雷公藤多甙對NOD小鼠唾液腺炎及周圍神級損害的治療作用及可能機制①

陳　娟　鄭　龍　孟祥武　向詩非　袁　林　張朝貴　黃　淼　瞿昌華　李　青

(湖北民族學院風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室,恩施445000)

[摘　要]　目的：觀察雷公藤多甙對NOD小鼠的治療作用及可能機制。方法：選擇8周齡雌性非肥胖型糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠，隨機分為模型組(NOD組)及雷公藤多甙干預組(Tripterygium組)。另納入8只雌性BALB/c小鼠作為正常對照組(Control組)。Tripterygium組小鼠接受雷公藤多甙治療(0.07 mg/kg隔日腹腔注射，共12周)，其余兩組接受生理鹽水治療。觀察雷公藤對NOD小鼠唾液腺炎及周圍神經(jīng)的治療效果及機制。結(jié)果：Tripterygium組小鼠在16周齡及20周齡唾液流率均顯著低于Control組(P<0.05)；但均顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺Aquaporins-1及Aquaporins-5的表達均顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺內(nèi)炎癥細胞凋亡比例顯著高于對照組及NOD組小鼠，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著高于Control組小鼠，但顯著低于NOD組小鼠，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺SHIP-1表達顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)，Mir-155表達顯著低于NOD組小鼠(P<0.05)。干預結(jié)束時Tripterygium組小鼠神經(jīng)傳導潛伏期及神經(jīng)傳導速度兩項指標均顯著優(yōu)于NOD組小鼠(P<0.05)。結(jié)論：雷公藤多甙可顯著改善NOD小鼠的唾液腺功能及周圍神經(jīng)功能，可能是通過激活SHIP-1/Mir-155信號通路而改善了局部的炎癥反應。

[關(guān)鍵詞]　原發(fā)性干燥綜合征；雷公藤多甙；自身免疫性疾病；炎癥因子；凋亡

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.018

雷公藤多甙對NOD小鼠唾液腺炎及周圍神級損害的治療作用及可能機制①

陳娟鄭龍②③孟祥武②向詩非②袁林②張朝貴②黃淼②瞿昌華②李青②

(湖北民族學院風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室,恩施445000)

[摘要]目的：觀察雷公藤多甙對NOD小鼠的治療作用及可能機制。方法：選擇8周齡雌性非肥胖型糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠，隨機分為模型組(NOD組)及雷公藤多甙干預組(Tripterygium組)。另納入8只雌性BALB/c小鼠作為正常對照組(Control組)。Tripterygium組小鼠接受雷公藤多甙治療(0.07 mg/kg隔日腹腔注射，共12周)，其余兩組接受生理鹽水治療。觀察雷公藤對NOD小鼠唾液腺炎及周圍神經(jīng)的治療效果及機制。結(jié)果：Tripterygium組小鼠在16周齡及20周齡唾液流率均顯著低于Control組(P<0.05)；但均顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺Aquaporins-1及Aquaporins-5的表達均顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺內(nèi)炎癥細胞凋亡比例顯著高于對照組及NOD組小鼠，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著高于Control組小鼠，但顯著低于NOD組小鼠，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺SHIP-1表達顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)，Mir-155表達顯著低于NOD組小鼠(P<0.05)。干預結(jié)束時Tripterygium組小鼠神經(jīng)傳導潛伏期及神經(jīng)傳導速度兩項指標均顯著優(yōu)于NOD組小鼠(P<0.05)。結(jié)論：雷公藤多甙可顯著改善NOD小鼠的唾液腺功能及周圍神經(jīng)功能，可能是通過激活SHIP-1/Mir-155信號通路而改善了局部的炎癥反應。

[關(guān)鍵詞]原發(fā)性干燥綜合征；雷公藤多甙；自身免疫性疾?。谎装Y因子；凋亡

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.018

中圖分類號①本文為風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室第一批開放基金項目(No.OIR13017B)。;②湖北民族學院附屬民大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,恩施445000。

通訊作者③，E-mail:404649594@qq.com。

作者簡介：陳娟(1977年-)，女，在讀博士，副主任醫(yī)師，主要從事周圍神經(jīng)疾病方面的研究，同時供職于湖北民族學院附屬民大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，E-mail:chen1juan2@163.com。

