豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備及免疫效果的研究①

關(guān)建義　毛會麗　賀文旭　楊利敏　符運棟　張敬梅　吳佳靜　寧黔冀

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007)

[摘　要]　目的：選取毒力因子多、毒性強的嗜水氣單胞菌株(Aeromonas hydrophil)制成滅活疫苗，研究疫苗的免疫保護效果。方法：采用甲醛滅活制備疫苗，對銀鯽進行腹腔注射，設(shè)立免疫組和對照組，然后進行血清抗體效價檢測、病理切片分析和攻毒保護試驗。結(jié)果：銀鯽在經(jīng)注射免疫后，各免疫時間均有抗體產(chǎn)生，抗體效價在第6周檢測時達到高峰，而對照組在整個試驗過程中均沒有檢測到抗體；病理切片也表明，該疫苗能夠?qū)a魚靶器官產(chǎn)生很好的保護作用；攻毒保護試驗中，免疫組的免疫保護率達100%，且免疫保護期長達6個月以上。結(jié)論：嗜水氣單胞菌滅活疫苗對銀鯽有顯著的免疫保護效應(yīng)，可作為預(yù)防細菌性敗血癥感染的疫苗。

[關(guān)鍵詞]　嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophil)；疫苗；抗體效價；病理切片；免疫保護率

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.013

豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備及免疫效果的研究①

關(guān)建義毛會麗②賀文旭②楊利敏②符運棟②張敬梅②吳佳靜②寧黔冀

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007)

[摘要]目的：選取毒力因子多、毒性強的嗜水氣單胞菌株(Aeromonas hydrophil)制成滅活疫苗，研究疫苗的免疫保護效果。方法：采用甲醛滅活制備疫苗，對銀鯽進行腹腔注射，設(shè)立免疫組和對照組，然后進行血清抗體效價檢測、病理切片分析和攻毒保護試驗。結(jié)果：銀鯽在經(jīng)注射免疫后，各免疫時間均有抗體產(chǎn)生，抗體效價在第6周檢測時達到高峰，而對照組在整個試驗過程中均沒有檢測到抗體；病理切片也表明，該疫苗能夠?qū)a魚靶器官產(chǎn)生很好的保護作用；攻毒保護試驗中，免疫組的免疫保護率達100%，且免疫保護期長達6個月以上。結(jié)論：嗜水氣單胞菌滅活疫苗對銀鯽有顯著的免疫保護效應(yīng)，可作為預(yù)防細菌性敗血癥感染的疫苗。

[關(guān)鍵詞]嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophil)；疫苗；抗體效價；病理切片；免疫保護率

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.013

中圖分類號①本文為河南省基礎(chǔ)與前言技術(shù)研究項目(142300410021)、河南省科技廳科技攻關(guān)(132102310165)、河南省教育廳科技攻關(guān)資助項目(2011A240001)和2013年國家大學(xué)生創(chuàng)新課題(201310472007)。;②新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,新鄉(xiāng)453003。

作者簡介：關(guān)建義(1969年-)，男，副教授，主要從事魚類病害研究，同時就職于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，E-mail:jianyiguan@163.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：寧黔冀(1964年-)，女，博士，教授，主要從事動物生長及細胞免疫學(xué)方面的研究，E-mail:ningqianji1964@163.com。

[Abstract]Objective:Selected virulence factors more than and high virulent Aeromonas hydrophia strain made into inactivated vaccine,to study the immunization effect of inactivated vaccine.Methods: Crucian were vaccinated with formalin-killed vaccine via intraperitoneal injection.Controls were injected with the same volumes of saline.Then the antibody titres,histopathology and relative percent survival were analyzed from samples of both groups.Results: The antibody in the indirect agglutination reaction could be detected in vaccinated fish once a weeks after immunization and reached highest level 6 weeks after immunization.The histopathology analysis indicated that the vaccine had a good protective effect on crucian target organs.Vaccinated fish showed 100% relative percent survival and the immune period would be 6 month.Conclusion: The vaccine in this study has a significant protective effect on crucian and may be used as effective fish vaccines against bacterial septicemia.

