杜仲提取物中五個成分血漿蛋白結(jié)合率的測定

網(wǎng)絡出版時間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.028.html

杜仲提取物中五個成分血漿蛋白結(jié)合率的測定

曹旭1，謝玉敏1，朱迪1，陳鵬程1，鞏仔鵬1，王愛民2

(貴陽醫(yī)學院 1. 藥學院貴州省藥物制劑重點實驗室、2. 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽550004)

中國圖書分類號：R-332；R282.71；R282.1；R341；R977.6

摘要：目的測定杜仲藥材中5個成分的血漿蛋白結(jié)合率。方法采用平衡透析法測定血漿蛋白結(jié)合率，生物樣本用甲醇沉淀蛋白進行處理，以葛根素為內(nèi)標，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定血漿和緩沖溶液中的5個成分濃度。結(jié)果在所研究濃度范圍內(nèi)，京尼平苷酸、原兒茶酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷的平均蛋白結(jié)合率分別為(25.77±2.68)%、(57.54±3.79)%、(53.91±3.00)%、(24.15±4.92)%、(49.78±3.61)%。結(jié)論京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷的蛋白結(jié)合率較低，原兒茶酸、綠原酸和松脂醇單葡萄糖苷則與大鼠血漿蛋白有中等強度的結(jié)合。

關(guān)鍵詞：杜仲；京尼平苷酸；原兒茶酸；綠原酸；松脂醇二葡萄糖苷；松脂醇單葡萄糖苷；平衡透析法；液質(zhì)聯(lián)用

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.028

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0131-05

收稿日期:2014-09-24,修回日期:2014-10-29

基金項目：貴州省科技重大專項項目(黔科合重大專項字[2012]6009號)；貴州省中藥現(xiàn)代化研究開發(fā)專項(黔科合中藥字[2013]5062號，黔科合重G字[2013]4001號)；貴州省高等學校創(chuàng)新能力提升計劃(黔教合協(xié)同創(chuàng)新字[2013]04)。

作者簡介：曹旭(1991-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量控制，Tel:0851-6908468，E-mail:1406391764@qq.com;

通訊作者王愛民(1962-)，男，學士，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量控制研究，,Tel:0851-6908468，E-mail: gywam100@gmail.com

Abstract:AimTo determine the plasma protein binding rate of five components of Eucommia ulmoides extract. MethodsThe equilibrium dialysis method was used to study the plasma protein binding rate. The plasma samples were extracted by protein precipitation with methanol. With the use of puerarin as the internal standard, UPLC-MS/MS was carried out to determine the concentration of the five compounds in and out of the dialysis membrane. ResultsThe average plasma protein binding rates of five compounds on the area of the concentration which was determinate were as follows, respectively: geniposidic acid was (25.77±2.68)%, protocatechuic acid was (57.54±3.79)%, chlorogenic acid was (53.91±3.00)%, pinoresinol diglucoside was (24.15±4.92)%, and pinoresinol singleglucoside was (49.78±3.61)%. ConclusionsThe results show that the binding percentage of geniposidic acid and pinoresinol diglucoside is relatively low, but the binding rate of the others with rat plasma protein is moderate.

杜仲為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliver的干燥樹皮，又名思仙、思仲、木棉，為我國名貴滋補藥材，主要分布于四川、貴州、廣西、云南等地。杜仲具有補肝腎、強筋骨、降血壓、抗腫瘤等諸多功效[1-2]。目前研究表明，杜仲主要功效成分為環(huán)烯醚萜類、木質(zhì)素類、黃酮類、苯丙素類等，其中京尼平苷酸具有降血壓、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用，原兒茶酸具有抗氧化作用，綠原酸具有抗菌的作用，松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷則為主要降血壓成分[3-8]。藥物血漿蛋白結(jié)合率是進行藥動學研究的重要參數(shù)[9-11]，目前僅報道了松脂醇二葡萄糖苷和京尼平苷酸藥物動力學研究[12-13]，對于杜仲中多種成分血漿蛋白結(jié)合率的研究尚未見報道。本文以京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、原兒茶酸和綠原酸為檢測指標，采用平衡透析法研究其在大鼠血漿中的藥物蛋白結(jié)合率，為進一步研究杜仲的藥動學提供基礎參數(shù)。

