遼寧省某種豬場(chǎng)氟烷基因的檢測(cè)

趙世偉 張守純

生活水平的提高，導(dǎo)致消費(fèi)者對(duì)優(yōu)質(zhì)豬肉的要求越來(lái)越高，豬肉品質(zhì)主要受到遺傳與環(huán)境效應(yīng)綜合作用的影響。目前，豬肉品質(zhì)已經(jīng)成為豬種選育的重要指標(biāo)。氟烷基因（Halothane，Hal）是導(dǎo)致豬應(yīng)激綜合癥的一個(gè)主效基因，而豬應(yīng)激綜合癥直接導(dǎo)致PSE肉或DFD肉的產(chǎn)生。為此，國(guó)內(nèi)外的研究人員對(duì)氟烷基因作了細(xì)致、深入研究，以降低或消除豬應(yīng)激綜合癥導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)的損失，從而提高經(jīng)濟(jì)效益，為消費(fèi)者提供更多的優(yōu)質(zhì)豬肉。

研究人員通過(guò)對(duì)氟烷基因cDNA序列的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)該基因的1843位點(diǎn)的堿基發(fā)生了突變（“C”→“T”），而該堿基的突變導(dǎo)致該位點(diǎn)密碼子編碼的氨基酸由精氨酸變成了半胱氨酸，使得Ca2+釋放通道的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，功能也出現(xiàn)了異常。當(dāng)豬受到應(yīng)激時(shí)，Ca2+會(huì)大量的釋放，引起肌肉持續(xù)收縮產(chǎn)生應(yīng)激綜合征。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)堿基的突變使得該基因的限制性酶切識(shí)別位點(diǎn)由HalN（-5GCG↓C 3-）變?yōu)镠aln（-5 GTGCT↓G 3-）。

用HhaⅠ酶對(duì)該位點(diǎn)酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后能觀(guān)察到3種帶型，分別為基因型HalNHalN的顯性純合子帶型、基因型HalNHaln的雜合子帶型以及基因型HalnHaln的隱性純合子帶型，其中基因型為HalnHaln的豬為應(yīng)激敏感豬。在種豬場(chǎng)氟烷基因的檢測(cè)中，采用PCR-RFLP技術(shù)，既廉價(jià)又能準(zhǔn)確的檢測(cè)出Haln的存在，準(zhǔn)確率可達(dá)100%，檢測(cè)樣本只需采集種豬的少量血液和肌肉組織等。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

PCR基因擴(kuò)增儀（杭州博日

科技有限公司），電泳槽DYCZ

-25D、電泳儀DYY-10C（北京

六一儀器公司），2×PCR Mast

erMix（康為世紀(jì)生物科技有限

公司），HhaⅠ酶、氟烷基因引

物序列（上海生工生物工程有限

公司）：F（5-TCCAGTTT

GCCACAGGCCA-3）、R（

5-ATTCACCGGATGG

AGTCTCTGAG-3）。

1.2 材料

遼寧省某種豬場(chǎng)312頭種豬的耳組織（綠豆粒大?。?。

1.3 方法

本試驗(yàn)使用經(jīng)典的酚—氯仿法提取312頭種豬耳組織的總基因組DNA，提取完成的總基因組DNA充分溶解于滅菌去離子水中后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 Hal基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20微升）10微升 2×PCR MasterMix，2微升豬耳組織的總基因組DNA，上游引物和下游引物各1微升，6微升超純?nèi)ルx子滅菌水。Hal基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，30次循環(huán)（94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，45秒），最后72℃10分鐘。Hal基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。

1.3.2 酶切反應(yīng)體系 （15微升）HhaⅠ酶1微升，10×Buffer 1.5微升，Hal基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10微升，滅菌去離子水2.5微升。在37℃水浴中孵育4小時(shí)后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

豬基因組總DNA1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)提取的基因組總DNA純度較高，且濃度較大（見(jiàn)圖1）。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的Hal基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小約為659bp（見(jiàn)圖2），與目的條帶一致，而且無(wú)非特異性條帶的出現(xiàn)。

Hal基因酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果存在3種帶型（見(jiàn)圖3），即基因型為HalNHalN的顯性純合子帶型（2條帶：493bp、166bp）、基因型為HalNHaln的雜合子帶型（3條帶：659bp、493bp和166bp）以及基因型為HalnHaln的隱性純合子帶型（1條帶：659bp）。本試驗(yàn)檢測(cè)的312頭種豬中基因型為HalnHaln的隱性純合子3頭，基因型為HalNHaln的雜合子34頭，其余均為HalNHalN的顯性純合子。含有Haln基因的種豬頭數(shù)占檢測(cè)豬群的11.9%，Haln基因頻率為6.4%。

3 討論與結(jié)論

在養(yǎng)殖過(guò)程中，基因型為HalNHalN的顯性純合子不表現(xiàn)應(yīng)激綜合征，基因型為HalnHaln的隱性純合子表現(xiàn)出應(yīng)激綜合征，而基因型為HalNHaln的雜合子，則部分表現(xiàn)為應(yīng)激綜合征。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中簡(jiǎn)單的通過(guò)應(yīng)激綜合征的表現(xiàn)來(lái)決定種豬的選留并不能從根本上淘汰Haln基因，而本試驗(yàn)采用的檢測(cè)技術(shù)能從分子水平準(zhǔn)確的判斷種豬的選留，保障養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

由于本豬場(chǎng)的種豬大部分為引進(jìn)豬種，說(shuō)明在引種的過(guò)程中引入Haln基因，該基因在后續(xù)的擴(kuò)繁中將會(huì)直接影響該種豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，需要及時(shí)淘汰攜帶Haln基因的種豬。并建立完善的種豬繁育體系，生產(chǎn)高品質(zhì)、高性能的商品豬，為消費(fèi)者提供更優(yōu)質(zhì)的豬肉。