Preparation of a deactivation vaccine against Aeromonas hydrophila and research about its immue effect in the north of Henan

GUANJian-Yi,MAOHui-Li,HEWen-Xu,YANGLi-Min,FUYun-Dong,ZHANGJing-Mei,WUJia-Jing,NINGQian-Ji.CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,China

[Key words]Aeromonas hydrophia;Vaccine;Antibody titers;Tissue slices;Immunization protection rate

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) 廣泛存在于淡水、土壤、污水、淤泥和糞便中，包括有致病性菌株和非致病性菌株兩類[1]，致病性菌株感染譜十分廣泛，可引起鱉、蝦、蟹、蛙、鴨、貂等[2,3]的爆發(fā)感染，是引起水產(chǎn)生物病害的重要病原體[4-7]，人類感染此菌可引起軟組織損傷和食物中毒[8]，是一種典型人-獸-魚共患病病原[9-11]。防治嗜水氣單胞菌的方法主要包括抗生素防治和疫苗防治2種方法?？股氐膹V泛使用和濫用，加上監(jiān)管措施不嚴，導(dǎo)致嗜水氣單胞菌產(chǎn)生了耐藥性甚至多重耐藥性[12]。目前，研究嗜水氣單胞菌全菌滅活疫苗對控制嗜水氣單胞菌感染魚類具有重要意義，全菌滅活疫苗是指利用某種方式滅活烈性野生病原菌的感染性，但保留其免疫原性而制備的疫苗[13-15]。

本研究從新鄉(xiāng)地區(qū)自然患細菌性敗血癥的病例中分離出強毒株，制成全菌滅活疫苗，檢查其安全性后，以腹腔注射方式進行接種免疫，觀察對銀鯽的免疫保護情況，旨在為全菌滅活疫苗在本地區(qū)魚病防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料試驗菌株：嗜水氣單胞菌菌株，自新鄉(xiāng)市患細菌性敗血病的病魚體內(nèi)分離，本實驗室分離、保存。

試驗動物：健康銀鯽購自新鄉(xiāng)市郊某漁場，每條魚質(zhì)量約為(30±2)g，長度為12～15 cm。使用前先于實驗室馴養(yǎng)1周，充氣，控制水溫28℃左右，定期清污換水、喂食。

實驗儀器： 恒溫震蕩培養(yǎng)箱(設(shè)備編號ZHWY-2102)；TG-16型微量高速離心機； 水族箱；冰凍切片機(德國產(chǎn))； NikonE400型顯微鏡。

1.2實驗方法

1.2.1疫苗菌株的篩選實驗室保存的菌株活化后，接種于營養(yǎng)肉湯28℃搖床培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)物利用血小球計數(shù)板計數(shù)，每株菌的試驗組分5組，每組10尾魚，將菌液以10-1、10-2、10-3、10-4倍比稀釋，每稀釋度菌液腹腔注射銀鯽，每尾注射0.2 ml,同時設(shè)生理鹽水對照。實驗魚養(yǎng)于已消過毒的水族箱里，自來水已曝氣24 h，充氣，控制水溫28℃左右，定期清污換水、投喂食物。每天記錄每組魚的死亡情況，參考Reed-Muench法計算半數(shù)致死濃度(LD50)，選出LD50最低的菌株為疫苗菌株。

1.2.2全菌滅活疫苗的制備將疫苗菌株接種于營養(yǎng)肉湯28℃搖床培養(yǎng)16 h后，10 000 r/min離心20 min，收集菌體，加入磷酸緩沖液(PBS)至細菌濃度為1×108cfu/ml，然后加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，28℃搖床培養(yǎng)24 h，制得嗜水氣單胞菌的滅活疫苗。

1.2.3疫苗無菌檢測與安全性試驗取上述制備的疫苗涂布平板，28℃培養(yǎng)48 h，觀察有無菌落出現(xiàn)。取上述制備的疫苗腹腔注射銀鯽30尾，每尾注射0.2 ml，觀察試驗銀鯽的反應(yīng)和死亡情況。

1.2.4銀鯽的免疫接種試驗組和對照組各80尾銀鯽，試驗組腹腔注射全菌滅活溶液，每尾注射0.2 ml；對照組腹腔注射等量的生理鹽水。每天充氣，投喂食物，水溫控制在28℃左右。