1儀器與材料

1.1儀器超高效液相色譜ACQUITY UPLC系統(tǒng)(美國Waters公司)，配有二元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1質(zhì)譜工作站；渦旋混合器ZH-2(天津藥典標準儀器廠)；冷凍高速離心機Allegra 64R(美國Beckman Coulter 公司)；氮吹儀MTN-2800D(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；電子天平EL204(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；透析袋MD25(截留相對分子質(zhì)量 8000-14000，塞蘭博生物制品有限公司)。

1.2試劑與試藥京尼平苷酸和原兒茶酸對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號120314、110306，純度≥98%)；綠原酸對照品(北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司，批號MUST-11042802，純度≥98%)；松脂醇二葡萄糖苷對照品(上海順勃生物工程有限公司，批號201206，純度≥98%)；松脂醇單葡萄糖苷對照品(江蘇弘惠醫(yī)藥有限公司，批號070801，純度≥98%)；葛根素對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號111-090623，純度≥98%)。杜仲提取物(自制，各指標成分含量：京尼平苷酸3.5%、原兒茶酸0.17%、綠原酸0.19%、松脂醇二葡萄糖苷2.1%、松脂醇單葡萄糖苷1.0%)。乙腈、甲酸為色譜純，實驗用水為超純水，其他試劑為分析純。1.3動物健康SD大鼠，♂，體質(zhì)量為240~260 g，由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供(批號SCXK[黔]2014-0001)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)柱，流動相：0.1%甲酸乙腈(A)，0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫程序見Tab 1，流速：0.35 mL·min-1，柱溫：45 ℃，進樣器的溫度：15 ℃，進樣體積為1 μL。

Tab 1　Table of gradient elution

2.2質(zhì)譜條件采用電噴霧電離源(ESI)，毛細管電離電壓3 kV，離子源溫度120 ℃，噴霧氣與反吹氣為氮氣，去溶劑氣流速650 L·h-1，去溶劑氣溫度350 ℃，反吹氣流速為50 L·h-1，碰撞氣為氬氣，碰撞氣流速0.16 mL·min-1，掃描方式為多反應離子監(jiān)測(MRM)；負離子模式(ESI-)，用于定量的離子對(m/z)京尼平苷酸：373.2→211.0，原兒茶酸：152.9→109.0，綠原酸353.1→191.0，松脂醇二葡萄糖苷：681.3→357.2，松脂醇單葡萄糖苷：519.3→357.2；正離子模式(ESI+)，葛根素(內(nèi)標)：417.0→267.0；錐孔電壓為35V，碰撞能量分別為15、15、15、25、15、35V。

2.3溶液的配置

2.3.1標準溶液和內(nèi)標的配制精密稱取京尼平苷酸、原兒茶酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷對照品適量至10 mL容量瓶中，用甲醇定容。得京尼平苷酸(1.350 g·L-1)、原兒茶酸(0.974 g·L-1)、 綠原酸(1.000 g·L-1)、松脂醇二葡萄糖苷(1.004 g·L-1)、松脂醇單葡萄糖苷(1.010 g·L-1)的儲備液。分別精密量取京尼平苷酸等5種對照品儲備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標準溶液。精密稱取0.00500 g葛根素對照品至5 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得葛根素(1.000 g·L-1) 的儲備液。取內(nèi)標儲備液適量至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 mg·L-1的內(nèi)標溶液，置冰箱(-20 ℃)保存，備用。

