沉默NRP-1 基因?qū)θ薚細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株增殖與凋亡的影響①

王紅梅　徐振媛　杜秀平　李滔濤　韓正祥

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，徐州221000)

[摘　要]　目的：探討RNAi沉默NRP-1基因?qū)θ薚細(xì)胞白血病細(xì)胞株增殖與凋亡的影響。方法：將我們前期構(gòu)建好的pLB-NRP-1/shRNA重組慢病毒質(zhì)粒，感染至Jurkat細(xì)胞中，用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況及化療藥物表柔比星(EPI)處理后細(xì)胞增殖情況；用AV/PI法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期。結(jié)果：細(xì)胞增殖結(jié)果：在48、72、96 h時間點NRP-1/shRNA干擾組的OD值均低于相應(yīng)對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞凋亡率結(jié)果：與對照組比較，NRP-1/shRNA干擾組細(xì)胞的凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對化療藥物表柔比星(EPI)敏感性檢測結(jié)果：EPI濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg/ml時， NRP-1/shRNA干擾組的細(xì)胞生長抑制率較相應(yīng)對照組高，差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且選擇IC50進(jìn)行EPI誘導(dǎo)后，NRP-1/shRNA干擾組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；WB結(jié)果顯示：與對照組相比，NRP-1/shRNA干擾組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯下降， Bax的表達(dá)水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞周期結(jié)果：與對照組比較，NRP-1/shRNA干擾組G0/G1期細(xì)胞的比例增高，S期細(xì)胞的比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：RNAi沉默NRP-1基因可抑制Jurkat細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，提高對化療藥物的敏感性，其機制可能涉及Bcl-2/Bax途徑的調(diào)節(jié)；并可將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，降低細(xì)胞的增殖水平，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡期。

[關(guān)鍵詞]　NRP-1；RNA干擾；慢病毒載體；T細(xì)胞白血??；增殖；凋亡；細(xì)胞周期；化療藥物敏感性

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.002

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

沉默NRP-1 基因?qū)θ薚細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株增殖與凋亡的影響①

王紅梅徐振媛杜秀平李滔濤②韓正祥

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，徐州221000)

[摘要]目的：探討RNAi沉默NRP-1基因?qū)θ薚細(xì)胞白血病細(xì)胞株增殖與凋亡的影響。方法：將我們前期構(gòu)建好的pLB-NRP-1/shRNA重組慢病毒質(zhì)粒，感染至Jurkat細(xì)胞中，用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況及化療藥物表柔比星(EPI)處理后細(xì)胞增殖情況；用AV/PI法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期。結(jié)果：細(xì)胞增殖結(jié)果：在48、72、96 h時間點NRP-1/shRNA干擾組的OD值均低于相應(yīng)對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞凋亡率結(jié)果：與對照組比較，NRP-1/shRNA干擾組細(xì)胞的凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對化療藥物表柔比星(EPI)敏感性檢測結(jié)果：EPI濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg/ml時， NRP-1/shRNA干擾組的細(xì)胞生長抑制率較相應(yīng)對照組高，差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且選擇IC50進(jìn)行EPI誘導(dǎo)后，NRP-1/shRNA干擾組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；WB結(jié)果顯示：與對照組相比，NRP-1/shRNA干擾組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯下降， Bax的表達(dá)水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞周期結(jié)果：與對照組比較，NRP-1/shRNA干擾組G0/G1期細(xì)胞的比例增高，S期細(xì)胞的比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：RNAi沉默NRP-1基因可抑制Jurkat細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，提高對化療藥物的敏感性，其機制可能涉及Bcl-2/Bax途徑的調(diào)節(jié)；并可將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，降低細(xì)胞的增殖水平，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡期。

[關(guān)鍵詞]NRP-1；RNA干擾；慢病毒載體；T細(xì)胞白血??；增殖；凋亡；細(xì)胞周期；化療藥物敏感性

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.002

中圖分類號①本文為國家自然科學(xué)基金青年基金(No.30901753)和江蘇省“六大人才高峰”B類資助項目(No.2014-WSW-040)。;②徐州工程兵學(xué)院門診部，徐州221000。

