上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌中優(yōu)良菌株的篩選和鑒定

■郭琳娜 王雁萍 袁世超 楊慧曉

（1.鄭州大學離子束生物工程省重點實驗室，河南鄭州450052；2.安圖生物工程科技股份有限公司，河南鄭州450016）

近年來，隨著我國畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展以及種植業(yè)的積極調整使得苜蓿大規(guī)模種植及產業(yè)化開發(fā)快速推廣成為可能。苜蓿自然附著戊糖片球菌、乳酸乳球菌、腸系明串珠菌、植物乳桿菌等乳酸菌，這些乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中起著重要作用。

然而，苜蓿自然附生的乳酸菌量較少，為1×101～3×105CFU/(g·FW)[1]，難以達到所需數(shù)量，加之苜?？扇苄蕴呛康?，一般在3.72%（DM）左右，無法達到發(fā)酵成優(yōu)質青貯飼料所需的最低含糖量9.5%（DM）[2]，使得苜蓿在青貯過程中需要使用添加劑來提高青貯品質。乳酸菌是綠色環(huán)保的生物添加劑，篩選高抑菌活性及產酸性能，尤其是在低可溶性糖環(huán)境中產酸能力較強的優(yōu)良乳酸菌，能夠降低青貯飼料的pH值，有利于抑制有害菌的生長，從而達到長期保存飼料營養(yǎng)物質的目的[3]。

本試驗旨在從上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌中篩選出抑菌活性較好，在低可溶性糖環(huán)境中產酸能力較強的優(yōu)良菌株，為苜蓿青貯用乳酸菌添加劑的研究和開發(fā)提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗菌株

乳酸菌菌株共67株，均為實驗室保存，分離自上海地區(qū)苜蓿的35個樣品，其品種包括巨人802、金達、王冠、CW608、ST201、德福、AB1700、WL525、豐寶、射手等。

1.2 指示菌株

沙門氏菌(Salmonella enterica)、大腸桿菌(Escherichia coli)、李斯特氏菌(Listeriosis)，為實驗室保存。

1.3 試劑及培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基，過氧化氫酶，API 50。

2 實驗方法

2.1 抑菌活性的測定

將保存于-80℃冰箱中的67株乳酸菌活化后，接種到MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，制備乳酸菌發(fā)酵上清液(12 000 r/min、4℃離心10 min)；分別挑取各種指示菌的單菌落在NA培養(yǎng)基上劃線，30℃恒溫培養(yǎng)24 h制備指示菌菌懸液，采用牛津杯雙層平板法[4]進行抑菌試驗，并對實驗結果進行統(tǒng)計分析。

2.2 產酸性能的測定

將活化的乳酸菌菌液按6%的比例接種于MRS液體培養(yǎng)基中，以不接種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照，30℃靜置培養(yǎng)。期間每隔2 h取1次樣，連續(xù)取到36 h，測定pH值。

2.3 在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中乳酸菌發(fā)酵性能的檢測方法

將篩選到的乳酸菌接種于葡萄糖含量為0.5%的液體MRS培養(yǎng)基中，以不接種乳酸菌的0.5%葡萄糖MRS液體培養(yǎng)基為對照，每12 h測定培養(yǎng)基的pH值進行統(tǒng)計分析。

2.4 乳酸菌發(fā)酵苜蓿粉性能的檢測方法

將苜蓿放置于65℃烘箱48 h烘干水分，利用粉碎機將其粉碎，制備苜蓿粉備用。將活化后的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，制備乳酸菌菌液備用。稱取苜蓿粉1 g于自封袋中，按66.7%的含水量加2 ml無菌水，并加入3 μl乳酸菌菌液，加菌處理的袋每種4份，不加菌的袋也有4份作為對照，混勻，密封，放置于30℃培養(yǎng)箱。分別于培養(yǎng)12、24、36、48 h后開封，開封后每袋樣品中加入27 ml蒸餾水，充分混勻，測定其pH值進行統(tǒng)計分析。

2.5 菌株的理化特征測定方法

①耐鹽濃度試驗:將菌株分別接種于含有3.0%和6.5%NaCl的液體MRS培養(yǎng)基(pH值6.5)中，30℃培養(yǎng)48 h，對照組培養(yǎng)基為不含NaCl的MRS液體培養(yǎng)基。

②pH值生長范圍試驗:分別將菌株接種于pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、9.0、10.0的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng) 7 d，對照組培養(yǎng)基為 pH值6.5的MRS液體培養(yǎng)基。