2.3.2磷酸緩沖液(PBS)的配制精密稱取KH2PO40.2 g、Na2HPO42.88 g、KCl 0.2 g、NaCl 8.0 g，用適量超純水溶解，加1% NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，將溶液轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，超純水定容至刻度，儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.4樣品處理方法

2.4.1血漿樣品處理方法精密量取大鼠血漿500 μL，置于5 mL離心管中，補加甲醇50 μL，依次加入1%甲酸水200 μL，內(nèi)標溶液(20 mg·L-1)10 μL，甲醇2 mL，渦混1 min，超聲5 min，4 ℃、15 000 r·min-1離心10 min，取上清液置離心管中，氮吹儀45 ℃空氣吹干，甲醇300 μL復溶，15 000 r·min-1離心10 min后取上清液UPLC-MS/MS進樣分析。

2.4.2緩沖液樣品處理方法精密量取緩沖液1 mL，置于2 mL離心管中，補加50 μL甲醇，依次加入1%甲酸水200 μL，內(nèi)標溶液10 μL，渦混1 min，氮吹儀45 ℃空氣吹干，甲醇300 μL復溶，15 000 r·min-1離心10 min,取上清液UPLC-MS/MS進樣分析。

2.5方法學驗證

2.5.1專屬性考察分別精密量取空白血漿500 μL或空白磷酸緩沖液1 mL，除不加內(nèi)標外，其余按“2.4”項操作，獲得空白樣品色譜圖A；將一定濃度標準溶液和內(nèi)標溶液加入空白血漿或磷酸緩沖液，同上操作得色譜圖B；取平衡透析實驗血漿或緩沖液，同上操作得色譜圖C，相關(guān)色譜圖見Fig 1。京尼平苷酸、原兒茶酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷及內(nèi)標葛根素的相對保留時間分別為0.97、1.06、1.45、2.37、3.69和1.80 min，內(nèi)源性物質(zhì)對待測物的測定無干擾。

2.5.2標準曲線的制備分別取6份空白血漿或磷酸緩沖液，依次加入含有5個指標成分的混合標準溶液50 μL，配制成相應質(zhì)量濃度的標準溶液，按“2.4”項下操作。以樣品的峰面積與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標Y，樣品濃度為橫坐標X，用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/C，求得標準曲線，見Tab 2。結(jié)果表明，在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

Tab 2　Standard curves of five analytes in plasma and buffer solution

Fig 1　HPLC chromatograms of five analytes and internal standard in plasma

A: Blank plasma; B: Blank plasma spiked with reference substance and internal standard; C: Plasma samples. 1: Geniposidic acid; 2: Protocatechuic acid; 3: Chlorogenic acid; 4: Puerarin; 5: Pinoresinol diglucoside; 6: Pinoresinol singleglucoside

2.5.3準確度和精密度按“2.5.2”項下分別配制含有京尼平苷酸等5個指標成分的血漿或磷酸緩沖液低、中、高3個濃度的質(zhì)控(QC)樣品，按“2.4”項下操作，連續(xù)測定3 d，每個濃度平行5份?？疾旆椒ǖ臏蚀_度與日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果表明該方法準確、可靠、重現(xiàn)性好(Tab 3、4)。

2.5.4提取回收率按“2.5.2”項下分別配制血漿或磷酸緩沖液低、中、高3個濃度的質(zhì)控(QC)樣品，每個濃度平行5份，按“2.4”項下操作，記錄各物質(zhì)峰面積(A提取)。另取低、中、高濃度的混合標準溶液，吹干，殘留物以300 μL甲醇溶解，記錄各物質(zhì)峰面積(A)。將兩組峰面積進行比較，即A提取/A計算各物質(zhì)的提取回收率，結(jié)果見Tab 3、4。