作者簡介：王紅梅(1981年-)，女，講師，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤分子靶向治療及內(nèi)科治療研究，E-mail:wanghongmei8179@126.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：韓正祥(1974年-)，男，博士，教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤分子靶向治療及內(nèi)科治療，E-mail:cnhzxyq@163.com。

[Abstract]Objective:To investigate the effect on proliferation and apoptosis of T-cell leukemia cells by silencing NRP-1(Jurkat cells). Methods: The lentivirus plasmid which expresses NRP1 gene specific shRNA was constructed in our preliminary experimental.We transfected the lentivirus plasmid to human T-cell Lymphoma cells.The proliferation of Jurkat cells different groups and effect on cell proliferation after chemotherapy drug EPI-treated were found by CCK-8 kit.The proliferation level and apoptosis rate of the cells were detected by flow cytometry and Annexin-V-FITC/PI method. Results: The proliferation level of NRP -1 /shRNA interference group was decreased significantly in 48 h,72 h,96 h,which was compared with the control groups.The apoptosis rate of the NRP-1/shRNA interference group was increased compared with control groups.The chemotherapy drug sensitivity of epirubicin(EPI) test results showed that EPI concentration was 0.025,0.05,0.1,0.2,0.4 μg/ml,the NRP-1/shRNA interference group of cell growth inhibition rate was increased,the corresponding control group difference had statistical significance(P<0.05).We choose the drug concentration of the EPI IC50 for next experiments.NRP-1/shRNA interference group cell apoptosis rate increased significantly after induction,compared with the control groups difference was statistically significant(P<0.05).Compared with control group，the expression level of Bcl-2 protein was decreased and the expression level of bax protein was increased significantly after EPI induction.The percentage of cells at G0/G1 phase increased significantly，while those at S phase decreased significantly .Conclusion: Plasmid shRNA-NRP1 inhibited the expression of NRP1 in Jurkat cells and decreased the proliferation level of Jurkat cells and promote their apoptosis and enhance their drug sensitivity;the molecular mechanism may relate to down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of Bax.and arrested the cell cycle at G0/G1 phase.

Effects on proliferation and apoptosis of T-cell leukemia cells by silencing NRP-1

WANGHong-Mei,XUZhen-Yuan,DUXiu-Ping,LITao-Tao,HANZheng-Xiang.DepartmentofOncology,AffiliatedHospitalXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China

[Key words]Neuropilin1(NRP1)；RNA interference；Lentivirus；T-cell leukemia；Cell proliferation；Cell apoptosis