1.2.5血清抗體動態(tài)檢測銀鯽免疫后，每周從各組魚中隨機取5尾，注射器尾動脈/靜脈取血，血液收集于離心管，使其4℃下自然沉降，分離血清，檢測到免疫后第6個月。96孔板每孔加入生理鹽水50 μl后,分別加入2倍比稀釋免疫魚血清和對照魚血清，然后加入滅活的嗜水氣單胞菌菌液作為抗原，培養(yǎng)板于28℃恒溫箱1 h，再放入4℃冰箱過夜后判定結(jié)果。

1.2.6病理切片分析銀鯽免疫21 d后，隨機挑取試驗組和對照組的魚，以50LD50嗜水氣單胞菌攻擊，12 h后解剖取其肝臟、脾臟、腎臟以及腸道組織固定，包埋，經(jīng)冰凍切片機切片，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封存后，于光學(xué)顯微鏡下觀察并對比試驗組與對照組中魚各組織器官的變化。

1.2.7攻毒保護試驗在首次免疫21 d后，每組隨機挑取30尾魚，以50LD50嗜水氣單胞菌攻擊，同樣采取腹腔注射的方式，同樣環(huán)境下培養(yǎng)10 d，每天觀察并記錄各組死亡數(shù)，根據(jù)公式計算魚的免疫保護率：免疫保護(%)=(對照組魚種死亡率-實驗組魚種死亡率)/對照組魚種死亡率×100%。

1.2.8免疫保護期的測定在首次免疫6個月后，每組隨機挑取30尾魚，仍以50LD50嗜水氣單胞菌攻擊，同樣環(huán)境下培養(yǎng)10 d，每天觀察并記錄各組死亡數(shù)，根據(jù)公式計算魚的免疫保護率。

2結(jié)果

2.1疫苗菌株的篩選試驗試驗菌株活化后，進行了半致死濃度LD50的測定。根據(jù)攻毒試驗中，每組銀鯽的死亡情況，并結(jié)合各菌株毒力因子的特點，篩選出了毒力因子多、毒性強的菌株作為疫苗制備備用菌株：XDMC(1)，其LD50為1.5×105cfu/ml。

2.2疫苗無菌檢測和安全性試驗試驗用滅活疫苗涂布平板培養(yǎng)48 h后，無菌落出現(xiàn)，證明疫苗滅活完全。動物安全實驗中，疫苗注射銀鯽后均無異常反應(yīng)，證明疫苗是安全無毒性的。

2.3血清抗體檢測每組魚血清凝集抗體效價如圖1所示。免疫后不同時間，免疫組銀鯽平均抗體效價始終明顯高于對照組，銀鯽經(jīng)注射免疫后，能產(chǎn)生較高的抗體效價，免疫組每周的抗體效價均顯著高于對照組(P<0.05)，在第6周時抗體效價達到高峰(1∶1 024)，約為對照組的10倍左右，且能維持3周左右，在第24周時抗體效價仍能達到1∶256，約是對照組的8倍左右。

圖1　血清抗體效階Fig.1　Average serum antibody titerNote: Within the same time,different letters indicate significant difference (P<0.05).

圖2　魚的肝臟、脾臟、腎臟和腸道的組織切片照片(×200)Fig.2　Photos of histopathologic slices with from fish liver,spleen,kidney and intestinal tissue(×200)Note: A,B,C and D were photos of histopathologic slices with HE staining from fish liver,spleen,kidney and intestine respectively in experimental group.E,F,G and H were photos of histopathologic slices with HE staining from fish liver,spleen,kidney and intestine respectively in control group.