[Abstract]Objective:To analyze the curative effect of tripterygium on NOD mice and the possible mechanisms.Methods: NOD mice were divided into 2 groups,Group A:tripterygium treatment(0.07 mg/kg,intraperitoneal injection,12 weeks);Group B:saline control.BALB/c mice were enrolled as control group(Group C).Results: After experiment,Group A had lower salivary flow rate than these of Group C,but higher than these of Group B at 12 and 20 weeks old(P<0.05).Group A had higher rate of inflammatory cells apoptosis than these of Group B and Group C(P<0.05).Group A mice had lower levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β than these of Group B(P<0.05),but higher than these of Group C(P<0.05).Group A mice had a higher level of SHIP-1 but a lower level of Mir-155 than these of Group B mice(P<0.05).Group A mice had a better neuroelectrophysiological outcomes than these of Group B mice(P<0.05).Conclusion: Tripterygium can meliorate the sailoadentitis of NOD mice,which may though activating the SHIP-1/Mir-155 signaling pathway.

Analysis of curative effect of tripterygium on NOD mice and possible mechanisms

CHENJuan，ZHENLong，MENGXiang-Wu，XIANGShi-Fei，YUANLin，ZHANGChao-Gui，HUANGMiao，QUChang-Hua，LIQing.HubeiProvinceKeyLaboratoryofOccurrenceandInterventionofRheumaticDisease，Enshi445000，China

[Key words]Primary sjogren′s syndrome;Tripterygium;Autoimmune disease;Inflammatory factor；Apoptosis

原發(fā)性干燥綜合征(Primary sjogren′s syndrome，PSS)是一種自身免疫性疾病，可累及多組外分泌腺，病理改變主要為外分泌腺的慢性非特異性炎癥[1]。PSS患者常因淚腺、唾液腺等功能受損而表現(xiàn)為眼睛干澀、眼炎、口干等癥狀。除此之外，該病還可累及神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等全身多個系統(tǒng)和器官，因而也是一種全身性、系統(tǒng)性疾病。PSS的發(fā)病機制至今尚不清楚，也無根治手段。但目前的研究認為PSS的發(fā)生與外分泌腺過度的免疫/炎癥反應有關(guān)，自身促炎因子的過度釋放是導致腺體破壞的主要因素[2]。雷公藤多甙(Triptery-gium)是雷公藤的提取物，其被證實具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)等重要功能。該藥物對慢性腎炎、克羅恩病等自身免疫性疾病均有一定療效，但尚未有應用于PSS治療的報道[3,4]。非肥胖型糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠是一種國內(nèi)外公認的PSS模型小鼠[5,6]。本研究嘗試采用雷公藤多甙治療干預NOD小鼠，觀察療效并進一步分析療效機制，以期為該病的治療發(fā)掘新的治療藥物。

1材料與方法

1.1分組及飼養(yǎng)選擇8周齡雌性NOD小鼠16只[平均體重為(21.2±1.1)g]，隨機分為模型組(NOD組)及雷公藤多甙干預組(Tripterygium組)。另納入8只雌性BALB/c小鼠[平均體重為(21.3±1.3)g]作為正常對照組(Control組)。所有小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)環(huán)境下；飼養(yǎng)室內(nèi)避免噪聲刺激及強光；維持飼養(yǎng)室氣溫在20～24℃；所有小鼠自由飲水和進食。

1.2干預治療Tripterygium組小鼠接受雷公藤多甙治療干預，具體為：雷公藤多甙(Sigma-Aldrich，USA)溶于生理鹽水，配置成0.003 5 mg/ml；隔日腹腔注射一次(0.07 mg/kg)，共治療12周。NOD組及Control組腹腔注射相同劑量的生理鹽水。干預結(jié)束后，斷頸處死小鼠，取唾液腺標本保存(福爾馬林固定、-80℃凍存)。

1.3觀察指標比較各組小鼠8周齡(干預前)、16周齡及20周齡時唾液流率。唾液流率檢測簡述如下：肌肉注射0.01 mg毛果蕓香堿，15 min后將小鼠頭部向下，將毛細導管置于小鼠口低收集唾液10 min，計算唾液流率(μl/min),換算為100 g小鼠每分鐘唾液流率[μl/(min·100 g)]。

Western blot法檢測各組小鼠唾液腺水通道蛋白-1(Aquaporins-1)、水通道蛋白-5(Aquaporins-5)、含SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇5磷酸酶-1(Src homology 2-containing inositol phosphatase-1，SHIP-1)的表達。免疫熒光法檢測各組小鼠唾液腺SHIP-1表達。Western blot方法參照文獻[7]，提取組織蛋白后采用Bradford法定量蛋白，置入沸水中加熱變性(1∶4；10 min)，每孔加35 μg蛋白后電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入Aquaporins-1、Aquaporins-5、SHIP-1及β-actin(1∶1 000，Abcam公司)一抗稀釋液，搖床(4℃；12小時)，然后加入二抗，洗膜后滴加ECL顯影液，采用Image J軟件(USA)進行灰度值分析。