神經(jīng)纖毛蛋白(Neuropilins，NRPs)為跨膜糖蛋白，不僅是semaphorins 的主要受體；還是血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的非酪氨酸激酶受體[1]。NRPs家族有兩個成員，分別是NRP1 和NRP2。NRP-1在脊椎動物胚胎的神經(jīng)和心血管系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，NRP-1在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，以獨立或者依賴VEGFR-2的方式調(diào)節(jié)腫瘤血管的形成及腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移，促進(jìn)多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并且與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[2]。已有研究表明NRP-1在白血病細(xì)胞中有表達(dá)，急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)中NRP-1的表達(dá)較急性髓性白血病(Acute myloid leukemia，AML)中表達(dá)更多見，NRP-1的表達(dá)水平或可指示白血病的嚴(yán)重程度和進(jìn)展[3-6]。而NRP-1作為新的VEGF受體在T細(xì)胞白血病中的表達(dá)及作用研究較少。我們前期實驗成功構(gòu)建了NRP-1/shRNA慢病毒表達(dá)載體，體外感染人T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株后顯著抑制靶基因NRP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。本研究檢測NRP-1/shRNA慢病毒表達(dá)載體對Jurkat細(xì)胞增殖、凋亡、化療藥物敏感性及細(xì)胞周期的影響?，F(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料本研究中pLB-NRP-1/shRNA慢病毒表達(dá)載體系我們課題組前期實驗構(gòu)建成功并經(jīng)過驗證，通過WB及RT-PCR篩選出對靶基因-NRP-1沉默效率最高的慢病毒表達(dá)載體；Jurkat細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫；Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒以及細(xì)胞周期測定試劑盒購于南京凱基生物公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所；RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；表柔比星(EPI)由美國輝瑞制藥有限公司提供；抗兔bcl-2、bax多克隆抗體購于英國Abcam公司；抗β-actin鼠單克隆抗體以及堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG、BCIP/NBT試劑均購于北京中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人T細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)(在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng))，每2~3 d傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實驗分組實驗分三組：空白對照組：未做特殊處理的Jurkat細(xì)胞組；陰性對照組：感染非特異性shRNA慢病毒載體的Jurkat細(xì)胞組；實驗組(NRP-1/shRNA干擾組)：感染了NRP-1/shRNA慢病毒載體(系前期實驗篩選出NRP-1/shRNA1對NRP-1沉默效率最高)的Jurkat細(xì)胞組；每組均設(shè)3個復(fù)孔。取對數(shù)生長期Jurkat細(xì)胞，按照感染復(fù)數(shù)(MOI)為20加入濃縮的慢病毒顆粒(各設(shè)3個復(fù)孔)，并加入聚凝胺至終濃度為8 μg/ml，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于病毒感染24、48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，感染后的陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀分選GFP陽性細(xì)胞，分選后重新擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定抑制NRP-1基因表達(dá)的Jurkat細(xì)胞模型。

1.2.3CCK-8法檢測RNAi沉默NRP-1基因?qū)?xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104ml-1，接種于96孔板中(每孔100 μl)，每組設(shè)3個復(fù)孔，按前述方法常規(guī)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24、48、72、96 h加入CCK-8試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，于酶標(biāo)儀波長450nm測OD值。

1.2.4RNAi沉默NRP-1基因?qū)熕幬顴PI敏感性的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞密度為2.5×105ml-1的各組細(xì)胞，接種于96孔板(每孔100 μl)，按前述方法常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，加入含有2.5、5、10、20、40、80 μg/ml表柔比星EPI的無血清RPMI1640培養(yǎng)基各1 μl，使其終濃度為以此為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/ml，每組每一濃度平行設(shè)3個復(fù)孔。加藥后置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于酶標(biāo)儀波長450nm測OD值。細(xì)胞生長抑制率=[(1-干擾組0D值)/對照組OD值]×100%。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測RNAi沉默NRP-1基因?qū)?xì)胞凋亡的影響(Annexin V-FITC/PI標(biāo)記)取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104ml-1，接種于六孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，1 000 r/min離心收集細(xì)胞，用PBS溶液洗滌細(xì)胞兩次后棄上清，用500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，先加入5 μl Annexin V-FITC充分混勻，再加入 5 μl PI充分混勻，在室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞密度為2×105ml-1的各組細(xì)胞，接種于六孔板，常規(guī)中培養(yǎng)24 h，加入用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的表柔比星溶液，使其終濃度為0.23 μg/ml，每組均設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用Annexin V-FITC/PI測定細(xì)胞凋亡率，方法同上。

1.2.6Western blot檢測 EPI處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期的細(xì)胞,將細(xì)胞密度為2×105ml-1的各組細(xì)胞,接種于六孔培養(yǎng)板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用PBS溶液洗滌后加入用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的表柔比星溶液，使其終濃度為0.23 μg/ml，每組均設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞提取總蛋白。將等量蛋白樣品點于SDS-聚丙烯酰胺凝膠小孔進(jìn)行電泳。電泳后半干轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的NC膜用洗滌后，將NC膜浸入封閉液進(jìn)行封閉，然后根據(jù)預(yù)染Marker所指示大小，將內(nèi)參條帶與目的條帶剪開，分別加入一抗(1∶1 000抗兔bcl-2多克隆抗體；1∶1 000抗兔bax多克隆抗體；1∶5 000抗β-actin鼠單克隆抗體),4℃過夜，取出NC膜洗滌后，加入羊抗兔及羊抗鼠二抗(1∶2 000)孵育，將NC膜置于BCIP/NBT試劑中反應(yīng)約1 min，置于Image Quant 4000 mini顯像儀中顯像，結(jié)果用bcl-2、bax與內(nèi)參吸光度比值表示各樣本中目的蛋白的相對含量。