2.4病理切片分析試驗組與對照組病理切片見圖2。圖2A為免疫組魚肝細胞可見肝細胞呈多角狀，排列均勻有規(guī)則 (箭頭所示)；圖2B為免疫組魚脾臟可見脾實質(zhì)紅髓與白髓相間排列，無明顯的分界，網(wǎng)狀組織中充滿著不同發(fā)育階段的紅細胞、粒細胞、淋巴細胞等(箭頭所示)；圖2C為免疫組魚腎臟，可見其形態(tài)大小正常，皮髓質(zhì)界限清晰，腎竇無分離，腎小管正常(箭頭所示)；圖2D為免疫組魚腸道組織，上皮組織細胞、淋巴細胞、黏膜內(nèi)層、黏膜下層細胞形態(tài)正常(箭頭所示)；圖2E為對照組魚的肝臟，肝細胞包漿疏松且出現(xiàn)明顯氣球樣變性，后期出現(xiàn)大量的肝細胞壞死及淋巴細胞浸潤，紅細胞腫大、破裂、溶解，毛細血管、小血管破損，管壁扁平，內(nèi)皮細胞腫脹，變性，嚴重溶血，可見棕黃色血源性色素沉積(箭頭所示)；圖2F為對照組魚的脾臟，可見脾臟紅髓與白髓難以辨認，小體結(jié)構(gòu)不清，組織細胞大量溶解、壞死、血源性色素沉積最為顯著(箭頭所示)；圖2G為對照組魚的腎臟，可見腎小體壞死，腎小球囊腔變大，腎小管上皮細胞腫脹、變性、壞死、崩解(箭頭所示)；圖2H為對照組魚的腸道，可見腸絨毛壞死、脫落，腸絨毛上皮細胞壞死、脫落，杯狀細胞大量增生(箭頭所示)。說明疫苗對鯽魚產(chǎn)生了保護作用，當(dāng)嗜水氣單胞菌侵入魚體內(nèi)時，魚的免疫系統(tǒng)可識別并消滅病原菌，以免細菌對組織造成損傷。

2.5攻毒保護試驗滅活疫苗對銀鯽的攻毒保護試驗(見表1)顯示，該疫苗能對鯽魚產(chǎn)生很好的保護作用，其免疫保護率達到了100%；未免疫的對照組銀鯽全部死亡，從死魚內(nèi)臟中回收到攻毒株。

表1　免疫后3周的免疫保護力Tab.1　Relative percent survival 3 weeks after immunization

表2　免疫后6個月的免疫保護力Tab.2　Relative percent survival 6 months after immunization

2.6免疫保護期的測定6個月后的免疫保護結(jié)果顯示(見表2)，該疫苗免疫保護率仍高達97%，而未免疫的對照組銀鯽全部死亡，從死魚內(nèi)臟中回收到攻毒株，說明該疫苗對銀鯽的免疫保護期長達6個月以上。

3結(jié)論

本實驗采用甲醛滅活的方法制備嗜水氣單胞菌滅活疫苗，既滅活烈性野生病原菌的感染性，又保留其免疫原性[14]，并用此疫苗來免疫銀鯽，且采用的是毒力因子最多，毒性最強的菌株作為疫苗菌株，所以能對更多種強毒株產(chǎn)生免疫保護作用。血清抗體檢測試驗說明，魚類雖然是較低等的脊椎動物，特異性免疫機制還很不完善，但在嗜水氣單胞菌免疫反應(yīng)中，產(chǎn)生了抗體，特異性免疫發(fā)揮了重要作用。從病理切片可以看出，嗜水氣單胞菌可以侵入魚的肝臟、脾臟、腎臟、腸道等組織，并造成嚴重的損傷，疫苗可以在細菌進入這些組織之前將其殺滅，很好的保護了魚體的安全。從攻毒保護試驗可以看出，該全菌滅活疫苗可以產(chǎn)生很好的保護力。但是，該疫苗也存在很大的局限性，由于嗜水氣單胞菌血清型眾多，不同地區(qū)、不同魚種之間分離的菌株差異顯著，導(dǎo)致至今嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫效果不佳。本研究采用本地分離的嗜水氣單胞菌制備滅活疫苗應(yīng)用于本地養(yǎng)殖場所，取得了較好的保護效果。但所制備的滅活疫苗仍然面臨著應(yīng)用范圍狹窄的問題。解決這一問題還需要進一步從基因方面入手，選擇各菌株間變異系數(shù)較小的致病基因構(gòu)建基因工程疫苗或核酸疫苗，擴大疫苗的應(yīng)用范圍。因此，開發(fā)新型疫苗以針對多種血清型菌株仍是今后防治嗜水氣單胞菌引起疾病的重要方向。

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[收稿2015-04-25修回2015-05-20]

(編輯倪鵬)