Tab 3　Accuracy, precision and recovery of

Tab 4　Accuracy, precision and recovery of

2.5.5穩(wěn)定性考察按“2.5.2”項下分別配制血漿或磷酸緩沖液低、中、高3個濃度的質(zhì)控(QC)樣品，每個濃度平行5份，分別考察在室溫放置4 h，4℃下冷藏6 h，反復凍融3次，及處理后自動進樣器中放置24 h后的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在上述條件下的RSD均小于10%，樣品穩(wěn)定性良好。

Tab 5　Protein binding rate of five compounds in plasma of rats( n=6)

2.6血漿蛋白結(jié)合率實驗方法將透析袋剪成4 cm 左右的小段，用蒸餾水煮沸5 min，再用60 ℃蒸餾水沖洗2 min。取出少量緩沖液沖洗后，于緩沖液中浸泡，4 ℃保存?zhèn)溆谩⑻幚砗蟮耐肝龃欢苏郫B用線結(jié)扎，將1 mL空白血漿加入透析袋內(nèi)，放一粒玻璃珠以保證透析袋在緩沖液中保持垂直，透析袋內(nèi)留一小空氣泡，將透析袋另一端扎緊，使其懸浮于盛有20 mL緩沖液的廣口瓶中，膜外緩沖液中杜仲提取物濃度分別為5、10、25、50、100、200 mg·L-1，調(diào)節(jié)透析袋內(nèi)外液面，使其保持在同一水平面，并避免透析袋貼于瓶壁。將瓶口密封后，于4℃靜置72 h至藥物擴散平衡。透析結(jié)束后，用10%的高氯酸溶液檢查透析外液是否有蛋白漏出，有漏出者則該樣品作廢。分別測定透析袋內(nèi)藥物濃度Dt (總濃度)與袋外藥物濃度Df (游離藥物濃度)，根據(jù)公式計算血漿蛋白結(jié)合率：血漿蛋白結(jié)合率/%=[ (Dt-Df)/Dt]×100%，結(jié)果見Tab 5。

3討論

藥物經(jīng)吸收進入血液后，一部分與血漿中的蛋白結(jié)合，一部分呈游離的分子狀態(tài)。平衡透析法基于藥物結(jié)合的平衡原理，可測定藥物游離濃度，是研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法。

本實驗建立了使用UPLC-MS/MS測定杜仲提取物大鼠血漿蛋白結(jié)合率的實驗方法，實驗證明此方法可快速、準確地同時測定杜仲提取物中的5個指標成分。實驗中對藥液濃度、平衡時間進行了考察，在4 ℃條件下，平衡24、48、72、96 h后分別測定透析袋內(nèi)外濃度，最終選擇72 h為平衡時間。血漿蛋白結(jié)合率實驗結(jié)果提示，杜仲提取物中除京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷為低度結(jié)合(25%)外，原兒茶酸、綠原酸和松脂醇單葡萄糖3個成分為中度結(jié)合。采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，表明在所研究的濃度范圍內(nèi)，京尼平苷酸等5種成分不存在質(zhì)量濃度依賴性(P>0.05)。

參考文獻:

[1]江蘇新醫(yī)學院. 中藥大辭典(上冊)[M]. 上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1986:2090.

[1]Jiangsu new medical college. The dictionary of traditional Chinese Medicine (volume one) [M]. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1986:2090

[2]程光麗. 杜仲有效成分分析及藥理學研究進展[J]. 中成藥，2006, 28 (5):723-5.

[2]Cheng G L. Advance in studies on active constituent and their pharmacological activities of Eucommia ulmoides oliv.[J].ChinTraditPatMed, 2006, 28 (5):723-5.

[3] 李竹，晏媛，李青. 杜仲的藥理活性研究進展[J]. 中國藥事，2004, 18 (2):131-2.

[3]Li Z, Yan Y, Li Q. Advance in study on pharmacological activities of Eucommia ulmoides oliv[J].ChinPharmAff, 2004, 18 (2):131-2.

[4]趙玉英，耿權(quán)，程鐵民. 杜仲化學成分研究概況[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1995, 7(3):46-52.