1.2.7流式細(xì)胞儀RNAi沉默NRP-1基因?qū)?xì)胞周期的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞密度為2×105ml-1的各組細(xì)胞，接種于六孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后離心收集細(xì)胞，并用PBS溶液洗滌一次，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106ml-1，用預(yù)冷的70%乙醇固定，置于4℃冰箱過夜，用PBS洗去固定液，加入100 μl RNase A 37℃水浴30 min，再加入400 μl PI充分混勻，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖檢測CCK-8法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示：Jurkat細(xì)胞NRP-1/shRNA干擾組于48、72、96 h測得的OD值分別為0.242±0.033、0.415±0.028、0.806±0.064，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明干擾NRP-1基因能抑制Jurkat細(xì)胞的增殖(表1、圖1)。

2.2細(xì)胞凋亡率的檢測Annexin V-FITC/PI結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，結(jié)果顯示：空白對照組、陰性對照組、NRP-1/shRNA干擾組的細(xì)胞凋亡率分別為(4.5±0.2)%、(4.1±0.4)%、(34.1±1.9)%，與對照組比較，NRP-1/shRNA干擾組的凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2、圖2)。

2.3化療藥物敏感性的檢測CCK-8法檢測干擾沉默NRP-1基因?qū)熕幬锩舾行缘挠绊?，結(jié)果顯示：選取化療藥物表柔比星(EPI)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示在0.01～10 μg/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著EPI藥物濃度的升高，其對細(xì)胞生長抑制作用逐漸增強，其中在0.025～1 μg/ml的范圍內(nèi)最明顯。對照組細(xì)胞在EPI濃度為0.2 μg/ml時，細(xì)胞生長抑制率為(48.83±1.46)%，IC50約為0.23 μg/ml；而NRP-1/shRNA干擾組在EPI濃度為0.1 μg/ml時細(xì)胞生長抑制率達(dá)(44.27±1.25)%，IC50約為0.15 μg/ml，比對照組的IC50低；EPI濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg/ml時，與對照組比較，NRP-1/shRNA干擾組的細(xì)胞生長抑制率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3、圖3)。

圖1　各組細(xì)胞增殖水平Fig.1　Cell proliferation levels of different groups

表2　各組細(xì)胞的凋亡率(%,±s，n=3)Tab.2　Cell apoptosis levels of different groups(%,±s，n=3)

表2　各組細(xì)胞的凋亡率(%,±s，n=3)Tab.2　Cell apoptosis levels of different groups(%,±s，n=3)

BlankcontrolgroupNegativecontrolgroupNRP-1/shRNAgroupApoptosisrate(%)4.5±0.24.1±0.434.1±1.91)

Note：1)P<0.05 vs negative control group.

表1　CCK-8法檢測干擾NRP-1基因?qū)urkat細(xì)胞增殖的影響(±s，n=3)Tab.1　Inhibitory effect of NRP-1/shRNA on proliferation of Jurkat cells by CCK-8(±s，n=3)

表1　CCK-8法檢測干擾NRP-1基因?qū)urkat細(xì)胞增殖的影響(±s，n=3)Tab.1　Inhibitory effect of NRP-1/shRNA on proliferation of Jurkat cells by CCK-8(±s，n=3)

Groups24h(OD)48h(OD)72h(OD)96h(OD)Blankcontrolgroup0.217±0.0130.444±0.0060.732±0.0211.607±0.137Negativecontrolgroup0.197±0.0490.478±0.0190.800±0.0541.634±0.140NRP-1/shRNAgroup0.122±0.0080.242±0.0331)0.415±0.0281)0.806±0.0641)

Note：1)P<0.05，vs negative control group.

