氣相色譜法快速測定青貯飼料中乳酸的含量

■宋 凡 陳 英 姚焰礎(chǔ)

（重慶市畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室養(yǎng)豬科學(xué)重慶市市級重點實驗室，重慶 402460）

隨著人民生活水平提高和環(huán)境資源惡化，利用農(nóng) 副產(chǎn)品和輕工副產(chǎn)物生產(chǎn)高質(zhì)量、無污染的微生物發(fā)酵飼料已成為緩解飼料資源短缺、提高畜產(chǎn)品品質(zhì)、減少藥物殘留、降低環(huán)境污染的重要手段[1]。乳酸菌在發(fā)酵過程中起著重要作用，其在厭氧條件下迅速繁殖產(chǎn)生大量乳酸，抑制其他不良微生物的生長繁殖，從而制成優(yōu)質(zhì)的微生物發(fā)酵飼料[2]。乳酸含量和組成比例是確定青貯飼料發(fā)酵特性和評價青貯品質(zhì)的重要指標(biāo)，因此，精確測定乳酸含量是青貯飼料研究中的一項重要分析技術(shù)。目前，乳酸含量的測定方法主要有羥基聯(lián)苯比色法、EDTA定鈣法、高效液相色譜法(HPLC)、酶法等，均有各自的適用范圍和優(yōu)缺點[3-6]。HPLC法、生物傳感器法、乳酸脫氫酶法檢測的準(zhǔn)確性最好、迅速，但成本高；EDTA定鈣法檢測雖然簡便、迅速，但準(zhǔn)確性最差；羥基聯(lián)苯比色法檢測效果居中，較為準(zhǔn)確，但處理過程過于繁瑣[7]。在SN/T1511.1—2005《進出口果汁中乳酸含量檢驗方法》基礎(chǔ)上，筆者根據(jù)實際情況，摸索出一種能快速測定青貯飼料中乳酸含量的方法，操作簡單易行、峰型良好，供大家參考。

1 試驗材料

1.1 供試樣品

重慶市畜牧科學(xué)院動物營養(yǎng)研究所研制的青貯飼料。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

日本島津GC-2014C型氣相色譜儀（氫火焰離子化檢測器）、恒溫水浴鍋、20 ml具塞試管、渦旋混合儀、5 ml注射器、0.45 μm針頭式濾膜。

1.2.2 試劑

濃硫酸、甲醇、三氯甲烷、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 色譜條件

① 色譜柱：KB-FFAP（0.25 μm×0.25 mm×30 m）石英毛細管柱。

② 溫度：柱溫110℃，進樣口溫度250℃，檢測器溫度290℃。

③ 氣體流速：載氣（氮氣）總流量32.4 ml/min，氫氣40 ml/min，空氣400 ml/min，尾吹30 ml/min。

④ 進樣量：1 μl。

⑤進樣方式：分流進樣。⑥ 分流比：20.0。

2 測定方法

2.1 方法提要

青貯飼料中的乳酸，經(jīng)甲醇-濃硫酸衍生化處理，三氯甲烷萃取，而后用配有氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀測定，外標(biāo)法定量[8]。

2.2 測定步驟

2.2.1 乳酸標(biāo)準(zhǔn)品制備

稱取一定量的乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解并按需要配制成一系列不同濃度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 樣品預(yù)處理

稱取約10 g制備好的青貯飼料，精密加入100 ml純水，混勻，置于4℃冰箱內(nèi)充分浸提，用快速濾紙過濾，收集濾液備用。

2.2.3 衍生化處理

準(zhǔn)確移取系列乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品濾液各1 ml分別置于20 ml具塞試管中，加入2 ml50%硫酸水溶液及2 ml甲醇，混勻；于55℃恒溫水浴30 min。取出冷卻至室溫，加入4 ml水，混勻，再準(zhǔn)確加入2 ml三氯甲烷，充分混勻，靜置。待完全分層后，用干燥吸管吸取下層三氯甲烷溶液于5 ml注射器內(nèi)，過0.45 μm濾膜供GC分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 定性及定量分析

采用乳酸標(biāo)準(zhǔn)作保留時間定性及峰面積定量分析，采取面積外標(biāo)法可測得乳酸的實際含量。

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將系列濃度標(biāo)準(zhǔn)酸溶液衍生化后上機測定，各乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、峰面積、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表1，乳酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1、圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程見圖3。

表1 各乳酸濃度、峰面積、線性方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 乳酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖2 不同濃度乳酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖比較

圖3 乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.2 青貯飼料樣品乳酸測定

將衍生化后的青貯飼料樣品上機測定，色譜圖見圖4。

圖4 青貯飼料樣品色譜圖

3.2 方法精密度試驗

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)精密度

取乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 824 μg/ml)1 ml，按2.2.3制備測試樣6份，測定結(jié)果見表2。

3.2.2 樣品分析精密度試驗

選擇青貯飼料樣品4#，按3.2.1中方法平行制備6份樣品，測定結(jié)果及變異系數(shù)結(jié)果見表3。

由表3可見，該方法有較好的重復(fù)性與精密度。

3.3 回收率試驗

3.3.1 空白加標(biāo)回收

由表2可以得出，空白加標(biāo)回收率平均為99.5%。

3.3.2 樣品加標(biāo)回收

稱取相同的樣品2號5份，其中3份加入高、中、低三濃度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，5份同時按相同的分析步驟分析，并計算出平均加標(biāo)回收率為98.6%，結(jié)果見表4。

表2 乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定結(jié)果

表3 青貯飼料樣品乳酸測定結(jié)果

表4 樣品回收率

4 結(jié)論

在SN/T1511.1—2005《進出口果汁中乳酸含量檢驗方法》基礎(chǔ)上，建立的快速測定青貯飼料中乳酸含量的氣相色譜法，具有出峰時間短（4 min以內(nèi)）且峰型良好、樣品處理簡單、重復(fù)性與回收率較高等優(yōu)點，在青貯發(fā)酵飼料的日常監(jiān)測工作中值得推廣和利用。