海參巖藻聚糖硫酸酯對巨噬細胞的調節(jié)作用及信號通路研究

網絡出版時間：2014-12-4 13:45網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.019.html

海參巖藻聚糖硫酸酯對巨噬細胞的調節(jié)作用及信號通路研究

張祺，李學敏，李兆杰，左濤，唐慶娟，常耀光，王靜鳳，薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東 青島266003)

中國圖書分類號：R282.74；R329.24；R392.11；R392.12

摘要：目的研究海參巖藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)對巨噬細胞的調節(jié)作用及相關信號通路，探究其調節(jié)機體免疫的作用機制。方法噻唑藍(MTT)比色法檢測巨噬細胞的增殖情況；中性紅法檢測吞噬活性；Griess試劑法測定培養(yǎng)上清液中NO含量；RT -PCR檢測巨噬細胞下游細胞因子IL-6、IL-10、Toll樣受體和相關信號分子MyD88、TRIF、NF-κB的mRNA表達量。 結果SC-FUC對巨噬細胞增殖、吞噬能力和NO分泌均有促進作用，在作用前期(6h和12h)效果更為明顯。SC-FUC能上調細胞因子IL-6和IL-10的mRNA表達量，上調TLR4、TLR5、TLR9的表達量，促進信號分子MyD88、TRIF和NF-κB的mRNA表達量。結論SC-FUC能夠激活巨噬細胞，促進其分泌NO、IL-6、IL-10等細胞因子，從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。SC-FUC激活巨噬細胞的信號通路與細胞表面TLR4、TLR5、TLR9及NF-κB通路相關。

關鍵詞：海參巖藻聚糖硫酸酯；巨噬細胞;NO;IL-6；IL-10；Toll樣受體

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.019

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0087-06

收稿日期:2014-09-24,修回日期:2014-10-26

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 31101281,31101302); “泰山學者”建設工程專項經費

作者簡介：張祺(1991-)，女，碩士生，研究方向：食品營養(yǎng)與分子營養(yǎng)學,E-mail：zq327science@163.com;

通訊作者唐慶娟(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)與分子營養(yǎng)學,,E-mail：tangqingjuan@ouc.edu.cn

Abstract:AimTo investigate the immunomodulatory effects of sea cucumber fucoidan (SC-FUC) on macrophage and the signaling pathways. MethodsCell viabilities in response to different concentrations of SC-FUC were analyzed by MTT, phagocytosis ability was detected by neutral red,and nitric oxide (NO) production was examined by Griess reaction kit. The mRNA expression levels of IL-6, IL-10, Toll-like receptors(TLRs)and related signal molecules MyD88, TRIF, NF-κB were assayed by real-time PCR. All the experiments were based on murine RAW264.7 cell line. ResultsSC-FUC could promote RAW264.7 cell proliferation, phagocytosis as evidenced by uptake of neutral red and release of NO. The effects were significant at the early stage (6 h and 12 h). SC-FUC could up-regulate the expression of IL-6, IL-10, TLR4, TLR5, TLR9. Moreover, mRNA expressions of TLRs signaling molecules were increased, as well as MyD88, TRIF, NF-κB. ConclusionsSC-FUC could activate macrophage, and then promote the immune function by promoting production or expression of NO, IL-6, IL-10. It is speculated to be relevant to activated cell surface receptors in macrophage, including TLR4, TLR5, TLR9, and NF-κB signaling pathways.