圖2　流式細(xì)胞儀檢測各組Jurkat細(xì)胞的凋亡率Fig.2　Cell apoptosis levels of different groups by FCMNote: A.Blank control group；B.Negative control group;C.NRP-1/shRNA group.

2.4EPI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率檢測根據(jù)2.3實驗結(jié)果，Jurkat細(xì)胞EPI IC50約為0.23 μg/ml，故本實驗EPI濃度選擇0.23 μg/ml。采用Annexin V-FITC/PI結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，結(jié)果顯示：對照組、NRP-1/shRNA干擾組的細(xì)胞凋亡率分別為(17.9±2.46)%、(47.4±2.16)%，與對照組比較，NRP-1/shRNA干擾組的凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表4、圖4)。

2.5EPI處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平的變化WB結(jié)果顯示：與對照組相比，NRP-1/shRNA干擾組抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)水平下降，為對照組1/3；與對照組相比，NRP-1/shRNA干擾組促凋亡基因Bax的表達(dá)水平升高，升高約2倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；提示NRP-1基因干擾后增加細(xì)胞對表柔比星敏感性的機制可能涉及Bcl-2/Bax途徑的調(diào)節(jié)(表5、圖5)。

表3　不同濃度的EPI處理后對各組Jurkat細(xì)胞增殖的影響(±s，n=3)Tab.3　Effect on cell proliferation of different groups after chemotherapy drug EPI-treated(±s，n=3)

表3　不同濃度的EPI處理后對各組Jurkat細(xì)胞增殖的影響(±s，n=3)Tab.3　Effect on cell proliferation of different groups after chemotherapy drug EPI-treated(±s，n=3)

EPIconcentration(μg/ml)0.0250.050.10.20.40.8Negativecontrolgroup1.37±0.196.78±0.2720.13±1.4648.83±1.4672.19±3.0291.36±4.45NRP-1/shRNAgroup7.50±0.571)21.57±1.451)44.27±1.251)69.66±2.271)87.22±1.761)96.06±1.70

Note：1)P<0.05 vs negative control group.

圖3　EPI處理后各組Jurkat細(xì)胞生長抑制曲線Fig.3　Growth-inhibitory curves of different groups after chemotherapy drug EPI-treated

表4　EPI處理后Jurkat細(xì)胞的凋亡率(%，±s，n=3)Tab.4　Apoptosis rate of Jurkat cells of different groups after chemotherapy drug EPI-treated(%，±s，n=3)

表4　EPI處理后Jurkat細(xì)胞的凋亡率(%，±s，n=3)Tab.4　Apoptosis rate of Jurkat cells of different groups after chemotherapy drug EPI-treated(%，±s，n=3)

NegativecontrolgroupNRP-1/shRNAgroupApoptosisrate(%)17.9±2.4647.4±2.161)

Note：1)P<0.05 vs.negative control group.

圖4　流式細(xì)胞儀檢測EPI處理后Jurkat細(xì)胞的凋亡率Fig.4　Apoptosis rate of Jurkat cells of different groups after EPI-treated by FCMNote: A.Negative control group after EPI-treated;B.NRP-1/shRNA group after EPI-treated.

表5　EPI處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)(±s，n=3)Tab.5　Protein expression of apoptotic related genes protein after EPI-treated(±s，n=3)

表5　EPI處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)(±s，n=3)Tab.5　Protein expression of apoptotic related genes protein after EPI-treated(±s，n=3)

BlankcontrolgroupNegativecontrolgroupNRP-1/shRNAgroupBcl-21.000±0.0560.946±0.0910.324±0.0821)Bax1.000±0.0681.031±0.0712.032±0.2371)

Note：1)P<0.05 vs.negative control group.

圖5　EPI處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況Fig.5　Protein expression of apoptotic related genes protein after EPI-treated

表6　干擾NRP-1基因?qū)urkat細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.6　Effects on Jurkat cells of cell cycle(%，±s，n=3)

表6　干擾NRP-1基因?qū)urkat細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.6　Effects on Jurkat cells of cell cycle(%，±s，n=3)

GroupsG0/G1cycle(%)Scycle(%)G2/Mcycle(%)Negativecontrolgroup51.19±5.6241.01±1.018.00±0.77NRP-1/shRNAgroup61.70±2.021)30.91±0.911)8.00±0.55

Note：1)P<0.05 vs.negative control group.

