中間球海膽消化酶和抗氧化酶活力的研究

■左然濤 侯受權(quán) 李 廣 常亞青

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）原產(chǎn)于日本北海道和俄羅斯遠(yuǎn)東沿海，由于其性腺色澤好、味甜，在國(guó)際市場(chǎng)廣受歡迎。1989年，由本課題組負(fù)責(zé)人參與引種將其引入中國(guó)，現(xiàn)已成為我國(guó)北方重要的海水養(yǎng)殖品種[1]。

目前，海膽?zhàn)B殖過(guò)程中餌料的主要來(lái)源為海帶、裙帶菜、石莼等大型藻類。海帶、裙帶菜的鮮活利用期主要在1～7月和12月這8個(gè)月份，而8～11月海膽?zhàn)B殖過(guò)程中幾乎沒(méi)有可利用的鮮活海帶和裙帶菜。但是，8～11月份對(duì)海膽?zhàn)B殖非常重要，因?yàn)榇杭镜拿绶N在該時(shí)期已達(dá)稚膽規(guī)格，而成年海膽也進(jìn)入育肥關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)餌料供應(yīng)不足或質(zhì)量不好將直接影響稚膽培育和親膽促熟，從而大大影響海膽的養(yǎng)殖效果。海帶和裙帶菜的干品在8～11月的高溫期易腐爛變質(zhì)，氧化變質(zhì)的蛋白和脂肪會(huì)嚴(yán)重影響稚膽的成活率，同時(shí)也會(huì)影響海膽親膽的促熟效果?？傊?，海帶和裙帶菜等生物餌料在8～11月間存在價(jià)格貴、供應(yīng)不穩(wěn)定和營(yíng)養(yǎng)不均衡等缺點(diǎn)。配合飼料因其原料來(lái)源廣泛、搭配均衡且較低的餌料系數(shù)成為海膽?zhàn)B殖獲得突破性發(fā)展的關(guān)鍵。

有關(guān)海膽配合飼料的研究已有一些報(bào)道。用配合飼料飼喂北方球海膽（Evechinus chloroticus），結(jié)果發(fā)現(xiàn)配合飼料能夠顯著改變性腺中如蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、糖原[2-3]等營(yíng)養(yǎng)成分含量。但是，攝食配合飼料的海膽其性腺的品質(zhì)較野生海膽有所降低，其中野生海膽的性腺質(zhì)地更硬且味道較甜，而攝食配合飼料和海帶的海膽性腺質(zhì)地偏軟且味道偏苦。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，甘氨酸與甜味呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸與性腺的苦味呈顯著正相關(guān)關(guān)系[3]。

目前，有關(guān)中間球海膽配合飼料的研究?jī)H有少量報(bào)道。蘇延明等(2008)[4]研究發(fā)現(xiàn)，四種營(yíng)養(yǎng)型飼料對(duì)中間球海膽稚膽的飼喂效果依次為鮑用配合飼料＞青綠飼料＞能量飼料＞蛋白飼料。但有關(guān)中間球海膽消化酶測(cè)定的研究至今未見(jiàn)報(bào)道，消化酶活力分析有助于了解海膽對(duì)不同類型飼料原料（蛋白型原料、能量型原料和青綠型原料）的消化利用潛力[5]。尤其是在開(kāi)展配合飼料開(kāi)發(fā)研究的過(guò)程中，通過(guò)測(cè)定消化酶活力可以判斷配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)正常生理指標(biāo)的影響[6]。較高的苗種成活率也是海膽?zhàn)B殖產(chǎn)業(yè)成功的關(guān)鍵，每年7～8月份的高溫季節(jié)，熱應(yīng)激導(dǎo)致海膽幼膽大規(guī)模死亡的事件時(shí)有發(fā)生[7]。抗氧化酶能夠有效清除熱應(yīng)激所產(chǎn)生的氧自由基，從而提高動(dòng)物的抗熱應(yīng)激能力，但有關(guān)中間球海膽消化酶和抗氧化酶的相關(guān)研究至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究以中間球海膽幼膽為研究對(duì)象，分析其消化道主要消化酶（蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶AMS）及抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT和總抗氧化能力T-AOC），以期為海膽幼膽人工配合飼料中主要營(yíng)養(yǎng)成分配比的確定提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)海膽幼膽來(lái)自農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，為當(dāng)年同一批孵化所得，在養(yǎng)殖過(guò)程中餌料主要為海帶、裙帶菜和石莼等大型藻類。隨機(jī)選取5只飼喂條件、規(guī)格一致的海膽，進(jìn)行編號(hào)1至5。試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)海膽進(jìn)行稱重，并測(cè)量其殼高和殼徑，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