多糖是海參體壁的主要活性物質，主要包括海參巖藻聚糖硫酸酯(sea cucumber fucoidan，SC-FUC)和海參硫酸軟骨素(sea cucumber chondroitin sulfate，SC-CHS)兩種組分。巖藻聚糖硫酸酯是一種主要由巖藻糖及硫酸酯基團組成的多糖類物質，近年來的研究主要集中于海洋藻類，已被證實具有抗病毒、抗氧化、抗凝血、抗血栓、抗腫瘤、增強免疫力等多種生物活性[1-2]。相比之下，針對SC-FUC的活性研究較少，主要有抗腫瘤、抗凝血、解酒護肝等方面的報道[3-4]。

海地瓜屬于棘皮動物門芋海參科動物，在我國海域產量豐富、價格低廉，目前對其開發(fā)利用處于初級階段。本實驗室在前期研究中，利用自主篩選的海參巖藻聚糖硫酸酯酶(CZ1127FuCas)對海地瓜SC-FUC進行可控酶解，獲得不同分子量SC-FUC，并對其進行結構解析和活性研究。研究表明，海地瓜SC-FUC是由[→3-α-L-fuc-2,4(OSO3)-1→3-α-L-fuc-1→3-α-L-fuc-1→3-α-L-fuc-1→]n組成的重復單元[5]，分子量越小消化吸收率越高；不同分子量SC-FUC對小鼠的免疫調節(jié)作用不同，50 ku左右的SC-FUC效果最佳[5-6]。

巨噬細胞以不同形式廣泛分布在機體不同組織中，是抵抗微生物第一道防線之一。激活的巨噬細胞可以直接殺傷病原微生物，抑制多種腫瘤細胞的生長，清除凋亡細胞和突變細胞，并通過分泌NO、IL-6、IL-10、TNF-α等免疫活性分子，在先天性免疫防御和獲得性免疫應答中起著不可忽視的作用[7-8]。此外，巨噬細胞還可以作為抗原提呈細胞與T細胞相互作用啟動免疫反應。根據(jù)巨噬細胞不同功能特性及其誘導Th1或Th2型免疫應答，通常將其相應分為M1和M2兩型[9]。本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為細胞模型，以50 ku SC-FUC為受試物，檢測其對巨噬細胞增殖、吞噬功能及細胞因子分泌等細胞行為的影響，并對相關信號通路進行探討，以闡明SC-FUC的免疫調控作用機制。

1材料與方法

1.1實驗材料與儀器實驗材料：低分子量海地瓜SC-FUC由本實驗室制備，分子質量約為50 ku，純度>90%；小鼠RAW264.7巨噬細胞，購自上海細胞生物研究所；DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，上海依科賽生物制品有限公司；Dextran、噻唑藍(MTT)，美國Sigma公司；Griess試劑盒，南京建成生物工程研究所；DMSO，上海偉進生物科技有限公司；中性紅，北京百靈威科技有限公司； TRIzol regent，美國Invitrogen公司；隨機引物(B0043-9)，上海生工生物有限公司；M-MLV逆轉錄酶，美國Promega公司；dNTP，美國Frementes公司；RNA酶抑制劑，上海生工生物有限公司；FastStart Univeral SYBR Green Master(Rox)，RNase Inhibitor, 美國Roche公司。

儀器：Real-time PCR儀(iQ5型)，美國Bio-Rad公司；細胞CO2培養(yǎng)箱，美國Nuaire公司；電子顯微鏡，上海長方光學儀器有限公司；多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠巨噬細胞的培養(yǎng)小鼠巨噬細胞RAW264.7購自上海細胞生物研究所。采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，2~3 d進行一次傳代處理，用0.25% 胰酶消化細胞，取處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2MTT法檢測巨噬細胞的增殖活性調整巨噬細胞密度為1×108個·L-1，接種于96孔板中，每孔100 μL。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜使細胞貼壁。棄上清，分別加入200 μL不同濃度的50 ku SC-FUC(終濃度分別為25、50、100、200 mg·L-1)，每個濃度設6個復孔，以Dextran(200 mg·L-1)為對照組。設定不同培養(yǎng)時間(6、12、24 h)，37℃，5% CO2培養(yǎng)。吸棄細胞上清，每孔加200 μL MTT溶液(MTT ∶DMEM =1 ∶8)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL酸化異丙醇溶液，充分溶解細胞沉淀，酶標儀570 nm波長處測定吸光值。