③溫度生長范圍試驗:將菌株接種于pH值6.5的MRS液體培養(yǎng)基，分別放置于5、15、45、50 ℃下培養(yǎng)，其中45℃ 和50℃下培養(yǎng) 7 d，5℃和 15℃下培養(yǎng)14 d，對照組設置為30℃條件下培養(yǎng)7 d。

④菌株的過氧化氫酶試驗、發(fā)酵葡萄糖產氣試驗（同型或異型發(fā)酵試驗）、碳源發(fā)酵特性等，具體方法參照龐會利（2001）[5]。

2.6 分子生物學鑒定

將菌株接種于MRS固體平板上培養(yǎng)48 h備用。PCR引物選用細菌的16S rRNA基因擴增的通用引物 ：27F(5’-AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR 反應體系為50 μl：Premix Taq25 μl，27F和1492R（均為20 μM）1 μl，補充滅菌蒸餾水至50 μl，直接將菌落加入反應體系，進行PCR反應。將菌落PCR產物測序，結果在GeneBank中使用Blast程序尋找與其最大同源性的序列。并將測序所得16S rRNA基因序列和通過Blast在GenBank中得到的標準菌株序列信息一起導入CLUSTAL W軟件進行比對。將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis NCDO 1769T作為外圍菌株，采用MEGA 5.02軟件中的鄰接法構建進化樹[6-7]。

3 結果與分析

3.1 乳酸菌的抑菌活性

在指示菌相同濃度下，67株上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌中對G+指示菌（李斯特氏菌）的抑菌率較高，而對G-指示菌（大腸桿菌和沙門氏菌）的抑菌率較低，如圖1所示。對李斯特氏菌的抑菌率達77.61%，而對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率分別為65.67%和13.70%。

圖1 上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌發(fā)酵上清液對指示菌的抑菌率

其中ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105、ZZU A106、ZZU A110和ZZU A157這7株菌對3種指示菌均有抑制作用。對李斯特氏菌抑制作用最強的是菌株ZZU A95，對大腸桿菌抑制作用最強的是菌株ZZU A104，對沙門氏菌抑制作用最強的是菌株ZZU A157，結果如表1所示。

3.2 乳酸菌的產酸性能

對上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌中具有較好抑菌作用的7株菌進行產酸性能的測定，發(fā)現(xiàn)所有菌株在0～12 h產酸速率較快，12～24 h逐漸變緩，24～36 h趨于平穩(wěn)。其中 ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105這4株菌發(fā)酵12 h內的pH值下降較快，24 h后pH 值分別達到 3.57、3.99、3.85、3.96，均降至 4.0以下。結果如圖2所示。

表1 乳酸菌的抑菌活性

圖2 分離菌株不同時間發(fā)酵上清液pH值

3.3 乳酸菌在低可溶性糖條件下的發(fā)酵特性

3.3.1 在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中的發(fā)酵性能

將具有較強抑菌作用且產酸性能較好的4株菌在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結果如表2所示。所有試驗菌株培養(yǎng)至12 h時培養(yǎng)基的pH值均降至5.0以下，其中菌株ZZU A95在培養(yǎng)至24 h時培養(yǎng)基的pH值最低，達到4.32，表明其在低糖環(huán)境中產酸性能最好。

表2 乳酸菌在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體中發(fā)酵不同時間的pH值

3.3.2 發(fā)酵苜蓿粉的性能

將具有較強抑菌作用且產酸性能較好的4株菌分別接種于苜蓿粉中進行發(fā)酵試驗，每12 h開封測定苜蓿粉的pH值。結果如表3所示，試驗組在發(fā)酵過程中苜蓿粉的pH值均低于不加菌的對照組。對照組苜蓿粉的pH值呈上升趨勢，而除菌株ZZU A101外，接種其余乳酸菌發(fā)酵48 h時苜蓿粉的pH值均下降至5.0以下。其中接種菌株ZZU A95效果最好，在發(fā)酵至48 h時苜蓿粉的pH值降至4.78。

表3 發(fā)酵不同時間苜蓿粉的pH值

3.4 優(yōu)良菌株的菌種鑒定

對具有較強抑菌活性和在低可溶性糖環(huán)境下產酸性能較好的ZZU A95菌株進行生理生化指標的測定,結果表明，ZZU A95是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶反應陰性的同型發(fā)酵球菌；能夠在pH值3.5、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0條件下生長，在pH值3.0條件下微弱生長；能夠在5～45℃溫度范圍內生長；能夠在NaCl濃度≤6.5%(W/V)的環(huán)境中生長。