1.2 消化酶活力的測(cè)定

在解剖盤(pán)的冰浴中解剖海膽，取腸道，-20℃保存。測(cè)定時(shí)4 ℃解凍，按重量（g）∶體積（ml）=1∶9比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，即為粗酶液。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力及總蛋白含量測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，利用Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司生產(chǎn)）進(jìn)行測(cè)定。其原理、測(cè)定方法及酶活力單位定義均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力及總蛋白含量的定義和計(jì)算公式如下。

表1 海膽幼膽的規(guī)格

胃蛋白酶活力定義：每毫克組織蛋白在37℃條件下，每分鐘分解蛋白生產(chǎn)1 μg氨基酸相當(dāng)于1個(gè)酶活力單位（1個(gè)酶活力單位=1 μg酪氨酸/min/mg組織蛋白）。

淀粉酶（AMS）單位定義：組織中每毫克蛋白在37℃條件下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位。

脂肪酶（LPS）單位定義：在37℃條件下，每克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個(gè)酶活力單位。

式中：A1——反應(yīng)開(kāi)始前的OD值；

A2——反應(yīng)10 min后的OD值；

As——標(biāo)準(zhǔn)管的OD值。

1.3 抗氧化酶活力的測(cè)定

采用一次性注射器1 ml從海膽圍口膜吸取體腔液，體腔液置于2.0 ml無(wú)菌離心管中，以12 000 r/min離心15 min，取上清液，即為體腔液樣品。樣品均置于超低溫冰箱（-80℃）中以備用。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活力和總抗氧化能力（TAOC）測(cè)定均采用南京建成生物技術(shù)公司生產(chǎn)的試劑盒，利用Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司生產(chǎn)）進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法及酶活力單位定義均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、總抗氧化能力的定義和計(jì)算公式如下：

超氧化物歧化酶活力定義：每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）。

過(guò)氧化氫酶活力定義：每毫升血清或血漿每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個(gè)活力單位。

式中：271——斜率的倒數(shù)。

總抗氧化能力（T-AOC）單位定義：在37℃條件下，每分鐘每毫升血清（漿）使反應(yīng)體系的吸光度（OD）值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 中間球海膽幼膽消化酶活力

中間球幼膽胃蛋白酶活力值為(7.72±0.92)U/mg pro,淀粉酶活力值為(1.98±0.31)U/mg pro，脂肪酶活力值為(17.71±1.37)U/mg pro，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.2 中間球海膽幼膽抗氧化酶活力

中間球海膽幼膽SOD活力值為(20.36±0.62)U/ml，AOC活力值為(2.29±0.44)U/ml，CAT活力值為(8.08±2.02)U/ml，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表2 海膽幼膽消化酶活力（U/mg pro）

表3 海膽體腔液抗氧化酶活力（U/ml）

3 討論

3.1 消化酶活力測(cè)定的意義

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，特別是隨著水產(chǎn)配合飼料工業(yè)的發(fā)展，水產(chǎn)動(dòng)物消化酶的相關(guān)研究愈加重要。了解水產(chǎn)動(dòng)物消化酶的種類、活力及調(diào)控策略可以有助于優(yōu)化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的飼料配方[8]。消化酶活力測(cè)定往往可以有效分析動(dòng)物的食性，飼料中蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的大概配比，從而為飼料中三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加提供理論依據(jù)[9]。其次，對(duì)于分泌量不足的消化酶種類可以通過(guò)外源性添加的方式進(jìn)行彌補(bǔ)，從而顯著提高飼料的消化利用率[10]。此外，通過(guò)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物消化酶種類和活力的測(cè)定可以準(zhǔn)確把握健康生理狀態(tài)下的理化指標(biāo)，在后期餌料學(xué)試驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)測(cè)定各飼料組動(dòng)物的消化酶活力來(lái)反映不同飼料的使用效果，以此作為評(píng)價(jià)飼料質(zhì)量及配方合理與否的重要依據(jù)[5]。

