綠色木霉、黃孢原毛平革菌和重組畢赤酵母混和發(fā)酵玉米秸稈制備飼料的工藝研究

■劉 盼 劉新利

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250300）

我國作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，植物纖維性農(nóng)業(yè)廢棄物的含量非常高，以農(nóng)作物秸稈為例，我國農(nóng)作物秸稈的產(chǎn)量位于世界前列，2009年農(nóng)作物秸稈的產(chǎn)量為7.4億噸。農(nóng)作物秸稈分布范圍廣，數(shù)量大，并且含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和無氮浸出物等化學(xué)成分，據(jù)研究分析，每千克玉米秸稈干物質(zhì)消化能9.35 MJ，如果充分利用可以為國家節(jié)約大量的糧食，因此具有作為飼料原料的潛力，但是由于它們比較粗硬、適口性不好、營養(yǎng)價(jià)值較差、消化利用率比較低等特點(diǎn)，實(shí)際上作為飼料的植物纖維性農(nóng)業(yè)廢棄物的量很低。另外單胃動(dòng)物一般不能利用秸稈，反芻動(dòng)物對(duì)秸稈的消化率也僅有20%～30%。如果想要將植物纖維性農(nóng)業(yè)廢棄物作為一種飼料就必須對(duì)其進(jìn)行加工處理，增加其營養(yǎng)價(jià)值，提高動(dòng)物的采食量和消化率。

綠色木霉和枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生纖維素酶，黃孢原毛平革菌能夠產(chǎn)生降解木質(zhì)素的酶。重組畢赤酵母產(chǎn)生的阿魏酸酯酶為半纖維素降解酶系的組成之一，參與植物細(xì)胞壁的交聯(lián)部分的分解，可以將半纖維素之間以及半纖維素與木質(zhì)素之間的酯鍵打斷，釋放阿魏酸等酚酸類物質(zhì)，促進(jìn)半纖維素、木質(zhì)素和纖維素的分離，為纖維素的進(jìn)一步酶解提供條件。綠色木霉和黃孢原毛平革菌分別是重要的纖維素降解菌和木質(zhì)素降解菌。本文主要是利用綠色木霉、黃孢原毛平革菌和重組畢赤酵母（阿魏酸酯酶）對(duì)植物纖維性農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈進(jìn)行降解。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

玉米秸稈，來自濟(jì)南市長清區(qū)，烘干粉碎過50目篩，原材料中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為41%、25%和16%。

1.2 培養(yǎng)基

YPED培養(yǎng)基：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、水1 000 ml。

YPED固體培養(yǎng)基：配方同上，再加2%的瓊脂。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、水1 000 ml。

發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基加研磨后的玉米秸稈（過50目篩）。

1.3 方法

1.3.1 四株菌之間的拮抗作用

為了探究四株菌在玉米秸稈發(fā)酵過程中有無拮抗作用，進(jìn)行了四株菌之間的拮抗試驗(yàn)。在YPED培養(yǎng)基平板上劃四個(gè)區(qū)，分別在每個(gè)區(qū)接一株菌，30℃倒置培養(yǎng)，3 d后觀察，選擇無拮抗作用的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

小說家又說：“日本童話大師安房直子有一篇童話《狐貍的窗戶》，講述了一個(gè)小狐貍開了一家印染店的故事。如果小狐貍不狡猾，它能開成印染店嗎？”女孩似乎聽明白一些，點(diǎn)點(diǎn)頭，而富翁卻像聽傻了一般，雙眼直勾勾地盯著小說家。

1.3.2 混合菌液發(fā)酵玉米秸稈制備飼料

準(zhǔn)確稱取適量的玉米秸稈，添加相同比例的相互間無拮抗作用的綠色木霉、黃孢原毛平革菌和重組畢赤酵母的混合菌液，控制適當(dāng)溫度、pH值、固液比和培養(yǎng)時(shí)間，測定還原糖含量。