唾液腺炎癥因子評估：將唾液腺組織勻漿，采用ELISA法檢測IL-6、IL-10、TNF-α及IL-1β，試劑盒購置于Santacruz公司(USA)。

周圍神經(jīng)電生理分析：干預結(jié)束后暴露并游離小鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)，使用0、5 mm直徑的金屬針刺激坐骨神經(jīng)近端，采用自動肌電圖分析儀(OXFORD公司，英國)記錄神經(jīng)傳導速度及傳導潛伏期。

唾液腺炎癥細胞凋亡評估：采用TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)法檢測唾液腺細胞凋亡情況(試劑盒購置于Santa Cruz,USA)。

RT-PCR法檢測各組小鼠唾液腺Mir-155的表達，Mir-155的序列為：5-GTAACCCGTTGAACCCCA-TT及5-CCATCCAATCGGTAGTAGCG。

1.4統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析基于SPSS18.0軟件平臺(USA)。計量資料以±s表示，計量資料的比較采用t檢驗。率的比較采用χ2檢驗。P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1雷公藤多甙治療對NOD小鼠唾液流率的影響各組小鼠唾液流率的變化見表1。Control組小鼠隨著年齡的增大，其唾液流率并無顯著改變；NOD組小鼠隨著年齡的增大，唾液流率呈現(xiàn)下降趨勢；Tripterygium組小鼠在整個觀察周期內(nèi)唾液流率無顯著改變。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷公藤多甙治療后，Tripterygium組小鼠在16周齡及20周齡唾液流率均顯著低于Control組(P<0.05)；但均顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)。

2.2雷公藤多甙治療對NOD小鼠唾液腺水通道蛋白表達的影響各組小鼠唾液腺水通道蛋白的表達見圖1。Tripterygium組小鼠唾液腺Aquaporins-1及Aquaporins-5的表達均顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)，與對照組相比差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3雷公藤多甙治療對NOD小鼠唾液腺炎癥細胞凋亡的影響3組小鼠唾液腺炎癥細胞凋亡情況見圖2。Tripterygium組小鼠唾液腺內(nèi)炎癥細胞凋亡比例顯著高于對照組及NOD組小鼠，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1　各組小鼠唾液流率變化的比較[μl/(min·100 g)]Tab.1　Saliva flow rate changes in each group[μl/(min·100 g)]

Note：Compared with control group，1)P<0.05;compared with NOD group，2)P<0.05.

2.4雷公藤多甙治療對NOD小鼠唾液腺炎癥因子表達的影響各組小鼠唾液腺炎癥因子水平的表達見圖3。3組小鼠唾液腺IL-10水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Tripterygium組小鼠唾液腺TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著高于Control組小鼠，但顯著低于NOD組小鼠，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1　各組小鼠唾液腺水通道蛋白的表達Fig.1　Expression of Aquaporins in salivary glands for each groupsNote: *.P<0.05.

2.5雷公藤多甙治療對NOD小鼠唾液腺Mir-155/SHIP-1信號通路的影響 免疫熒光染色(圖4A)及Western blot半定量分析(圖4B)顯示Tripterygium組小鼠唾液腺SHIP-1表達顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)，與Control組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PCR分析顯示，Tripterygium組小鼠唾液腺Mir-155表達顯著低于NOD組小鼠(P<0.05)，與Control組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2　三組小鼠唾液腺炎癥細胞凋亡情況Fig.2　Inflammatory cells apoptosis in salivary glands for three groupsNote: The red sign indicated apoptotic cells;*.P<0.05.

圖3　各組小鼠唾液腺炎癥因子水平的表達Fig.3　Levels of inflammatory cytokine in salivary glands for each groupsNote: *.P<0.05.

圖4　雷公藤多甙治療對NOD小鼠唾液腺Mir-155/SHIP-1信號通路的影響Fig.4　Impact of tripterygium on Mir-155/SHIP-1 signal pathway for NOD miceNote：*.P<0.05.

表2　雷公藤多甙治療對NOD小鼠周圍神經(jīng)電生理恢復率的影響Tab.2　Impact of tripterygium on peripheral nerve electrophysiology for NOD mice

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with NOD group,2)P<0.05.