圖6　干擾NRP-1基因?qū)urkat細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響Fig.6　Effects on Jurkat cells of cell cycleNote: A.Negative control group;B.NRP-1/shRNA group.

2.6細(xì)胞周期的檢測采用檢測細(xì)胞DNA含量的方法檢測細(xì)胞周期，結(jié)果如下：與對照組比較，NRP-1/shRNA干擾組G0/G1期細(xì)胞的比例增高，S期細(xì)胞的比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明干擾NRP-1基因能將細(xì)胞進(jìn)程阻滯在G0/G1期(表6、圖6)。

3討論

NRP1基因表達(dá)廣泛，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，與VEGF-A、B、E 及胎盤生長因子相互作用[7，8]，不僅可以增強VEGF 與VEGFR-2 結(jié)合引起的生物活性，而且可以單獨表達(dá)在內(nèi)皮、腫瘤、基質(zhì)細(xì)胞上，獨立介導(dǎo)促血管生成作用以及抗凋亡作用[9，10]。Russo等[11]報道某些不表達(dá)VEGFR，而表達(dá)NRP1 的腫瘤細(xì)胞中，NRP1 也可與VECF 結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤血管新生及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

細(xì)胞的增殖和凋亡異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，本實驗研究結(jié)果顯示RNAi 沉默NRP-1 基因不僅能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，更可以抑制細(xì)胞增殖。Li 等[12]應(yīng)用RNAi 沉默NRP-1 基因能顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。Bachelder等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1 在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表達(dá)，而在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌中無表達(dá)；而轉(zhuǎn)染了NRP-1基因的非轉(zhuǎn)移性MDA-MB-453 乳腺癌細(xì)胞的缺氧性凋亡明顯減少，提示NRP-1對促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長、抑制其凋亡有特殊作用。 Meyerson等[5]發(fā)現(xiàn)VEGF165能夠誘導(dǎo)髓細(xì)胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1，MCL-1)mRNA的表達(dá)，是通過NRP-1與c-MET的結(jié)合實現(xiàn)在VEGF165上調(diào)MCL-1 表達(dá)。此外NRP-1能夠強化人膠質(zhì)瘤、胰腺癌中c-MET 活化[14，15]；而這種VEGF165-NRP-1-c-MET信號傳導(dǎo)在前列腺癌的MCL-1 上調(diào)中也發(fā)揮重要作用[16]。Lu等[4]報道顯示應(yīng)用siRNA沉默NRP-1能顯著降低AML細(xì)胞的增殖和遷移能力。這些研究結(jié)果提示NRP-1通過介導(dǎo)不同生長因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮復(fù)雜多樣的作用。而NRP-1 在外周NK/T細(xì)胞淋巴瘤(Peripheral NK/T-cell lymphoma,PTCL)發(fā)生和發(fā)展中的作用機制尚待深究。

本研究前期實驗，構(gòu)建靶向NRP-1基因的干擾質(zhì)粒，以慢病毒為載體，將NRP-1/shRNA整合到Jurkat 細(xì)胞中，沉默NRP-1基因，下調(diào)NRP-1 蛋白表達(dá)。而本實驗結(jié)果顯示，RNAi沉默NRP-1基因可抑制Jurkat細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，提高化療藥物敏感性；并可將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，能增強EPI的抗腫瘤作用，其機制可能涉及Bcl-2/Bax途徑的調(diào)節(jié)。為后續(xù)研究NRP-1在PTCL發(fā)生發(fā)展中的作用提供有效的實驗?zāi)Ｐ停矠閷ふ襊TCL有效治療靶點方面提供新思路。NRP-1可能成為淋巴瘤分子治療的靶點。

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[收稿2015-05-07修回2015-06-15]

(編輯張曉舟)