1.3.3 還原糖含量的測定

利用還原糖測定儀測定還原糖含量。

1.3.4 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測定

利用NREL法測纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 四株菌之間的拮抗

在YPED培養(yǎng)基平板上劃四個(gè)區(qū)，將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的綠色木霉、黃孢原毛平革菌、枯草芽孢桿菌和重組畢赤酵母分別接種在不同的區(qū)上，30℃倒置培養(yǎng)，3 d后觀察，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 混合菌液處理之后的玉米秸稈的紅外光譜圖

由圖1可以看出，枯草芽孢桿菌對(duì)畢赤酵母、綠色木霉和黃孢原毛平革菌有抑制作用，能看到明顯的抑菌圈，其余的三株菌之間沒有明顯的抑菌圈，可以共生長。所以本試驗(yàn)選擇綠色木霉、黃孢原毛平革菌和重組畢赤酵母作為秸稈處理的微生物菌株。

2.2 三株菌的添加順序

取90 ml PDA培養(yǎng)基和10 g玉米秸稈，115℃滅菌30 min。由于重組畢赤酵母需要甲醇的誘導(dǎo)，故將重組畢赤酵母放在最后。因此三株菌的添加順序按照兩種不同的方案進(jìn)行，第一種方案是加入10 ml綠色木霉，培養(yǎng)2 d后再加10 ml黃孢原毛平革菌，再培養(yǎng)2 d后加入10 ml重組畢赤酵母，培養(yǎng)1 d后加1 ml甲醇誘導(dǎo)。第二種方案與第一種方案相似，只是先添加黃孢原毛平革菌后添加綠色木霉。對(duì)照組加相應(yīng)的滅菌的蒸餾水。測定還原糖的含量，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 菌的添加順序?qū)€原糖產(chǎn)量的影響

由圖2可知，第一種方案比第二種方案的還原糖的含量高。測樣的第7 d產(chǎn)生的還原糖的量為8.863 mg/ml，與王巍杰等采用白腐真菌降解玉米秸稈制備飼料時(shí)在30℃、pH值8.5和固液比1∶15的條件下發(fā)酵72 h，玉米秸稈飼料中還原糖含量增加13.77%發(fā)酵相比，本試驗(yàn)還原糖產(chǎn)生量不如王巍杰等人的高，但是比先添加黃孢原毛平革菌的試驗(yàn)組的產(chǎn)還原糖量高26.9%。所以本試驗(yàn)采用第一種方案的添加順序進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 混合菌液處理秸稈的溫度優(yōu)化

混合菌按照上述第一種方案對(duì)玉米秸稈發(fā)酵處理的溫度優(yōu)化。發(fā)酵液分別在20、25、30、37、42 ℃溫度下，200 r/min搖床培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)結(jié)束后開始測樣，對(duì)照組加相應(yīng)的滅菌的蒸餾水。測定還原糖含量，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，秸稈的發(fā)酵效果最好；發(fā)酵周期大約在測樣的第9 d，還原糖的最高產(chǎn)量為12.424 mg/ml。比朱易佳用pH值4.5的稀堿預(yù)處理稻稈后再加入發(fā)酵稻稈的混合酶制劑（阿魏酸酯酶、木聚糖酶、纖維素酶）在45℃下酶解12 h，酶解產(chǎn)生的還原糖為0.06 g/g相比，還原糖產(chǎn)生率高50%。發(fā)酵后期還原糖產(chǎn)量的降低可能主要是菌株老化導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低和菌株自身新陳代謝的消耗。

2.4 混合菌液處理秸稈的pH值優(yōu)化

對(duì)混合菌液處理秸稈的pH值在4、5、6、7、8、9的范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化，30℃、200 r/min條件下，操作同菌液添加順序的第一個(gè)方案，對(duì)照組加相應(yīng)的滅菌的蒸餾水。測定還原糖的含量，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 菌的培養(yǎng)pH值對(duì)還原糖產(chǎn)量的影響