1.2.3中性紅法檢測巨噬細胞的吞噬活性調整巨噬細胞密度為1×108個·L-1，細胞布板情況及培養(yǎng)條件同上。

設定不同培養(yǎng)時間(6、12、24 h)，37℃，5% CO2培養(yǎng)。吸棄細胞上清，每孔加100 μL 1%的中性紅溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。棄上清，每孔加入200 μL預溫的PBS，清洗細胞，重復操作3次。加入200 μL醋酸-乙醇(1 ∶1)溶解細胞，酶標儀540 nm波長處測定吸光值。

1.2.4Griess試劑法檢測巨噬細胞培養(yǎng)上清液中的NO含量調整巨噬細胞細胞密度為3×108個·L-1，細胞布板情況及培養(yǎng)條件同上。

設定不同孵育時間(6、12、24 h)，37℃，5% CO2條件培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，取細胞培養(yǎng)上清液，測定NO含量，按試劑盒說明書的步驟操作。

1.2.5Real time-PCR法檢測巨噬細胞IL-6、IL-10、Toll樣受體和信號分子MyD88、TRIF、NF-κB的mRNA表達量

1.2.5.1總RNA提取結合前幾項實驗結果，選用SC-FUC效果較為明顯的劑量及處理時間(100 mg·L-1，12 h)作用于巨噬細胞。取小鼠巨噬細胞(約0.1 g)，加入1 mL TRIzol試劑，進行勻漿處理，勻漿液轉入1.5 mL滅酶EP管，室溫放置5 min，加入0.2 mL氯仿充分混勻，室溫放置10 min以沉淀蛋白。12 000 r·min-1，離心15 min(4℃)，轉移上清液至新的滅酶EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇溶液，充分混勻，室溫放置10 min以沉淀RNA。12 000 r·min-1離心10 min(4℃)，棄上清，沉淀加入1 mL 75% 的預冷乙醇，用滅酶槍頭溫和吹打進行清洗。10 000 r·min-1離心5 min(4℃)，吸棄上清，沉淀于室溫下靜置晾干。根據(jù)沉淀產量添加適量DEPC處理水，充分溶解沉淀，即得到總RNA樣品。采用Nanodrop 2000c檢測RNA樣品純度和含量，進行核酸電泳確定RNA質量。

1.2.5.2cDNA合成取2 μg RNA樣品進行反轉錄操作。取稀釋到適宜濃度(體積小于10 μL)的RNA樣品于200 μL滅酶離心管中，加1 μg隨機引物(2 μL)，補加DEPC水至12.5 μL。70℃加熱5 min，立刻冰浴冷卻。加入1.25 μL dNTP (10 mmol·L-1)，0.625 μL RNA酶抑制劑(40 U/μL)，1 μL M-MLV逆轉錄酶(200 U/μL)，5 μL M-MLV 5×Reaction Buffer，加DEPC處理水，補充總體積為25 μL。進行30℃ 10 min， 37℃ 60 min，90℃ 5 min反應，合成cDNA。

1.2.5.3Real time-PCR反應按照FastStart Univeral SYBR Green Master說明書進行RT-PCR操作。每個反應體系中加入上、下游引物各0.75 μL，SYBR Green試劑12.5 μL，cDNA樣品2.5~5 μL，加DEPC處理水，補充總體積為25 μL。反應條件：95℃ 10 min后95℃ 15 s，60℃ 20 s，95℃ 15 s(45個循環(huán))，然后由65℃升溫至95℃(0.5℃/10 s)，檢測目的基因產物的單一性。用目的基因與相應β-actin表達量比值表示該基因的mRNA相對表達量，并以正常組為對照，表達量設為100%。基因引物采用Primer Premier 5.0軟件設計，并使用Blast程序進行驗證，由上海生工生物有限公司合成。IL-6、IL-10、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9和信號分子MyD88，TRIF，NF-κB及β-actin的特異性引物序列見Tab 1。