[4]Zhao Y Y, Geng Q, Cheng T M. A survey of the studies on chemical constituents of Eucommia ulmoides oliv[J].NatProdResDev, 1995, 7 (3):46-52.

[5]管淑玉，蘇薇薇. 杜仲化學成分與藥理研究進展[J]. 中藥材，2003, 26 (2):124-9.

[5]Guan S Y, Su W W. Advance in studies on chemical constituents and pharmacological activities of Eucommia ulmoides oliv.[J].ChinMedMat, 2003, 26 (2):124-9.

[6]Deyama T, Nishibe S, Nakazawa Y. Constituents and pharmacological effects of Eucommia and Siberian ginseng[J].ActaPharmacolSinica, 2001, 22(12), 1057-70.

[7]Hsieh C L, Yen G C. Antioxidant actions of Du Zhong (Eucommia Umoides Oliv.) toward oxidative damage in biomolecules[J].LifeSci, 2000, 66 (15):1387-400.

[8]Luo L F, Wu W H, Zhou Y J, et al. Antihypertensive effects of Eucommia ulmoides oliv. extracts in spontaneously hypertensive rats[J].JEthnopharmacol, 2010, 129 (2):238-43.

[9]周玲，居文政，劉子修，等. 燈盞細辛注射液多成分血漿蛋白結(jié)合率測定[J]. 中國藥理學通報，2011, 27 (5):719-22.

[9]Zhou L, Ju W, Liu Z X, et al. Determination of plasma protein binding rate of multicomponent in Dengzhanxixin injection[J].ChinPharmacolBull, 2011, 27 (5):719-22.

[10]馮志強，韓堅，謝智勇，等. 黃芩提取物中黃酮類成分血漿蛋白結(jié)合率的測定[J]. 中國藥理學通報，2012, 28(2):286-9.

[10]Feng Z Q, Han J, Xie Z Y, et al. Determination of plasma protein binding rate of multicomponent in scutellaria baicalensis Georgi

[J].ChinPharmacolBull, 2012, 28 (2):286-9.

[11]黃勇，陳慧，鄭林，等. 液質(zhì)聯(lián)用超濾法測定注射用復方葒草中原兒茶酸、異葒草素及野黃芩苷的血漿蛋白結(jié)合率[J]. 中國藥學雜志，2011, 46 (15):1200-4.

[11]Huang Y, Chen H, Zheng L, et al. Determination of plasma protein binding rates of protocatechuic acid, isoorientin and scutellarin in compound Hongcao freeze-dried powder for injection by ultrafiltration combined with UPLC-ESI-MS/MS[J].ChinPharmJ, 2011, 46 (15):1200-4.

[12]Zheng X, Huang X T, Li N, et al. Determination of geniposidic acid in rat plasma by LC-MS/MS and its application toinvivopharmacokinetic studies[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci, 2012, 887-8,138-42.

[13]Wang J L, Liu E W, Zhang Y, et al. Validation of a HPLC-tandem MS/MS method for pharmacokinetics study of (+)-Pinoresinol di -β-D-glucopyranoside from Eucommia ulmoides Oliv extract in rats’ plasma[J].JEthnopharmacol, 2012, 139 (2):337-42.

Determination of plasma protein binding rate of five components

in Eucommia ulmoides extract

CAO Xu1, XIE Yu-min1, ZHU Di1, CHEN Peng-cheng1,GONG Zi-peng1, WANG Ai-min2

(1.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,SchoolofPharmacy; 2.EngineeringResearchCenterfortheDevelopment

andApplicationofEthnicMedicineandTCM(MinistryofEducation),GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China)

Key words: Eucommia ulmoides; geniposidic acid; protocatechuic acid; chlorogenic acid; pinoresinol diglucoside; pinoresinol singleglucoside； equilibrium dialysis method; UPLC-MS/MS