碳源發(fā)酵結果如表4所示，菌株ZZU A95能夠利用的碳源較廣泛，能夠很好地利用L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、α-甲基-D-葡萄糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、D-松二糖、D-塔塔糖這21種碳源，微弱利用D-阿拉伯糖和攏牛兒糖。

表4 菌株ZZU A95的碳源發(fā)酵特性

將ZZU A95菌株的16S rRNA(約1 500 bp)序列在GeneBank中使用Blast程序進行比對，結果表明，菌株ZZU A95與多株戊糖片球菌的16S rRNA序列相似性達99%以上。將其序列使用MEGA 5.02軟件采用Neighbor-joining法構建的系統(tǒng)進化樹見圖3。

根據(jù)形態(tài)學、生理生化特性以及16S rRNA基因序列等特征將篩選的菌株ZZU A95鑒定為戊糖片球菌。

4 討論

由于苜蓿自然附生乳酸菌對其材料本身具有較好的生長適應性，因此從中篩選適合用作青貯添加劑的優(yōu)良乳酸菌方法更為有效。新鮮苜蓿的表面附著的有害菌，主要是腸桿菌目（Enterobacteriales）比例大[8]，例如大腸桿菌會引起畜禽腸道腹瀉等疾病，對牲畜的健康造成極大的影響。而青貯時乳酸菌通過厭氧呼吸將青貯飼料中的碳水化合物轉化為有機酸，使青貯環(huán)境的pH值下降，同時產生抑菌活性物質，抑制有害菌的生長，從而降低飼料在青貯過程中的營養(yǎng)消耗及腐敗風險[9]。本研究通過對G+和G-指示菌的抑菌試驗對上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌進行篩選，以期篩選在青貯過程中抑制腐敗菌生長活性較強的乳酸菌。研究發(fā)現(xiàn)，所分離的67株乳酸菌中對李斯特氏菌（G+）的抑菌率較高，其中ZZU A95的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最佳，對大腸桿菌（G-）和沙門氏菌（G-）也有較好抑制作用。

圖3 菌株ZZU A95的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹

產酸性能是篩選青貯用優(yōu)良乳酸菌的一個非常重要的指標[10]。本研究從抑菌實驗篩選出的7株乳酸菌進行產酸性能測定。其中ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105這4株菌發(fā)酵24 h后pH值均降至4.0以下。其中ZZU A95的pH值最低，達到3.57，能夠滿足快速降低環(huán)境pH值的要求。

苜蓿的可溶性糖含量較低，因此，篩選能夠在低可溶性糖環(huán)境中快速產酸的乳酸菌成為關鍵。本試驗對4株產酸性能較好的乳酸菌進行低可溶性糖條件下的發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)其均能夠在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中生長，并降低環(huán)境的的pH值，其中菌株ZZU A95效果最為明顯，并且菌株ZZU A95在發(fā)酵苜蓿粉過程中產酸較穩(wěn)定。不接種乳酸菌的對照組和接種菌株ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105的實驗組在發(fā)酵36 h時苜蓿粉樣品出現(xiàn)明顯的酸臭氣味，可能是由于這些樣品中乳酸菌產酸量不足，不能有效抑制腐敗菌的繁殖，在48 h時樣品的氣味恢復正常，可能與此階段pH值未有明顯上升有關。而接種菌株ZZU A95的苜蓿粉在發(fā)酵過程中未出現(xiàn)明顯的酸臭氣味，可能與菌株ZZU A95具有較強的抑菌活性和產酸性能有關。

苜蓿的細胞壁結構性糖（纖維素、半纖維素和木質素）含量豐富，然而不易被乳酸菌利用。而傳統(tǒng)的青貯乳酸菌基本屬于利用可溶性糖的乳酸菌，能否開發(fā)出分解植物細胞壁結構性糖的乳酸菌，促進纖維素及半纖維素的分解和利用，進而提高苜蓿青貯品質，是一個非常值得探索和深入研究的問題。本研究中，ZZU A95菌株可利用的碳源較多，包括纖維二糖和D-木糖。菌株ZZU A95是否具有降解結構性糖的相關酶基因和對結構性糖的分解能力，以及作為青貯用乳酸菌在生產中的實際應用效果，將有待進一步研究。

5 結論

從上海苜蓿附生乳酸菌中篩選的優(yōu)良乳酸菌ZZU A95屬于同型發(fā)酵兼性厭氧型乳酸菌，碳源利用較廣泛，具有較強的抑菌活性和低可溶性糖環(huán)境下較好的產酸性能，可作為青貯用乳酸菌的潛在開發(fā)菌株。