中文综合在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲av片天天在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 99久久国产精品久久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 伦理电影免费视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲无线观看免费| a级毛片在线看网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品无人区乱码1区二区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产高清videossex| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲电影在线观看av| 亚洲avbb在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产午夜福利久久久久久| 国产激情久久老熟女| 久久中文字幕人妻熟女| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲国产看品久久| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美乱妇无乱码| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美日韩东京热| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲18禁久久av| av天堂中文字幕网|