2.6雷公藤多甙治療對NOD小鼠周圍神經(jīng)的神經(jīng)電生理的影響如表2所示，干預結(jié)束時Tripterygium組小鼠神經(jīng)傳導潛伏期顯著低于NOD組(P<0.05)，但仍高于Control組(P<0.05)；神經(jīng)傳導速度顯著高于NOD組小鼠(P<0.05)，但仍顯著小于Control組小鼠(P<0.05)。

3討論

原發(fā)性干燥綜合征是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病。隨著環(huán)境污染、西方化的生活飲食方式等影響，該病的患者數(shù)量有上升趨勢[2]。該病不僅可導致患者口、炎干燥等臨床表現(xiàn)外，尚可引發(fā)胃腸道、呼吸系統(tǒng)的并存癥狀。由于缺乏確切的發(fā)病機制，臨床上尚無根治手段。在發(fā)作期給予糖皮質(zhì)激素或免疫調(diào)節(jié)劑等治療可有一定療效，但部分患者療效較差。臨床上需要開發(fā)新的、更為有效的治療藥物。雷公藤多甙是較早被應用于臨床的中藥提純物，其在慢性腎小球腎炎的誘導或維持緩解治療中有一定療效，同時也被證實對克羅恩病等自身免疫性疾病有效[4,8]?；A(chǔ)研究表明雷公藤多甙具有抑制終末炎癥因子表達、抑制Th1細胞免疫應答等免疫調(diào)節(jié)作用[6,9]。除此之外雷公藤多甙還可調(diào)節(jié)ERK1/2-NF-κB及JAK/STAT等信號通路而發(fā)揮抗炎作用[10]。雖然PSS的發(fā)病機制尚不明確，但組織病理學研究顯示外分泌腺多度表達的促炎因子及亢進的免疫反應是導致腺體結(jié)構(gòu)/功能受損的主要原因之一[11]。鑒于雷公藤多甙的藥效機制和PSS的腺體功能破壞機制，我們嘗試在PSS動物模型(NOD)上探索雷公藤是否具有應用于PSS治療的潛在價值。

由于唾液腺是PSS主要病變器官之一，我們首先分析雷公藤對NOD小鼠唾液流率的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)雷公藤治療后，Tripterygium組小鼠唾液流率顯著改善，明顯優(yōu)于未經(jīng)治療的NOD組小鼠。水通道蛋白是調(diào)節(jié)唾液腺分泌的重要蛋白[12]，鑒于雷公藤多甙對NOD小鼠唾液分泌的改善作用，我們進一步分析了各組小鼠唾液腺的水通道蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙治療顯著增加了Tripterygium組小鼠唾液腺水通道蛋白1及5的表達，這可能是雷公藤多甙改善NOD小鼠唾液腺功能的途徑之一。

周圍神經(jīng)病變是原發(fā)性干燥綜合征的另一病損，鑒于雷公藤多甙對NOD小鼠唾液腺炎的治療作用，我們初步分析了其對NOD小鼠周圍神經(jīng)的神經(jīng)電生理的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤治療顯著改善了NOD小鼠神經(jīng)電生理指標。但具體機制尚需進一步研究以明確。

為明確雷公藤多甙的療效機制，我們進行了以下探索。凋亡染色研究發(fā)現(xiàn)，Tripterygium組小鼠唾液腺內(nèi)炎癥細胞凋亡比例顯著升高。這提示雷公藤多甙具有誘導腺體內(nèi)炎癥細胞凋亡的作用，這一研究結(jié)果與Kwon等近期研究結(jié)果相一致[13]。外分泌腺促炎因子水平升高，可能是破壞腺體功能的主要原因之一。我們進一步分析了雷公藤多甙對NOD小鼠唾液腺炎癥因子水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙治療顯著降低了唾液腺TNF-α、IL-6及IL-1β的水平。而TNF-α、IL-6及IL-1β均與SHIP-1/Mir-155信號通路相關(guān)。我們進一步分析發(fā)現(xiàn)，Tripterygium組小鼠唾液腺SHIP-1蛋白水平顯著升高，而Mir-155水平顯著下降。SHIP-1表達升高可抑制Mir-155水平，而Mir-155可促進TNF-α、IL-6等促炎因子的表達[14,15]。因此，這些研究結(jié)果提示雷公藤多甙可能通過激活SHIP-1/Mir-155信號通路而發(fā)揮了抗炎作用。

綜上，研究顯示雷公藤多甙可顯著改善NOD小鼠的唾液腺功能，可能是通過激活SHIP-1/Mir-155信號通路而改善了唾液腺的炎癥反應，從而減輕了周圍神經(jīng)損害。

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[收稿2015-05-20修回2015-07-20]

(編輯許四平)