2結果

Tab 1　Primer sequence for IL-6，IL-10，TLRs and signaling molecules

2.1SC-FUC對巨噬細胞增殖的影響以不同濃度(25～200 mg·L-1)SC-FUC作用于巨噬細胞，采用MTT法檢測細胞的增殖情況。結果顯示：作用6 h和12 h后，SC-FUC均可促進巨噬細胞增殖，各劑量SC-FUC處理組細胞數(shù)量相比正常組均明顯的增多(P<0.01)；24 h后，SC-FUC對巨噬細胞無明顯的促增殖作用(Fig 1)。該結果表明，SC-FUC可以促進巨噬細胞的增殖，且在作用前期(6 h和12 h)效果明顯。

##P<0.01vscontrol

2.2SC-FUC對巨噬細胞吞噬能力的影響以不同濃度(25~200 mg·L-1)50 ku SC-FUC作用于巨噬細胞，通過中性紅吞噬實驗檢測細胞的吞噬能力變化。結果顯示：SC-FUC作用6 h即可明顯增強巨噬細胞的吞噬活性，3個較高劑量SC-FUC處理組吞噬中性紅的能力相比正常組均明顯升高(P<0.01)；作用12 h時，SC-FUC處理組巨噬細胞的吞噬活性仍明顯高于正常組(Fig 2)。該結果提示，SC-FUC可以有效增強巨噬細胞的吞噬能力，且在作用前期(6 h和12 h)效果明顯。

Fig 2Effects of SC-FUC on macrophage cell

#P<0.05,##P<0.01vscontrol

2.3SC-FUC對巨噬細胞分泌NO的影響NO是巨噬細胞活化的標志，是巨噬細胞吞噬病原微生物的主要效應因子。實驗結果顯示，SC-FUC作用于巨噬細胞6h即可激活巨噬細胞，NO分泌量上升，且呈現(xiàn)劑量效應，高劑量SC-FUC的效果最明顯；作用12 h和24 h后，SC-FUC處理組巨噬細胞均被明顯激活，細胞培養(yǎng)液中NO含量相比正常組均呈現(xiàn)明顯增加(P<0.01或P<0.05)(Fig 3)。上述結果提示，SC-FUC能夠有效激活巨噬細胞，增強巨噬細胞的免疫功能。

#P<0.05,##P<0.01vscontrol

2.4SC-FUC對巨噬細胞IL-6、IL-10 mRNA表達量的影響IL-6為M1型巨噬細胞分泌的炎癥因子，在機體整體和局部免疫反應中均發(fā)揮重要作用；IL-10是為M2型巨噬細胞分泌一種抗炎因子，能夠抑制炎癥因子的持續(xù)過量表達。SC-FUC作用于巨噬細胞12 h后，IL-6和IL-10的基因表達水平均明顯上升(Fig 4)。該結果提示，SC-FUC能同時誘發(fā)巨噬細胞的M1型和M2型免疫反應，促炎因子和抗炎因子之間存在相互調節(jié)作用。

Fig 4　Effects of SC-FUC on macrophage IL-6 and

#P<0.05,##P<0.01vscontrol

2.5SC-FUC對巨噬細胞Toll樣受體及其信號分子mRNA表達的影響巨噬細胞被激活后，所分泌的細胞因子主要由Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)介導，而TLRs介導的MyD88依賴途徑是細胞內激活NF-κB的主要信號通路[10]。因此，本文對TLRs介導的信號通路做了進一步探究，以探討SC-FUC引起免疫應答的分子途徑。實驗結果顯示，SC-FUC可以促進TLR4、TLR5、TLR9及信號分子MyD88、TRIF、NF-κB的表達量明顯上調(P<0.05)，而對TLR3、TLR7的表達無影響(Fig 5)。該結果提示，SC-FUC可以上調TLR4、TLR5、TLR9的表達，促進MyD88和TRIF的表達，激活NF-κB通路，進而調節(jié)巨噬細胞的免疫功能。