3.2 中間球海膽主要消化酶種類及活力分析

動(dòng)物的食性因種類不同而異，即使同一種類，在不同的環(huán)境條件下和不同的發(fā)育階段也不盡相同，其自身的消化酶組成狀況與動(dòng)物的食性密切相關(guān)。動(dòng)物的食性與消化器官組織結(jié)構(gòu)和消化機(jī)能是相適應(yīng)的，消化器官組織結(jié)構(gòu)不同，所承擔(dān)的消化機(jī)能也不同，因而消化酶的活力也呈明顯的差異[11]。通過(guò)比較肉食性、雜食性、草食性魚(yú)類的淀粉酶和脂肪酶的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉食性魚(yú)類含有較高的脂肪酶，而草食性魚(yú)類則含有較高的淀粉酶[12-13]。

中間球海膽為雜食偏植食性動(dòng)物，在自然環(huán)境中，食物組成主要以海帶、裙帶菜和石莼等大型藻類為主[14]。對(duì)石莼[15]、裙帶菜[16]、海帶[17]營(yíng)養(yǎng)成分分析后發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)、纖維素和碳水化合物相對(duì)含量高。大連海域裙帶菜營(yíng)養(yǎng)成分含量如下：粗蛋白含量15.84%、脂肪含量3.18%、多糖含量41.21%、粗纖維含量9.45%、灰分36.45%、水分30.85%[16]。消化酶活力測(cè)定結(jié)果表明，中間球海膽（殼徑均值32.42 mm）胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為(7.72±0.92)、(1.98±0.31)U/mg pro和(17.71±1.37)U/mg pro。一方面，中間球海膽消化道較高的蛋白酶和淀粉酶活力與海帶中蛋白質(zhì)和淀粉比例高有關(guān)；另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)中間球海膽具有較高的脂肪酶活力，這說(shuō)明中間球海膽具有較強(qiáng)脂肪利用能力，在養(yǎng)殖實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，促熟期間餌料中添加貽貝肉會(huì)顯著提高其性腺發(fā)育速率，與海帶相比，貽貝肉具有較高含量的脂肪，海膽對(duì)貽貝肉較高的利用能力可能與其相對(duì)較高的脂肪酶活力有關(guān)。

3.3 中間球海膽主要抗氧化酶種類及活力分析

本研究中中間球海膽幼膽體腔液中SOD活力為(20.36±0.62)U/ml，AOC活力為(2.29±0.44)U/ml，CAT活力為(8.08±2.02)U/ml。丁君等[18]研究不同種海膽體腔液中酶活力，結(jié)果顯示中間球海膽（平均殼徑37.19 mm）SOD平均活力值為113 U/mg pro，馬糞海膽（平均殼徑32.84 mm）SOD平均活力值為144 U/mg pro，紫海膽（平均殼徑32.89 mm）SOD平均活力值為182 U/mg pro，光棘球海膽（平均殼徑38.21 mm）SOD平均活力值為155.76 U/mg pro。上述結(jié)果的差異可能與所使用的酶活力單位有關(guān)，本研究中抗氧化酶活力表示為每毫升體腔液所具有的酶活力單位。此外，不同海膽規(guī)格也可能是引起二者差異的原因。

4 小結(jié)

中間球海膽幼膽消化道中胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力分別為(7.72±0.92)、(17.71±1.37)、(1.98±0.31)U/mg pro；體腔液中超氧化物歧化酶（SOD）、抗氧化力（AOC）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活力分別為(20.36±0.62)、(2.29±0.44)、(8.08±2.02)U/ml。