由圖4可知，隨著pH值的增加還原糖產(chǎn)量也逐漸增加，但是菌液在pH值為7時(shí)對(duì)秸稈的降解效果最好，還原糖的產(chǎn)量最高，為13.291 mg/ml。但是與Tabka等將蒸汽爆破的小麥秸稈添加0.1%（w/v）的Tween20和阿魏酸酯酶、纖維素酶、木聚糖酶，在50℃條件下共同作用，釋放了51.4%的還原糖相比，還原糖的產(chǎn)生量低，可能是因?yàn)門ween20對(duì)秸稈的酶解反應(yīng)有一定的促進(jìn)作用。

2.5 混合菌液處理秸稈的固液比優(yōu)化

對(duì)混合菌液處理秸稈的固液比在1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶15的比例下進(jìn)行優(yōu)化。30 ℃，200 r/min、pH值7.0的條件下，菌液的添加順序按照第一個(gè)方案進(jìn)行，對(duì)照組加相應(yīng)的滅菌的蒸餾水。測定還原糖的含量，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)固液比為1∶9時(shí)，混合菌液對(duì)玉米秸稈的降解效果最好，產(chǎn)生的還原糖的量最大。

圖5 菌的培養(yǎng)固液比對(duì)還原糖產(chǎn)量的影響

2.6 纖維降解率與紅外分析

最后發(fā)酵完成之后發(fā)酵液的狀態(tài)如圖6所示，由圖6可以看出，玉米秸稈處理前發(fā)酵液比較黏稠，處理后由于纖維類物質(zhì)的降解，結(jié)構(gòu)疏松，發(fā)酵液靜止1 h后能明顯看出澄清液體。最后利用NERL法測定混合菌液處理后的玉米秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為32%、22%和11%；降解率分別為21.95%、12%和31.25%。

從圖7看出，玉米秸稈經(jīng)過混合菌液協(xié)同處理之后的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在阿魏酸酯鍵、木質(zhì)素的芳環(huán)和纖維素上的碳氧雙鍵伸縮振動(dòng)的特征吸收峰的變化，它們的特征吸收峰分別為1 700 cm-1、1 600 cm-1、1 300 cm-1左右。沒有經(jīng)過混合菌液處理的玉米秸稈的阿魏酸酯鍵、木質(zhì)素和纖維素的特征吸收峰與經(jīng)過混合菌液處理之后的其相應(yīng)的特征吸收峰強(qiáng)。這說明三種菌株之間的協(xié)同處理玉米秸稈的作用比較明顯，秸稈的降解效果好。

圖6 秸稈處理前后對(duì)比（左邊處理前，右邊處理后）

圖7 混合菌液處理之后的玉米秸稈的紅外光譜

3 討論與結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)綠色木霉、黃孢原毛平革菌和畢赤酵母（重組阿魏酸酯酶）以相同比例對(duì)玉米秸稈進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，以還原糖產(chǎn)量作為考察指標(biāo)確定玉米秸稈飼料制備的最佳工藝為：玉米秸稈添加量10 g、pH值7，固液比1∶9在30℃培養(yǎng)9 d?；旌暇簩?duì)玉米秸稈的降解效果良好，能夠有效地降解玉米秸稈中的纖維素和木質(zhì)素，為今后的產(chǎn)業(yè)化提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。目前，專家學(xué)者對(duì)秸稈降解的研究多停留在液體培養(yǎng)的條件下。本試驗(yàn)以玉米秸稈作為半固體基質(zhì)，對(duì)綠色木霉、黃孢原毛平革菌和阿魏酸酯酶重組菌株畢赤酵母的混合菌液進(jìn)行半固體處理，尋找出一種有效地降解玉米秸稈的方法，為后期將玉米秸稈的飼料化提供了理論基礎(chǔ)。本次試驗(yàn)只是涉及了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)階段，對(duì)于大規(guī)模的工程培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步研究。

（參考文獻(xiàn)10篇，刊略，需者可函索）