Fig 5　Effects of SC-FUC on macrophage TLRs and

#P<0.05vscontrol

3討論

多糖主要是通過與免疫細胞的相互作用來發(fā)揮免疫調節(jié)和抗腫瘤等功能。作用機制為通過細胞內一條或多條信號轉導通路的介導，調節(jié)免疫細胞分泌細胞因子或生物活性成分，進而產生一系列的生物學效應[11]。為了闡明SC-FUC的免疫調控作用，本文研究了其對巨噬細胞增殖、吞噬功能及細胞因子分泌等細胞行為的影響，并對相關信號通路進行了探討。

巨噬細胞是機體最重要的免疫細胞之一，在機體預防感染、自身穩(wěn)定和免疫監(jiān)視中都起著重要的作用。巨噬細胞分泌的各種免疫活性分子，如NO、 TNF-α、IL-6、IL-10等，在先天性免疫預防和獲得性免疫應答中有不可替代的作用。巨噬細胞除免疫作用外，還有吞噬作用。巨噬細胞將各類病原微生物、機體衰老死亡的細胞和腫瘤細胞等大顆粒抗原攝入胞內，最后形成吞噬溶酶體，在多種酶的作用下，殺滅和消化抗原性異物[12]。中性紅實驗結果顯示，SC-FUC高劑量組能明顯增強巨噬細胞的吞噬活性(P<0.01)，從而更有效地吞噬病原菌、保護機體免受其感染。

NO 是巨噬細胞分泌的活化巨噬細胞、吞噬病原微生物的主要效應分子，也是一種內源性血管縮張活性因子。有效分泌NO是巨噬細胞發(fā)揮免疫功能及抗腫瘤活性的基本條件。SC-FUC作用后，NO的分泌呈劑量效應(P<0.01或P<0.05)，表明SC-FUC能夠有效激活巨噬細胞，增強巨噬細胞的免疫功能。

IL-6、IL-10分別由M1型和M2型巨噬細胞所分泌，是巨噬細胞發(fā)揮免疫功能的重要細胞因子。SC-FUC能引起IL-6、IL-10表達量同時上調，表明能同時誘發(fā)巨噬細胞的M1型和M2型免疫反應，促炎因子和抗炎因子之間存在相互調節(jié)作用。

Toll樣受體是一種表達于巨噬細胞表面的跨膜蛋白，有多種類型。TLRs可以通過各自不同的配基識別相應的病原相關分子模式(PAMPs)，激活一系列的信號通路[13]。TLRs識別同源配基后能夠激活轉錄因子NF-κB，并相繼激活一系列在免疫反應和炎癥反應中發(fā)揮重要作用的炎癥因子和趨化因子[14]。外界病原菌入侵作用于細胞膜上的TLRs，并使其活化。TLRs轉導途徑主要包括MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑(即TRIF/TRAM途徑)。前者介導大部分TLRs，后者介導TLR3；TLR4比較特殊，由MyD88和TRIF途徑共同介導[15]。本研究結果提示，SC-FUC能上調TLR4，5，9的表達，募集細胞內的接頭分子MyD88和TRIF，激活NF-κB通路，進而調節(jié)巨噬細胞的功能。

本研究提示，低分子量SC-FUC能夠有效激活巨噬細胞，促進其分泌NO、IL-6、IL-10等細胞因子，從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。該研究結果為低分子量SC-FUC的開發(fā)應用提供了理論基礎，對低值海參的精深加工具有指導性意義。本文在探討海參巖藻聚糖硫酸酯調控的可能機制時，僅對通路因子的mRNA表達量進行了檢測，進一步驗證尚需對相關因子的蛋白表達量進行檢測。

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Immunomodulatory effects of sea cucumber fucoidan on

macrophage and the signaling pathways

ZHANG Qi, LI Xue-min, LI Zhao-jie, ZUO Tao, TANG Qing-juan, CHANG Yao-guang,

WANG Jing-feng, XUE Chang-hu

(CollegeofFoodScienceandEngineering,OceanUniversityofChina,QingdaoShandong266003,China)

Key words: sea cucumber fucoidan (SC-FUC); macrophage; NO; IL-6; IL-10; Toll-like receptors